Đang tải... (xem toàn văn)
Với sự tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân từ, hiện nay các nhà khoa học có thể xẩc định chính xác vị trí đột biến gen yểu tố víu.. (F8) gây bệnh hemophilia A tăng hiệu quả trong việ[r]
(1)(giáo dục nha khoa, súc miệng dung dịch Fluor, khám răng, trám bít hố rãnh) phù hợp với học sinh TH C S Tuy nhiên, nội dung chưa đáp ứng yêu cầu ca số lượng chất lượng thiếu sở vật chất nhân lực.
Triền khai chăm sóc miệng, giáo dục cách phịng chống, xử trí bệnh miệng theo khối !ớp, giáo dục học sinh có học lực trung bình, kém, đào tạo cho giáo viên cha/m ẹ học sinh chương trình nha học đường cần thiết Tồ chức buồl sinh hoạt ngoại khỏa cho học sinh chăm sóc RM, và thực khám bệnh S R , V L định kỳ lần/năm cho học sinh Gia đinh nhà trường chung tay hành động C S R M cho học sính.
TÀ I LIỆU T H A M K HẢ O
1 Nguyễn Mạnh Hà (2010), Sâu biến chứng.Nha xuất Giáo dục trè-22.
2 Bệnh viện Răng hàm mặt Thành phố Hồ Chí Minh (2005), "Báo cáo hoạt động chương trình Nha học đường năm 2005".
3 Khoa RHM Bệnh viện Nhi Đồng li Thành phố Hồ Chỉ Minh, Cách khám cho cộng đồng, Bài giảng chăm sóc sức khoẻ miệng.
4 Nguyễn Anh Sơn (2010), Thực irạng bệnh sâu răng, viêm lợi mộỉ số yểu tố liên quan học sinh khối lớp trường trung học sờ thị trấn Hương Canh, huyện Bình Xuyên, tỉnh Vĩnh Phúc, Luận văn thạc sỹ y tế công cộng, Trường đại học Y tế cong cộng, Hà Nội.
5 Trần Văn Trường (2000), "Báo cáo công tác nha học đường", tr 1.
6 Trần Văn Trường, Lâm Ngọc Ắn Trịnh Đinh Hải (2001), Điều tra sức khỏe miệng toàn quốc, NXB Y học Hà Nội.
7 J.p and S.G Damle Bhavsar (1995), Dental caries and oral hygiene amongst 12-14 years old handicapped children of Bombay, India J Indian Soc Pedod Prev Dent, 1 - ,
8 Poul Erik Petersen cộng (2004), "Effect of a school-based oral health education programme in Wuhan city, Peoples Republic of China", international Dental Journal 54, tr 33-41.
9 Ronald Patrick cộng (2006), "Reducing Oral Health Disparities: A focus on Social and Cultural Determinants", BMC Oral Health Sumptement (S4).
10 W HO (1997), Oral health surey basic method 4th Editison, Geneva, pp.25-28.
T hS : Bùi T h ị M inh Phư ợ ng Giảng viên m ơn Hóa Sinh - Trường Đ ại h ọ c Y D ợ c Thái Bình H ng d ẫn k h o a học: G S T S T T hàn h V ăn Trưởng m ỗn Hóa s in h - T rường đ i học Y Hà N ội
T Ó M TẮ T
Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính, gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X Người mẹ mang gen bệnh cố khả truyền bệnh cho 50% trai họ, chủ yếu bệnh nhân nam Với tiến của kỹ thuật sinh học phân từ, nhà khoa học xẩc định xác vị trí đột biến gen yểu tố víu
(F8) gây bệnh hemophilia A tăng hiệu việc phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chắt lượng chăm sóc súc khỏe cộng đồng.
Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu 60 bệnh nhân chẩn đoán hemophilia A. Mục tiêu: Xác định số đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A.
Kểt quả: Kết cho thấy phát 90% (54/60) bệnh nhân hemophilia A có đột biến gen F8 bao gồm: đảo đoạn intron 22 35,2%, đột biến sai nghĩa 20,4%, đột biến nucleotid 11,1 %, đột biến vô nghĩa là 11,1%, đột biến thêm nucleotid 11,1%, đột biển vị trí nối exon-intron 5,55%, đột biến đoạn lớn 5,55%.
Kết luận: Đây kỹ thuật hữu ích giúp ích cho việc phát sớm cốc gen gây đột biến có hướng tư vấn chẩn đốn trướcAmng trình mang thai.
Từ khóa: Hemophilia A, gen F8. S U M M A R Y _
DETECTION OF DISEASE- CAUSING GENE MUTATIONS IN HEMOPHILIA A BY PCR
Hemophilia A is a recessive sex-linked disease, the gene caused the disease locates in X chromosome An affected mother can deliver the disease to 50% o f her sons, thus most o f the patients are male With the advance o f molecular biotechnology, scientists can correctly determine the location o f mutation o f Factor VIII (F8) gene causing Hemophilia A to increase the effect o f disease control and improve community health services.
Subjects and methods: study subjects were 60 patients diagnosed with hemophilia A.
Objective: The objective o f the study was to detect some F8 gene mutations causing hemophilia A.
(2)mutation, 5.55% o f patients with exon-intron connecting mutation and 5.55% o f patients with large section deletion mutation.
Conclusion: This is a useful technique for early detection o f genes causing mutations to give counseling and diagnostic before and during pregnancy.
Keyw ords: Hemophilia A, F8 gene.
Đ Ặ T V Ấ N Đ Ề
Hemophilia A bệnh rối ioạn đông máu, bệnh gây nên thiếu hụt hay bát thường chức củã yếu tố V III Đ â y ià bẹnh di truyền gen iặn íiên kết với nhiễm sac thể giới tính X Việt N am nước cỏ tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A cộng đồng cao Theo nghiên cứu cua Đ ỗ Trung Phấn năm 1996 tỳ lệ mắc bệnh hemophilia A khoảng - 60/1.000.000 người Hiện Việt Nam có khoảng 6000 bệnh nhân hemophilia Ả có 30% phát hiện điều trị, phương pháp điều trị chủ yếu íả sử đụng yếu tố V lỉí máu toàn phần (truyền trực tiếp hoặc tách chiết) tốn mà hiệu qua không cao, đặc biệt có nguy cao bệnh lây truyền qua đường máu Trên thể giới, nha khoa học phân tích gen bệnh nhân hemophilia A nhiều dạng đột biến gen yếu tố VIII (F8) công bố C ác nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác sẽ gây kiểu hình đặc trừng khác Bệnh nhân hemophilia A thề nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-5Ò%),bệnh nhân hemophilia A thề nhẹ trung bình chủ yeu ià đột biến điểm (chiếm 90-95% ) v ĩệ t Nam, cơng trình nghiên cứu bệnh hemophilia A chủ yểu nghiên cứu yề đặc điềm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ iệ mắc bệnh đánh giá hiệu điều trị bệnh các chế phẩm thay thế.T Với tiến kỹ thuật sinh học phân tử, nhà khoa học phân tích D N A người bệnh để xác định xác tổn thương gen gây bệnh hemophilia A, kiểm soát bệnh tốt nhờ phát người phụ nữ mang gen bệnh tư vấn di truyền trưởc hôn nhân, tăng hiệu việc phịng ngừa bệnh tật đơng thời nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Mục tiêu đề tài:
1 Xác định m ộỉ sổ đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia Á.
2 Mối liên quan thể bệnh với số đột biến gây bệnh hemophilia A Việt Nam.
Đ Ố I T Ư Ợ N G V À P H Ư Ơ N G P H Á P 1 ĐỐI tứ ợ n g nghiên cứu
Nhỏm đối chứng: gòm người (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đình khơng có ngườỉ mắc bệnh di truyền Nhóm chứng dùng để chuẩn hóa kỹ thuật làm mẫu đối chứng cung với mẫu nghiên cứu để thực kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen.
Nhóm nghiên cứu: bệnh nhân chẩn đoán xác ổịnh hemophillia A Viện Nhi Trung ương Viện Huyểt học Truyền máu Trung ương.
Tiêu chuẩn lựa chọn: * Lâm sàng:
+ Chảy máu: Chảy máu khó cầm sau chấn thương,
sau va chạm hay chảy máu cách íự nhiên.
+ Vị trí: Chảy máu khớp, sổ vị trí khác.
+ Tính chất; Thường chảy máu tái phát.
+ Tiền sừ: Có tiền sử chấy máu kéo dài gia đinh có người thân bị chày máu khó cầm.
* Cận lâm sàng:
+ Định lượng yếu tố FV1II giảm 30% - Thể nặng: Hoạt tính yếu tố FVIII < 1%. - Thể trung bình: Hoạt tính yếu tố F V II1 1-5%. - Th ể nhẹ: Hoạt tính yếu tố FVIII 5-30% + A P T T kéo dài.
+ Thời gian máu chảy binh thường.
+ Số lượng tiểu cầu độ tập trung tiểu cầu binh thường.
2 Tran g th iế t bị, dụng cụ nghiên cứu hóa chất
3 P hư n g p háp v kỹ th u ậ t nghiên cứu
Đối với bệnh nhân thể nặng: xác định tượng đảo đoạn intron 22 phừơng pháp Inversion PCR (l-PCR ) Khơng có đột biến đảo đoạn iníron 22, xác định đao ổoạn intron phương pháp Multiplex PCR Nếu khơng xác định ta khuyếch đại toàn exon để tim đột biển exon Nếu khơng có đột biến, phân tích đột biến điềm phương pháp giải trình tự gen.
Đoi với bệnh nhân thể vừa nhẹ sử dụng phương pháp P C R để xác định đột biến exon, khơng đột biến giải trinh tự gen trực tiếp để phát hiện dạng đột bien điểm.
3.1 QŨy trình lẩ y mẫu
Bệnh nhân chẩn đoán hemophilia A iấy 5ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông EDTA với hàm lượng 1,5mg/mL Q uy trinh lấy máu đảm bảo vơ írùng tuyệt đối.
3.2 Quy trình tách c h iế t DNA từ m áu n goại v i 3.3 Xác đ ịnh đ ộ t biến gen F8
3.3.1 Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật l - P C R '
k ỹ thuật l-PC R gồm bước: (1) c ắ t DNA enzyme Bell, (2) NỐI T ligate, (3) Khuyếch đại bằng phản ưng multiplex PCR Phương pháp I-PCR có ưu điểm dễ tiến hành Enzym e Bell tác dụng đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym e có tính đạc hiệu cao San phẩm P C R khuyếch đại dễ dàng thời gian khoảng phút đoạn DNA có kích thước ngắn (487 559pb) Như xét nghiệm phân tích gen tiến hành nhanh chóng, kết ỉhụ được có độ tín cậy cao, dễ thực hiện.
3.3.2 Phát đột biến đảo đoạn intron kỹ ỉhuật multiplex PCR
(3)cho Ĩnt1h1 cộng với mồi đặc hiệu cho chuỗi Ỉn1h2, phản ứng chứa cặp mồi đặc hiệu int1h2 cộng với một mồi đặc hiệu cho intl h D ựa vào kích thước khác nhau đoạn D N A sau điện di để phát đột biến.
3.3.3 Phất đột biến exon kỹ thuật PCR
Phản ứng P C R sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại exon gen F8, sau điện di gel agarose, mẫu bệnh nhân đưực tiến hành song sọng với mẫu đối chứng Nếu m âu đối chứng xuất hiện vạch DNA tương ứng với kích thước exon được khuếch đại, ĩrong mẫu bệnh nhân không xuấỉ hiện vạch thỉ bệnh nhân bị đột biến m ất đoạn exort đó.
3.3.4 Phát đột biến điểm kỹ thuật giải trình tự gen
Được thực theo qui trình sử dụng phương phốp BigDye terminator sequencing (Applied Bỉosysíems, Foster city USA ) V iệc phân tích kểt dựa vào so sánh trình tự geri cua bệnh nhan với trình tự gen chuẩn Gen Bank(nạtỉona! center for biotechnology information, NCBI) phần mềm CLC So sánh trinh tự acid amin bệnh nhân với trinh tự chuẩn chùa G enbank phần mềm Biast NCBI.
K É T Q U Ả
1 Đ ặ c đ iểm c h un g v ề đ ố i tư ợ n g nghiên cứu 4 /6 bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng thể nặng chiếm tỷ lệ 75% , 10/60 bệnh nhân thể írung bình chiếm tỷ lệ 16,67% , 5/60 bệnh nhân thể nhẹ chĩếm tỷ lệ 8,33%
2 T ỷ iệ p h t đ ợ c đ ộ t biến
2.1 Ty iệ bệnh nhân theó k ế t p h t đột biến
Nghiên cứu phái /6 trường hợp bệnh nhân có đột biến gen F gây bệnh hemophilia A chiếm tỷ iệ 90% Số bệnh nhân chưá phát là 6/6 chiếm tỷ lệ 10%.
2.2 Tỳ lệ đ ộ t biến theo thề bệnh nhóm p h t hiên nhóm khơng p h t ' _
H P h ố i đ ợ c ta C h u a p h àt đ irợ c 100.00%
90.0054 80.00% 70.00% 60.0054 SO.OOSé 40.00% -30.0054 20.0 % 10.00« 0.00% -1
T ru n g b ìn h Nhẹ
- Thể nhẹ: /5 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ lệ 80% , 1/5 bệnh nhân chưa phát đột biến chiếm 20%
3 K ế t p h ỉ h iện c ác d n g đ ộ t biến gen F8 3.1 K ế t xác đ ịnh đ ộ t biến đảo đoạn
3.1.1 Kết xấc định đột biến đảo đoạn íntron 22 bằng kỹ thuật Inversion PCR
45 bệnh nhân hemophillia A chẩn đoán lâm sàng thể nặng xét nghiệm đột biến đảo đoạn Intrõn 2 bắng phương pháp Inversion PCR Kết có 19/45 bệnh nhân có đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ 42,2%
ĐC HA HA RA BA HA HA HA M 02 33 07 12 3 55
SOObp ss%p
4S7fcp
M : (aark e r kich thiròc lOObp E C : Mầu đui ch ũ sg ( n g u ô i bìtili tlitrịng) HA33, HA3S Khơng cị ãăc đoạn {iron 22
HA02, HA07, HA ù , HA20.HAS5: rô d j< b ú n a io *>}* itroa ĩ ĩ
Hình Hình ảnh điện dĩ sản phẩm PCR xác định đột biến đảo đoạn ỉnỉron 22
Nhận xét: D N A người bình thường mẫu đối chứng dương (+) khuếch đại bang phản ứng multiplex P C R có băng kích thước tương ứng 87 bp Nếu đột biến xảy ra, khuếch đại cho đoạn kích thước 559 bp N hư vậy, vị trí giếng tương ứng với bệnh nhân m ã số HA33, H A38 khơng có đảo đoạn intron 22 có vạch DNA kích thước 4 bp giếng mã số H A02, HA07, HA12, HA20, HA55 bệnh nhân hemophiília A có đột biến đảo đoạn intron 22 (hình 1) điện di có vạch DNA kích thước 559bp.
3.1.2 Xác định đột biến đảo đoạn intron phương pháp Multiplex PCR
Có 19/45 bệnh nhân hemophilỉia A thề nặng bị đột biến đảo đoạn intron 2 , /4 bệnh nhân hemophillỉa A thể nặng lại tiếp tục sàng lọc đột biển đảo đoạn intron thẽo phương pháp multiplex P C R Kết quả 26 bệnh nhân không bị đột biến đảo đoạn intron 1.
| M | p i M M PI P2 PI P2 Pi P2 Ỉ T n M
Biễuđô í: Tỷ lệ đọt biên theo the bẹnh nhóm phát và nhóm chưa phát được
Nhận xét:
- Thể nặng: 41/45 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ ịệ 91,1% /4 bệnh nhân chưa phát hiện đột biến chiếm tỳ !ệ 8,9%
- Thể trung binh: 9/10 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ iệ 90% 1/10 bệnh nhản chưa pháỉ hiện đột biến chiếm tỷ lệ 10%.
2kb—>\
Ikb— ụ— 1191bp
M: Maầer kích thước Pi: Phàn ứng l dặc hiệu cho iníihỉ P2: Phán úng 2dặc hiệu cho iflt!h2
(4)Nhận xét: Trong kết hình 2, phản ứng multiplex P C R khuếch đại đoạn Ỉnt1h1 (P 1) cho đoạn DNA kích thước 1908bp chứng tỏ cặp mồi 9F 9cR thiết kế cho đoạn in tlh l bắt cạp với Các phản ứng khuếch ổại đoạn in t l h i (P 2) ổều cho kích thước 1191 bp chứng tỏ chì cỏ cặp mồi int1h-2R
ÌnMh-21" hiâi I H-yV/ínạr* in H í y ? wAi 1-jh g ii
Như vậy, đột biến ỉntron bệnh nhân mã số H A15, HA46, H A45 HA24.
3.2 K ế t p h t đ ộ t biến m ấ t exon phản ứng PCR
Nghiên cứu có bệnh nhân đột biến exon bao gồm HA38, HA51, HA55.
- Đột biến exon exon bệnh nhân H A 51:
Exon7 Exon Exon9 Exon 10
- Ỷ BN - + BN * + BN - + BN M
M: Marker í GObp BN: bệnh nhân
4-: đoi chứng dương - ; đối chứng âm Hình Kết qua PCR xác định đột biến mắt exon bệnh
nhân HA51
Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ HA51 sau khuếch đại toàn 38 cặp mồi với mẫu đổi chứng âm đối chứng dương phát vị trí exon
3.3.2 Đột biến sai nghĩa
C.6545
I
I C A C T C T T C G C A T G G A G T T G
Người bình thường
8, exon bệnh nhân khơng có vạch D N A tát exon lại lên vạch DNA tương ứng với mẫu đổi chứng dương Đ iều chứng tò bệnh nhân bị đột biến mat đoạn exon exon 9.
3.3 K ế t p h t đ ộ t biến ph n g pháp g iả i trình tự
Ọ o ỉẤn
o o / L ý Ụ i U Ỉ K s i i /7/ái U U Ờ i i Ỉ Ỉ U U i & U U U
Đ ột biến 15 nuclẽtid.
' • f c.43S459doi15Nu
I p ttS - ^ S d e lY ty n
GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACAC' GCTGAGGT^ATTAC
Ngtrờibmhthirêng BệnhnfiẵnHA46
135-139
GtaeBaak 125 E.I£gn0ftSy Y r e m ĩL:<mSHPVSLBMGVSraKÃSEI£SYVF3SLCLSVCLH5 L L S y n Q R E V I T U N ® S H ? V S L H f tV G V S r> « A S E IS G m C S L & S V C L a ^ LLGPT1QASV ĨTLKỉmSHPVStHAVGVSríỉ[®SBISCrv'FDSLĨLSVCLHS Hirih Hinh ẫnti đột biên mẫt đoạrí 15 nucieotid bệnih
nhân HA46
Nhận xét: Bệnh nhân m ã số H A46 thể nặng, không phát thấy đảo đoạn intron 22, intron khuếch đại 38 cặp mồi lên vạch căng, rõ nét Tinh DNA của phản ứng khuếch đại giải trình tự, sau đó so sánh với trình tự người bình thường Kết exon phát thấy độí biến 15 nucleotid vị trí c.435-450 Khi kiểm tra thay đổi acid amin đột biển gây ra, thấy vị trí protein từ 135 đến 139 bị mẩt 5 acid amin Tyrosin, Asparagin, Threonỉn, Valin, Valin (p 135-13 d e lí yr-Vai).
C.6545G>A p.R2182H(Arg 2182 His)
Ỷ
C A C T C T T C A C A T G G A G T T Gj
Bệnh nhân HA59
2182
Q u e r y 4 S b j c t
VFFG1WDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNS 219:
VFFGNVDSSGIKHWIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTL MELMGCDLNS
VFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLHMELMGCDLNS 4 9
(5)Nhận xẻt: Hỉnh ảnh giải trình tự bệnh nhân mã số HA59 cho thấy: có đột biến thay rìũcleotid G thành nucleotid A (G>A) exon 23 cùa gen F8 So sánh với trình tự Genebank thấy exon 23 vị trí C.6545 G>A, dân đến thay đổi acid amin vị trí p.2182 protein gen F8 từ Arginin thành Histidin (p.Arg2182His).
3.3.3 Đột biến thêm vô nghĩa
C *H T m mpUUa{UtiíMĩi#tì
TTCTCĨGGAĨAĨACCTTCAA ĨĨC TC ĨG O A ĨA A A C C ĨĨC A A A
Ĩ Ị Í
CĩMbuk 1W JflUw»}i$£Y^5w«lWttMĨĨwíi3mộ(J m m s s w M m m m m w w m
Hình Hình ảnh đột biến tạo stop codon của bệnh nhân HA33
Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ H A 33 sau giải trình tự kiểm tra vị trí đột biến cho thấy: đột biến thay nucleotid T nucỉeotid A vị trí 6425 So sánh với trình tự Genebank cho thấy: đột biến làm thay đổi acid amin Leucin tạo thành stop codon gây dừng đột ngột quá trình phiên m ã protein (p.Leu2142Stop).
3.3.4 Đột biến thêm nucleotid Đ ột biến thêm nuđeotid C:
e.2777 e,2777ỉn»c
p.S827iiu{lytỉỉ7lnt)
TTAGGACCCCCAAGTATGCCi TTAGGACCCCCCAAGTATGCC
Ngiròiblnli tỉuròng B ệnh nhản H.AQ3
3.3.5 Đột biến mẩt nucleotìd Đ ột biến m ất nudeotid A:
e.3389deU p.R1130del( Argilỉãđei)
G G AG C C A A A A A A A A TA A C C T T- G G A G C C A A A A A AaVaA C C T T
Ê ấ k ầ m ề ề ì ề ấ
N g trờ i b in h th n g Bệnh nhãn HA01
1130 - _
-B
I
CíBsbiaỉi m e Q asĩTaTĩ-iọsD3as5s?asfQKKTEHĩFi&11ỉ3aĩ8ĩVarjỉLSJiffiỊJĩBFLS¥iTS H Ỉ gssiH rĩiBísie
RUI i Ỗ55ÌTSTTÌỈ5D5K 1020
Hình Hình ảnh đột biến nucleotid A bệnh nhân HA01
Nhận xét: Hinh ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân HA01 có đột biến m at nucieotid A So sẩnh với trinh tự G enebank thấỵ nucleotid A vị C.3388, dan đến protein yếu tố V íll bi lệch khung dịch mã tồn acid amin từ vị trí p 1130 (p.Ầrg1130deỉ). 3 Â 3 .i.-Ề 9 L Ế Ể Đ J Ể .y ịM .ũ Ế
c iì o r cil5J«5a»T
TTTCATGAAGGTTAGTGAGTCTT TTTGATGAAGTTTAGĩCAGTCTT;
Ngi^t bình thưửng Bịnh nhin HA4Ỉ
Hình Hình ảnh độỉ biến vị trí nối exon/intron bệnh nhân HA45
Nhận xét: Với thay đỗi bầt thường gần hoặc vị trí đầu cuối exon vị írí nối exon v in íro n
4 Mối liên quan thể bệnh độỉ biến khác nhau bệnh nhân hemophillia A
4.1 Tỷ lệ dạng đột biến phát bệnh nhân hemophillia A
8 'Ã A "S lK K L Ì);K V 3S ĨSỉ;ỉÌI,I3T ĩf5D H L A A ữ T D :ỉT 5S L 5??r^L D F :< V S T A ĨL F ?F M S 3 ' ĨA A ?S L K K L D íK V S3T 3ìiíỉI.ISĨIP3K -ÍI.M 'Ơ T D !í?SSL G f?
KA03 Ĩ S ì ? Ã n ? S L ^ L H V S SĨ S Í i a ĩ I S Ĩ I P S3 !ilM G T D !l?S S L g??S _ _ _ Hình Hình ảnh đột biến ỉhêm nucleotỉd c của bệnh nhản
HA03
Nhận xét: Hỉnh ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân mã số HA03 có đột biến thêm nucleotid c
Kiểm tra trinh tự G enebank x ác định thay đồi trên exon 14 !à C.2777 insC, đột biến gây lệch khung dịch mã tồn acid amin cịn lại từ vị trt p.927(p.Lys927ĩns).
r * <§>
Bieu đồ 2: Các dạng đột biên pháỉ ỉrên bệnh nhân hemophilia A
Nhận xét: Trong bệnh nhân phát đột biến co:
- Đ ộ t biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỷ lệ cao nhất: 1 /5 (3 ,2 % ).
(6)thêm nucleoíid đứng íhứ ba, loại 6/54 (11,1% ).
- Chiếm tỵ lệ thấp đột biến vị trí nối exon- intron, đột biến đoạn lớn: loại 3/54 (5,55% ).
4.2 Tỷ lệ dạng đột biến trông thể bệnh
100.00%
o n n tĩỊí 80.00% 70,00% 60.00% 50.00% 40.00% 30.00%
20,00%
10.00%
0.00%
Intron 22 Thể nặng
đột biến điểm Thể trung bình
đột biến đỉểm
ĩh ể n h ẹ
Biểu đồ 3: Tỷ lệ dạng đột biến thể bệnh Nhận xét:
- Đ ộ t biến đảo đoạn Intron 22: chỉ gặp bệnh nhân thể nặng: /4 (4 ,2 % ).
- Đ ột biến điểm gặp chù yếu thề trung bỉnh 90% (9/10), thể nhẹ 80% (4/5).
4.3 Tỷ lệ đột biến bệnh nhân hemophilia A thể n ặ n g _
3.90%
* Đào đoạn itron 22 B Đội biền điềm ÍỈS Mất đoạn lớn B Chưa phát
Biễu đồ 5: Tỷ lệ đột biến bệnh nhân hemophillia A thể nặng
Nhận xét: Bệnh nhân hemophilia A thề nặng: - / (42,2% ) đột biến đảo đoạn Intron 22. - / (42,2% ) đột biến điềm ’
- 3/45 (6,7% ) đột biến đoạn lớn. - /4 (8,9% ) chưa phát đột biến. B À N LUẬN
Bệnh hemophilia A !à bệnh di truyền thiếu hụt bất thường chức yếu tố đông máu huyết tương - yếu tố Vill T năm 1984, nghiên cứu của Gitschier cho thấy hiểu biết đầy đủ cấu trúc phân từ gen F8 tổng hợp protein yếu tố VIII,
mở đường cho nghiên cứu chế bệnh học phân tử hemophilia A dạng đột biến gen F8 gây bệnh.
X ác định vị trí đột biến gen F bệnh nhân hemophilia A cung cẩp nhiều lợi ích cho khoa học bản ứng dụng lâm sàng Đổi với bệnh nhân bị bệnh hemophilia A, xác định vị trí đột biến một tiêu chuẩn vàng để khằng định xác chẩn đốn bệnh, ngồi hỗ trợ việc tiên íượng mức độ nghiêm trọng bệnh diễn biến lâm
Sàng7 trong dự báo nguy phát triển kháng íhể
kháng FVIII đẻ từ lựa chọn phương pháp điều trị tối ưu Hơn nữa, xác định vị trí đột biến bệnh nhân ià điều kiện tiên quyểt cho việc chẩn đoán trước sinh nhữna phụ nữ mang gen bệnh tiến hành thiết lập đo đột biển gen F8 tiền đ ề quan trọng cho việc áp đụng liệu pháp điều trị gen tương lai để giải triệt để bệnh này.
T y lệ p h t đ ợ c đ ộ t biến
Trong nghiên cứu này, xác định đột biến gen F8 thực bệnh nhân chần đốn hemophilia A khơng có quan hệ huyết thống: Có 54 trường hợp phát đột biến chiếm 90% , (10% ) trường hợp chưa phát đột biến T ỷ lệ chưa phát đọt biến cao các tác giả khác công bổ 2-7% , ngun nhân do chúng tơi chưa phối hợp phương pháp khác để chẩn đốn vị trí đọt biến vùng intron, chưa xác định đọt biến lặp đoạn DNA bằng phương pháp M L P Ầ Tuy nhiên so với tác giả chì sử dụng phương pháp giải trinh tự gen đơn thuần tỷ lệ phảt đột biến cùa chủng tơi íương đối cao, phù hợp s ố bệnh nhân phát đột biến thể bệnh là: Thể nặng ,i% , thể trung bình 90% , thể nhẹ 80% So với tỳ lệ phát được đột biến cua tác giả Santacroce cộng thực hiện 1296 bệnh nhân hemophilia A Italia 874 (89% ), 146 (84% ), 133 (94% ) tứơng ứng bệnh nhận thể nặng, trung bình, nhẹ [3] Theo tac gia Bogdanova cũng chì sừ dụng phương pháp giải trình tự phát đột biến cho kết xác định đột biến thể là: 100% íhể nặng, % thể trung bình 8 % the nhẹ
ư l x
C ác dạng ỡ ộ ỉ biên g â y b ệnh h em o ph ilia A ờ V iệ tN a m
T ỉ !ệ dạng đột biến khác nghiên cứu của cho thấy hay gặp nhầt đảo đoạn intron 22 (35,2% ) T ỷ íệ tướng tự với tỷ lệ đột biến đảo đoạn intron 2 cong bố - 50% nhóm bệnh nhân thể nặng, Đ ài Loan tỷ lệ nảy 45,1% , 40-5 % Châu Ấu.
(7)Hungari Nghiên cứu bệnh nhân hemophilia A Ắn Đ ộ thấy ỉỷ ịệ đột biến iníron ià 2,7% , tương tự nghiên cứu Nam Phi đột biến tim thầy bệnh nhân da đen m khơng tìm ìhấy bệnh nhân da trắng Tuy nhiên, đảo đoạn intron đột biến quan trọng cần sàng lọc, m ặc dù tỷ íệ phát quần thể người da trắng thấp.
Sau thu D N A có chất lượng tốt chúng tơi sử dụng kỹ thuật P C R với 38 cặp mối đặc hiệu cho 26 exon cua gen F8 phát bệnh nhân bị đột biến ẽxon chiếm tỷ íệ 5,55% Với 23 bệnh nhân thể nặng, 10 bệnh nhân thể trung bình bệnh nhân thể nhẹ sừ dụng kỹ thật giải trinh tự gen để xác định các loại đột biến điểm cho kết quả: dạng đột biến sai nghĩa 20,4% , đột biến m ất /thêm nucieotid đột biến vơ nghĩa có tì lệ 11,1% ; đột biến vị trí nối đột biến mẩt đoạn lớn có tì lệ ,55% số bệnh nhân phái đột biến C ác ioại đột biển tỉm thấy tỉ ỉệ phù hợp với kết báó cáo công bố tác giả R epesse [9], Jochen Graw [5], Adoracion Venceia [1], Rosetti [8].
cứu khác cỊịới Pháp
[9] 120 BN
Đức [53 845 BN
Tây Ban Nha C1] 267 BN
Argentina [83 260 BN
Nghiên cứu
60 BN inỉron 22 46,0% 35,7% 43% 44% 35,2% Sai nghĩa 15,0% 38,2% 34% 12,2% 20,4% Vị trí nối 7,0% 2,6% 2,6% 3,7% 5,55% Vơ nghĩa 13,0% 9,3% 3,7% 10,2% 11,1%
Thêm
nucleoíid 7,0% 2,6% 2,0% 1,9% 11,1% Mát
nucleotid 10,0% 7,5% 7,8% 15,9% 11,1% Mât đoạn
lớn 2,0% 3,0% 1,0% 10,2% 5,55%
K Ế T LUẬN
Nghiên cứu phát đột biến gen F8 bệnh nhân sử dụng kết hợp phương pháp khác nhau, rút kểt luận sau:
1 P h t đ ộ t bỉến g en F bệnh nhân
hemophilia A Việt Nam
- Tỷ lệ phát đột biến % (54/60 bệnh nhân), tỉ íệ phát đột biến thể nặng 91,1% , the trung bình % thể nhẹ 80%.
- C ác dạng đột biến phát bao gồm: đảo đoạn iníron 22 5,2% (1 /5 bệnh nhân), đột biến sai nghĩa ià 0,4% (11/54 bệnh nhân), đột biến nucleotid 11,1 % (6/54 bệnh nhân), đột biến vô nghĩa là 11,1% (6/54 bệnh nhân), đột biến thêm nucleotid là 11,1% (6/54 bệnh nhân), đột biến vị trí nối exon-iníron là 5,55% (3/54 bệnh nhân), đột biến m ất đoạn lớn 5,55% (3/54 bệnh nhân),
2 T ỷ iệ đ ộ t biến p h t đ ợ c với th ể lâm
sàng
- Thể nặng: phát đột biến đảo đoạn intron 22 cao chiếm tỉ lẹ 42,2% , đột bien đoạn lớn 6,7% , đột biến điểm ià 42,2%
- Thể trung bình, thể nhẹ khơng có đột biến đảo
đoạn, chl gặp đột biến điểm 0% thể trung bình, 80% thể nhẹ.
- Chưa phát đột biến đảo đoạn in tro n l.
KIẾN NGHỊ
1 Thiết lập quản lý sờ liệu bệnh nhân và người mang gen bệnh hemophilia A.
2 T vấn di truyền trước hôn nhân chẩn đoán trước sinh cho người mang gen bệnh trước - trong trinh mang thai.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Adoración Venceslá, Maria Angeles Corral- Rodriguez, Manei Baena, Mónica Comet, Montserrat Domènech, Montserrat Baiget, Pablo Fuentes-Prior, Eduardo F, Tizzano (2008) identification of 31 novel mutations in the F8 gene in Spanish hemophilia A patients: structural analysis of 20 sai nghĩa mutations suggests new intermoiecular binding sites Blood, 111(7), 3468-3478.
2 Brockway W l, Olson ID, Fass DN, Bowie JW, Mann KG (1977) Purification of porcine and human ristocetin- Wiilebrand factor LabClin Med, 89,1278-1294.
3 Castaman G, Margaglione M, Morfini M, Rocino A, Santagostino E, Tagarielio G, Mannucci PM (2008) The Italian AICE-Genetics hemophilia A daỉabase:results and correlation with clinical phenotype Haematologica 93(5), 722-728.
4 Chang SP, Ma GC, Chen M, Kuo SJ, Chang c s , Shen MC (2008) The spectrum of ỉhe factor (F8) defects in Taiwanese patients with haemophilia A Haemophiiia, 14,787-795.
5 Hans Hermann, Brackmann, Jochen Graw, Johannes Oldenburg (2005) Heamophilia A: from mutation analysis to new therapies Nature reviews Genetics, 6,488-501.
6 Kazazian HH, Jr Lakich D, Antonarakis SE, Gitschier J (1993) Inversions disrupting the factor VIII gene are a common cause of severe haemophilia A Nat Genet, 5,236-241
7 Markoff A, Bogdanova N, Poilmann H (2005) Spectrum of molecular defects and mutation detection rate in patients with severe hemophilia A Hum Mutat, 26, 249-254.
8 Rossetti LC, Szurkalo i, Radio CP (2013) Factor VIII genotype characterization of haemophilia A affected patiens with transient and permanent inhibitors: a comprehensive Argentine study of inhibitor risks Haematoiogica, 19,115-118.
9 Repesse Y, Slaoui M, Ferrandis M, Gautier p, Costa c , Lavergne JM, Derlon AB (2007) Factor Vlli (FVIil) gene mutations in 120 patients with hemophilia A: detection of 26 novel mutations and correlation with FVIII inhibitor development Thrombosis and Haemostasis, 5, 1469-1476.
10 Schwaab R, Becker J, Moiler-Taube A, Schwaab u, Schmidt w , Brackmann HH, Gn'mm T, Oiek K, Oldenburg J (1996) Characterization of the factor VIII defect in 147 patients with sporadic hemophilia A: family studies indicate a mutation type-ependent sex ratio of mutation frequencie Am J Hum Genet, 58(4), 657-670.