Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR

Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR Phát hiện đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A bằng kỹ thuật PCR luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

(giáo dục nha khoa, súc miệng dung dịch Fluor, khám răng, trám bít hố rãnh) phù hợp với học sinh THC S Tuy nhiên, nội dung chưa đáp ứng yêu cầu ca số lượng chất lượng thiếu sở vật chất nhân lực Triền khai chăm sóc miệng, giáo dục cách phịng chống, xử trí bệnh miệng theo khối !ớp, giáo dục học sinh có học lực trung bình, kém, đào tạo cho giáo viên cha/m ẹ học sinh chương trình nha học đường cần thiết Tồ chức buồl sinh hoạt ngoại khỏa cho học sinh chăm sóc RM, thực khám bệnh SR, V L định kỳ lần/năm cho học sinh Gia đinh nhà trường chung tay hành động C SR M cho học sính TÀ I LIỆU T H A M KHẢO Nguyễn Mạnh Hà (2010), Sâu biến chứng.Nha xuất Giáo dục trè-22 Bệnh viện Răng hàm mặt Thành phố Hồ Chí Minh (2005), "Báo cáo hoạt động chương trình Nha học đường năm 2005" Khoa RHM Bệnh viện Nhi Đồng li Thành phố Hồ Chỉ Minh, Cách khám cho cộng đồng, Bài giảng chăm sóc sức khoẻ miệng Nguyễn Anh Sơn (2010), Thực irạng bệnh sâu răng, viêm lợi mộỉ số yểu tố liên quan học sinh khối lớp trường trung học sờ thị trấn Hương Canh, huyện Bình Xuyên, tỉnh Vĩnh Phúc, Luận văn thạc sỹ y tế công cộng, Trường đại học Y tế cong cộng, Hà Nội Trần Văn Trường (2000), "Báo cáo công tác nha học đường", tr Trần Văn Trường, Lâm Ngọc Ắn Trịnh Đinh Hải (2001), Điều tra sức khỏe miệng toàn quốc, NXB Y học Hà Nội J.p and S.G Damle Bhavsar (1995), Dental caries and oral hygiene amongst 12-14 years old handicapped children of Bombay, India J Indian Soc Pedod Prev Dent, 1-3,13 Poul Erik Petersen cộng (2004), "Effect of a school-based oral health education programme in Wuhan city, Peoples Republic of China", international Dental Journal 54, tr 33-41 Ronald Patrick cộng (2006), "Reducing Oral Health Disparities: A focus on Social and Cultural Determinants", BMC Oral Health Sumptement (S4) 10 W HO (1997), Oral health surey basic method 4th Editison, Geneva, pp.25-28 T hS : Bùi T h ị M inh Phượng Giảng viên m ôn Hóa Sinh - Trường Đ ại học Y D ược Thái Bình H ng d ẫn k h o a học: G S T S Tạ T hành V ăn Trưởng m ỗn Hóa sin h - Trường đ i học Y Hà N ội T Ó M TẮT Hemophilia A bệnh di truyền lặn liên kết với giới tính, gen bệnh nằm nhiễm sắc thể X Người mẹ mang gen bệnh cố khả truyền bệnh cho 50% trai họ, chủ yếu bệnh nhân nam Với tiến kỹ thuật sinh học phân từ, nhà khoa học xẩc định xác vị trí đột biến gen yểu tố víu (F8) gây bệnh hemophilia A tăng hiệu việc phòng ngừa bệnh tật đồng thời nâng cao chắt lượng chăm sóc súc khỏe cộng đồng Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu 60 bệnh nhân chẩn đoán hemophilia A Mục tiêu: Xác định số đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A Kểt quả: Kết cho thấy phát 90% (54/60) bệnh nhân hemophilia A có đột biến gen F8 bao gồm: đảo đoạn intron 22 35,2%, đột biến sai nghĩa 20,4%, đột biến nucleotid 11,1 %, đột biến vô nghĩa 11,1%, đột biến thêm nucleotid 11,1%, đột biển vị trí nối exon-intron 5,55%, đột biến đoạn lớn 5,55% Kết luận: Đây kỹ thuật hữu ích giúp ích cho việc phát sớm cốc gen gây đột biến có hướng tư vấn chẩn đốn trướcAmng trình mang thai Từ khóa: Hemophilia A, gen F8 SUMMARY _ DETECTION OF DISEASE - CAUSING GENE MUTATIONS IN HEMOPHILIA A BY PCR Hemophilia A is a recessive sex-linked disease, the gene caused the disease locates in X chromosome An affected mother can deliver the disease to 50% o f her sons, thus most o f the patients are male With the advance o f molecular biotechnology, scientists can correctly determine the location o f mutation o f Factor VIII (F8) gene causing Hemophilia A to increase the effect o f disease control and improve community health services Subjects and methods: study subjects were 60 patients diagnosed with hemophilia A Objective: The objective o f the study was to detect some F8 gene mutations causing hemophilia A Results: The result showed that 90% (54/60) o f hemophilia A patients had F8 gene mutation included: 35.2% o f patients with intron 22 inversion mutation, 20.4% o f patients with missense mutation, 11.1% o f patients with nucleotid deletion mutation, 11.1% o f patients with nonsense mutation, 11.1 % o f patients with nucieotid insertion 467 mutation, 5.55% o f patients with exon-intron connecting mutation and 5.55% o f patients with large section deletion mutation Conclusion: This is a useful technique for early detection o f genes causing mutations to give counseling and diagnostic before and during pregnancy Keyw ords: Hemophilia A, F8 gene Đ Ặ T V Ấ N ĐỀ Hemophilia A bệnh rối ioạn đông máu, bệnh gây nên thiếu hụt hay bát thường chức củã yếu tố V III Đ ây ià bẹnh di truyền gen iặn íiên kết với nhiễm sac thể giới tính X Việt N am nước cỏ tỷ lệ mắc bệnh hemophilia A cộng đồng cao Theo nghiên cứu cua Đ ỗ Trung Phấn năm 1996 tỳ lệ mắc bệnh hemophilia A khoảng 25 - 60/1.000.000 người Hiện Việt Nam có khoảng 6000 bệnh nhân hemophilia Ả có 30% phát điều trị, phương pháp điều trị chủ yếu íả sử đụng yếu tố V lỉí máu toàn phần (truyền trực tiếp tách chiết) tốn mà hiệu qua không cao, đặc biệt có nguy cao bệnh lây truyền qua đường máu Trên thể giới, nha khoa học phân tích gen bệnh nhân hemophilia A nhiều dạng đột biến gen yếu tố VIII (F8) công bố C ác nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác gây kiểu hình đặc trừng khác Bệnh nhân hemophilia A thề nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-5Ò%),bệnh nhân hemophilia A thề nhẹ trung bình chủ yeu ià đột biến điểm (chiếm 90-95% ) v ĩệ t Nam, cơng trình nghiên cứu bệnh hemophilia A chủ yểu nghiên cứu yề đặc điềm lâm sàng, cận lâm sàng, đánh giá tỷ iệ mắc bệnh đánh giá hiệu điều trị bệnh chế phẩm thay thế.T Với tiến kỹ thuật sinh học phân tử, nhà khoa học phân tích D NA người bệnh để xác định xác tổn thương gen gây bệnh hemophilia A, kiểm soát bệnh tốt nhờ phát người phụ nữ mang gen bệnh tư vấn di truyền trưởc hôn nhân, tăng hiệu việc phịng ngừa bệnh tật đơng thời nâng cao chất lượng chăm sóc sức khỏe cộng đồng Mục tiêu đề tài: Xác định mộỉ sổ đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia Á Mối liên quan thể bệnh với số đột biến gây bệnh hemophilia A Việt Nam ĐỐI TƯ Ợ NG VÀ PHƯ Ơ NG PHÁP ĐỐI tứ ợ ng nghiên cứu Nhỏm đối chứng: gòm 20 người (10 nam, 10 nữ) khỏe mạnh, tiền sử gia đình khơng có ngườỉ mắc bệnh di truyền Nhóm chứng dùng để chuẩn hóa kỹ thuật làm mẫu đối chứng cung với mẫu nghiên cứu để thực kỹ thuật sinh học phân tử để phân tích gen Nhóm nghiên cứu: 60 bệnh nhân chẩn đoán xác ổịnh hemophillia A Viện Nhi Trung ương Viện Huyểt học Truyền máu Trung ương Tiêu chuẩn lựa chọn: * Lâm sàng: + Chảy máu: Chảy máu khó cầm sau chấn thương, sau va chạm hay chảy máu cách íự nhiên + Vị trí: Chảy máu khớp, sổ vị trí khác + Tính chất; Thường chảy máu tái phát + Tiền sừ: Có tiền sử chấy máu kéo dài gia đinh có người thân bị chày máu khó cầm * Cận lâm sàng: + Định lượng yếu tố FV1II giảm 30% - Thể nặng: Hoạt tính yếu tố FVIII < 1% - Thể trung bình: Hoạt tính yếu tố F V II11-5% - Thể nhẹ: Hoạt tính yếu tố FVIII 5-30% + A P T T kéo dài + Thời gian máu chảy binh thường + Số lượng tiểu cầu độ tập trung tiểu cầu binh thường Trang th iế t bị, dụng cụ nghiên cứu hóa chất P hư ng pháp kỹ th u ậ t nghiên cứu Đối với bệnh nhân thể nặng: xác định tượng đảo đoạn intron 22 phừơng pháp Inversion PCR (l-PCR) Khơng có đột biến đảo đoạn iníron 22, xác định đao ổoạn intron phương pháp Multiplex PCR Nếu khơng xác định ta khuyếch đại toàn 26 exon để tim đột biển exon Nếu khơng có đột biến, phân tích đột biến điềm phương pháp giải trình tự gen Đoi với bệnh nhân thể vừa nhẹ sử dụng phương pháp P C R để xác định đột biến exon, khơng đột biến giải trinh tự gen trực tiếp để phát dạng đột bien điểm 3.1 QŨy trình lẩ y mẫu Bệnh nhân chẩn đốn hemophilia A iấy 5ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đông EDTA với hàm lượng 1,5mg/mL Q uy trinh lấy máu đảm bảo vơ írùng tuyệt đối 3.2 Quy trình tách ch iế t DNA từ máu ngoại v i 3.3 Xác định đ ộ t biến gen F8 3.3.1 Xác định đột biến đảo đoạn intron 22 kỹ thuật l - P C R ' k ỹ thuật l-PC R gồm bước: (1) c ắ t DNA enzyme Bell, (2) NỐI T ligate, (3) Khuyếch đại phản ưng multiplex PCR Phương pháp I-PCR có ưu điểm dễ tiến hành Enzyme Bell tác dụng đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzym e có tính đạc hiệu cao San phẩm P C R khuyếch đại dễ dàng thời gian khoảng 30 phút đoạn DNA có kích thước ngắn (487 559pb) Như xét nghiệm phân tích gen tiến hành nhanh chóng, kết ỉhụ có độ tín cậy cao, dễ thực 468 3.3.2 Phát đột biến đảo đoạn intron kỹ ỉhuật multiplex PCR k ỹ thuật multiplex PCR: Thiết kể hai phản ứng multiplex P C R cố thể phát bệnh nhân bị đột biến: phản ứng có chưa cặp mồi đặc hiệu cho Ĩnt1h1 cộng với mồi đặc hiệu cho chuỗi Ỉn1h2, phản ứng chứa cặp mồi đặc hiệu int1h2 cộng với mồi đặc hiệu cho intl h1 Dựa vào kích thước khác đoạn D NA sau điện di để phát đột biến 3.3.3 Phất đột biến exon kỹ thuật PCR Phản ứng P C R sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại exon gen F8, sau điện di gel agarose, mẫu bệnh nhân đưực tiến hành song sọng với mẫu đối chứng Nếu m âu đối chứng xuất vạch DNA tương ứng với kích thước exon khuếch đại, ĩrong mẫu bệnh nhân không xuấỉ vạch thỉ bệnh nhân bị đột biến m ất đoạn exort Thể nhẹ: 4/5 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ lệ 80% , 1/5 bệnh nhân chưa phát đột biến chiếm 20% K ết p h ỉ h iện d ạng đ ộ t biến gen F8 3.1 K ế t xác định đ ộ t biến đảo đoạn 3.1.1 Kết xấc định đột biến đảo đoạn íntron 22 kỹ thuật Inversion PCR 45 bệnh nhân hemophillia A chẩn đoán lâm sàng thể nặng xét nghiệm đột biến đảo đoạn Intrõn 22 bắng phương pháp Inversion PCR Kết có 19/45 bệnh nhân có đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ 42,2% ĐC HA HA RA BA HA HA HA M 02 33 07 12 3 55 3.3.4 Phát đột biến điểm kỹ thuật giải trình tự gen Được thực theo qui trình sử dụng phương phốp BigDye terminator sequencing (Applied Bỉosysíems, Foster city USA) V iệc phân tích kểt dựa vào so sánh trình tự geri cua bệnh nhan với trình tự gen chuẩn Gen Bank(nạtỉona! center for biotechnology information, NCBI) phần mềm CLC So sánh trinh tự acid amin bệnh nhân với trinh tự chuẩn chùa Genbank phần mềm Biast NCBI K ÉT QU Ả Đ ặ c đ iểm chung đ ố i tư ợ n g nghiên cứu 5/60 bệnh nhân chẩn đoán lâm sàng thể nặng chiếm tỷ lệ 75% , 10/60 bệnh nhân thể írung bình chiếm tỷ lệ 16,67% , 5/60 bệnh nhân thể nhẹ chĩếm tỷ lệ 8,33% T ỷ iệ p h át đ ợ c đ ộ t biến 2.1 Ty iệ bệnh nhân theó k ế t p h t đột biến Nghiên cứu phái 4/60 trường hợp bệnh nhân có đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A chiếm tỷ iệ 90% Số bệnh nhân chưá phát 6/6 chiếm tỷ lệ 10% 2.2 Tỳ lệ độ t biến theo thề bệnh nhóm phát hiên nhóm khơng p h t ' _ H Phối đ ợ c ta C h u a phàt đirợ c ss%p 4S7fcp SOObp M : (aark er kich thiròc lOObp E C : Mầu đui ch ũ sg ( n g u i bìtili tlitrịng) HA33, HA3S Khơng cị ãăc đoạn {iron 22 HA02, HA07, HA ù , HA20.HAS5: rô d j< b ú n aio *>}* itroa ĩ ĩ Hình Hình ảnh điện dĩ sản phẩm PCR xác định đột biến đảo đoạn ỉnỉron 22 Nhận xét: D NA người bình thường mẫu đối chứng dương (+) khuếch đại bang phản ứng multiplex P C R có băng kích thước tương ứng 487 bp Nếu đột biến xảy ra, khuếch đại cho đoạn kích thước 559 bp N hư vậy, vị trí giếng tương ứng với bệnh nhân m ã số HA33, HA38 khơng có đảo đoạn intron 22 có vạch DNA kích thước bp giếng mã số HA02, HA07, HA12, HA20, HA55 bệnh nhân hemophiília A có đột biến đảo đoạn intron 22 (hình 1) điện di có vạch DNA kích thước 559bp 3.1.2 Xác định đột biến đảo đoạn intron phương pháp Multiplex PCR Có 19/45 bệnh nhân hemophilỉia A thề nặng bị đột biến đảo đoạn intron 22, 6/45 bệnh nhân hemophillỉa A thể nặng lại tiếp tục sàng lọc đột biển đảo đoạn intron thẽo phương pháp multiplex P C R Kết 26 bệnh nhân không bị đột biến đảo đoạn intron 100 00 % 90.0054 80.00% 70.00% 60.0054 SO.OOSé 40.00% - |M | 30.0054 20.0 % M 10.00« 0.00% -1 T ru n g b ìn h p i PI P2 PI P2 Pi M P2 Ỉ T n M Nhẹ Biễuđơ í: Tỷ lệ đọt biên theo the bẹnh nhóm phát nhóm chưa phát Nhận xét: - Thể nặng: 41/45 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ ịệ 91,1% /4 bệnh nhân chưa phát đột biến chiếm tỳ !ệ 8,9% - Thể trung binh: 9/10 bệnh nhân phát đột biến chiếm tỷ iệ 90% 1/10 bệnh nhản chưa pháỉ đột biến chiếm tỷ lệ 10% —>\ 2kb ụ— 1191bp Ikb— M: Maầer kích thước Pi: Phànứng l dặc hiệuchoiníihỉ P2: Phánúng 2dặc hiệuchoiflt!h2 Hình Hỉnh ảnh điện di sản phẩm PCR xác định đảo đoạn intron 469 Nhận xét: Trong kết hình 2, phản ứng multiplex P C R khuếch đại đoạn Ỉnt1h1 (P 1) cho đoạn DNA kích thước 1908bp chứng tỏ cặp mồi 9F 9cR thiết kế cho đoạn in tlh l bắt cạp với Các phản ứng khuếch ổại đoạn in t lh i (P 2) ổều cho kích thước 1191 bp chứng tỏ chì cỏ cặp mồi int1h-2R ÌnMh-21" hiâi I H-yV/ínạr* in H íy ? wAi 1-jh g ii 8, exon bệnh nhân khơng có vạch D NA tát exon lại lên vạch DNA tương ứng với mẫu đổi chứng dương Đ iều chứng tò bệnh nhân bị đột biến mat đoạn exon exon 3.3 K ết p h t đ ộ t biến phư ng pháp g iả i trình tự Ọ oo / L ý Ụ i U Ỉ KỉẤ n o s i i /7/ái U U Ờ i i Ỉ Ỉ U U i & U U U Như vậy, khơng có đột biến ỉntron bệnh nhân mã số HA15, HA46, HA45 HA24 Đ ột biến 15 nuclẽtid '• f 3.2 K ế t p h t đ ộ t biến m ất exon phản ứng PCR c.43S459doi15Nu I p ttS - ^ S d e lY ty n GCTGAGGTTTATGATACAGTGGTCATTACAC' GCTGAGGT^ATTAC Nghiên cứu có bệnh nhân đột biến exon bao gồm HA38, HA51, HA55 Đột biến exon exon bệnh nhân H A 51: Ngtrờibmhthirêng BệnhnfiẵnHA46 Exon7 - Exon Ỷ BN - Exon9 + BN * + Exon 10 BN - 135-139 + BN M GtaeBaak 125 ^ E.I£gn0ftSy Y r e m ĩL: « A S E IS G m C S L & S V C L a LLGPT1QASV ĨTLKỉmSHPVStHAVGVSríỉ[®SBISCrv'FDSLĨLSVCLHS Hirih Hinh ẫnti đột biên mẫt đoạrí 15 nucieotid bệnih nhân HA46 M: Marker í GObp 4-: đoi chứng dương BN: bệnh nhân - ; đối chứng âm Hình Kết qua PCR xác định đột biến mắt exon bệnh nhân HA51 Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ HA51 sau khuếch đại toàn 38 cặp mồi với mẫu đổi chứng âm đối chứng dương phát vị trí exon 3.3.2 Nhận xét: Bệnh nhân m ã số HA46 thể nặng, không phát thấy đảo đoạn intron 22, intron khuếch đại 38 cặp mồi lên vạch căng, rõ nét Tinh DNA phản ứng khuếch đại giải trình tự, sau so sánh với trình tự người bình thường Kết exon phát thấy độí biến 15 nucleotid vị trí c.435-450 Khi kiểm tra thay đổi acid amin đột biển gây ra, thấy vị trí protein từ 135 đến 139 bị mẩt acid amin Tyrosin, Asparagin, Threonỉn, Valin, Valin (p 135-13 d e lí yr-Vai) Đột biến sai nghĩa C.6545 C.6545G>A p.R2182H(Arg 2182 His) I Ỷ IC A C T C T T C G C A T G G A G T T G CACTCTTCACATGGAGTTG Người bình thường j Bệnh nhân HA59 2182 Q u e ry 2144 S b jc t VFFG1WDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNS VFFGNVDSSGIKHWIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTL MELMGCDLNS VFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLHMELMGCDLNS Hinh Hình ảnh đột biến bệnh nhân mã số HA59 470 219: 49 Nhận xẻt: Hỉnh ảnh giải trình tự bệnh nhân mã số HA59 cho thấy: có đột biến thay rìũcleotid G thành nucleotid A (G>A) exon 23 cùa gen F8 So sánh với trình tự Genebank thấy exon 23 vị trí C.6545 G>A, dân đến thay đổi acid amin vị trí p.2182 protein gen F8 từ Arginin thành Histidin (p.Arg2182His) 3.3.3 Đột biến thêm vô nghĩa 3.3.5 Đột biến mẩt nucleotìd Đột biến m ất nudeotid A: e.3389deU p.R1130del(Argilỉãđei) G G AGC CA AA A A AA A TAA C CTT- G G AG C C A A AA A A aV A C C TT Ê ấ k ầ m ề ề ìề ấ Bệnh nhãn HA01 N g trờ i b in h th n g mm C *H T a - 1130 B pUUa{UtiíMĩi#tì CíBsbiaỉi _- I m e QasĩTaTĩ-iọsD3as5s?asfQKKTEHĩFi& 11ỉ3aĩ8ĩVarjỉLSJiffiỊJĩBFLS¥iTS 56i Ỗ55ÌTSTTÌỈ5D5K 1H Ỉ gssiHrĩiBísie RUI TTCTCĨGGAĨAĨACCTTCAA ĨĨCTCĨG O A ĨAA A CCĨĨCA AA Hình Hình ảnh đột biến nucleotid A bệnh nhân HA01 Nhận xét: Hinh ảnh giải trình tự cho thấy bệnh nhân HA01 có đột biến m at nucieotid A So sẩnh với trinh tự G enebank thấỵ nucleotid A vị C.3388, dan đến protein yếu tố V íll bi lệch khung dịch mã tồn acid amin từ vị trí p 1130 (p.Ầrg1130deỉ) Ĩ Ị4 Í CĩMbuk 1W JflUw»}i$£Y^5w«lWttMĨĨwíi3mộ(J m m ssw M m m m m w w m  3.3.4 Đột biến thêm nucleotid Đ ột biến thêm nuđeotid C: Ngiròiblnli tỉuròng 885 KA03 ĨS ì -iỀ L Ế Ể Đ J Ể y M ị ũ Ế cil5J«5a»T TTTCATGAAGGTTAGTGAGTCTT TTTGATGAAGTTTAGĩCAGTCTT; Nhận xét: Bệnh nhân mã sổ H A 33 sau giải trình tự kiểm tra vị trí đột biến cho thấy: đột biến thay nucleotid T nucỉeotid A vị trí 6425 So sánh với trình tự Genebank cho thấy: đột biến làm thay đổi acid amin Leucin tạo thành stop codon gây dừng đột ngột trình phiên m ã protein (p.Leu2142Stop) TTAGGACCCCCAAGTATGCCi c iì o r Hình Hình ảnh đột biến tạo stop codon bệnh nhân HA33 e.2777 1020 Ngi^t bình thưửng Bịnh nhin HA4Ỉ Hình Hình ảnh độỉ biến vị trí nối exon/intron bệnh nhân HA45 Nhận xét: Với thay đỗi bầt thường gần vị trí đầu cuối exon vị írí nối exon v in íro n Mối liên quan thể bệnh độỉ biến khác bệnh nhân hemophillia A 4.1 Tỷ lệ dạng đột biến phát bệnh nhân hemophillia A e,2777ỉn»c p.S827iiu{lytỉỉ7lnt) TTAGGACCCCCCAAGTATGCC B ệnh nhản H.AQ3 r 'à A "SlK K L Ì);K V 3SĨSỉ;ỉÌI,I3Tĩf5D H L A A ữT D :ỉT 5SL 5??r^L D F: