Nghiên cứu trình tự các Gen tiêu biểu và phát triển kỹ thuật Multilplex PCR mới chẩn đoán Bacillus Anthracis gây bệnh ở Việt Nam

Nghiên cứu trình tự các Gen tiêu biểu và phát triển kỹ thuật Multilplex PCR mới chẩn đoán Bacillus Anthracis gây bệnh ở Việt Nam Nghiên cứu trình tự các Gen tiêu biểu và phát triển kỹ thuật Multilplex PCR mới chẩn đoán Bacillus Anthracis gây bệnh ở Việt Nam luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

NGHIÊN CỨU TRÌNH Tự CÁC GEN TIÊU BIỂU VÀ PHÁT TRIÉN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR MỚI CHẦN ĐOÁN BACILLUS ANTHRACIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM ThS Đinh Thị Thu Hằng, ThS Nguyên Thanh Việt T - , í ~ *1^* IP A ì t u n y ta m A rt* i f is ỉiiti r Lsurvx* V n ỉ Ị Ị M A w ' jS m , / risjK* V /C Í I W u c m y ThS Nguyễn Văn An (B M K V isinh y học, Bệnh viện Q uâtiy 1Ó3, Học viện Quân ý) Hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thái sớ n BMK Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y TÓM TẮT Nghiên cứu phát triển kỹ thuật dựa PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt Bacillus anthracis quan tẩm Trong cơng trình này, gen vrrA nhiễm sầc thể, gen độc lực pagA, cya, lef (plasmid pX01), capA, capB, capC (plasmid pX02) từ chủng B anthracis Việt Nam tách dòng giải trình tự hồn chỉnh Đã xác đính đột biến thêm nucleotide A gen vrrA, đột biến đồng nghĩa, đột biến sai nghĩa gen pagA đột biến đồng nghĩa gen cya Đặc biệt, đột biến sai nghĩa lần đấu tiên phát gen capA chủng B anthracis Ba1 Cốc gen lại tương đồng 100% so với chủng tham chiếu B anthracis Vollum-USA Đồng thời, phản ứng PCR đa mồi chứa chứng nội thiết kế để phát xác B anthracis Đày cơng bố đủ chi tiết nước trình tự gen tiêu biểu B anthracis phát triển cõng cụ hữu Ịch cho phép chẩn đốn nhanh B anthracis gây bệnh Từ khóa: Chứng nội tại, độc lực, PCR đa mồi, vi khuẩn than, Việt Nam, SUMMARY COMPLETE SEQUENCE ANALYSIS OF THE TYPICAL GENES OF BACILLUS ANTHRACIS AND DEVELOPMENT OF A NOVEL MULTIPLEX PCR FOR VIRULENT BACILLUS ANTHRACIS DETECTION IN VIETNAM Dinh Thi Thu Hang, Nguyen Thanh Viet Bio-medical and Pharmaceutical Applied Research Centre, Vietnam Military Medical University Nguyen Van An, 103 Hospital, Vietnam Military Medical University Development o f PCR-based techniques for rapid and accurate identification o f bioterrorism agents, especially Bacillus anthracis is interest in recent years In this study, the entire sequences o f the vrrA gene (chromosome), pagA, cya, lef genes (virulence plasmid pX01) and capA, capB, capC genes (virulence plasmid pX02) o f ten B anthracis strains Ba1-10 isolated in Northern Vietnam were cloned and analyzed One insertion mutation at nucleotide position 346 A in the vrrA gene (10 strains), one synonymous and two missense mutations in the pagA gene and one synonymous mutation in the cya gene (Ba3, 4) Interestingly, one missense mutation was first identified in the capA gene o f B anthracis strain Ba1 The remaining genes had 100% similarity in comparison to the B anthracis references In addition, a multiplex PCR assay with primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1, including recombinant internal amplification control was developed for detection o f virulent B anthracis strains This is the first report in Vietnam that investigates the full-length o f the vrrA gene and some typical genes on virvlence plasmids pX 01 and pX 02 as well as develops a useful molecular tool for rapid detection o f virvlent B anthracis in Vietnam Keywords: Bacillus anthracis, internal amplification control, multiplex PCR, virulent, Vietnam ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU Bacillus anthracỉs, tác nhân gây bệnh than tim thấy nhiều quốc gia giới Khả gây bệnh B, anthracis chủ yếu nhờ có mặt gẽn nằm hai plasmid !ớn pX01 (182 kb) pX02 {95 kb) - gọi íà plasmid độc lực Plasmid pX01 chứa gen sảrì xuất độc tố, pX02 chứa gen liên quan đển q trình tổng hợp vị poiy-D-g!utamic acid [9] Chì chùng có đầy đù hai píasmid có khả gây bệnh nguy hiểm Trên pX01, có ba gen quan trọng ià gen pagẢ mẵ hóa cho kháng nguyền bảo vệ, cya mã hóa cho yếu tố gây phù nề (edema factor - EF) adenylyl cyciase dẫn đến phù nề da thể let mã hóa cho yếu tố gây chết (lethal factor - LF) [11] Plasmid pX02 chứa operon capBCADE [5] với gen quan trọng capA, capB, capò Bởi tính chất cếp tính, khả gây chết người qua đường hô hấp kết hợp vởi khả phục hồi bào tử sau tiếp xúc với nhiệt phóng xạ khiến B anthracis sử dụng vũ khí sinh học Việt Nam, bệnh than xuất rải rác tĩnh miền núi phía Bắc Sơn La, Điện Biên, Lai Châu, [1] Gần (10/2014) Mèo Vạc, Hà Giang ghi nhận ca nhiêm bệnh than ăn thịt gia súc chết bệnh than Sự xuất trở lại cùa B anthracỉs íần cảnh báo mầm bệnh nguy hiềm cần quan tâm mức có phương án phịng chống hiệu quả, tránh để dịch bùng phát Trong cơng trinh này, nhóm nghiên cứu giới thiệu trình phân lập, xác định trình tự đầy đù gen đặc trưng nhiễm sẳc thể vrrA gen độc lực pagA, cya, ief (pXOỊ), capA, capB, capC (pX02) Điều góp phần làm phong phú thêm kết phân tử 480 có thêm liệu tương đối hồn chình số gen tiêu biểu chủng B anthracis phân iập Việt Nam Trên sở kếỉ phân tích trinh tự này, kết hợp với nghiên cứu giới để phát triển kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) tối ưu với ba gen đích nhiễm sắc thể, pX01, pX02 chứng nội tái tổ hợp (IC) xác định xác B anthracis gây bệnh tự nhiên Như vậy, cơng trình nghiên cứu có hai mục tiêu sau: Phân tích trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (trên nhiễm sắc thể), gen độc lực pagẤ, cya, lef (plasmid pX01) capA, capẻ, capC (plasmid pX02) chủng B anthracis phân lập Việt Nam Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tái tổ hợp xác định nhanh, xác B anthracis gây bệnh tự nhiên VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN cứu Vậỉ liệu Cac chủng vỉ khuẩn: Mười chủng vi khuẩn B anỉhracis phân lập từ bệnh nhân, gia súc chết bệnh than mơi trường cung cấp Học viện Quân y Viện Y học Dự phòng Quân đội, Cục Quân y (Ba1-Ba10) Trong đó, có chủng B aníhracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 Ba4), chủng B anỉhracis có pX01 (Ba6), chủng cịn lại B anthracis khơng độc Chủng B cereus Bc1 ổược sử dụng làm đổi chứng ắm Cac cặp mồi đặc hiệu thiết kế để nhân toàn gen vrrA (chromosome), pagA, cya, ief (pX01) capẦ, capB, capc (pXÓ2) sử dụng phần mềm primer3pius Ba cặp mồi phát qen vrrA, pagA, capA phản ứng mPCR the chi tiết bảng Chứng nội (internal amplification conirol-IC): Plasmid tái tồ hợp JET1.2-capA-IC1 thiết lập nghiên cứu trước nhóm tác giả [3] đăng ký sáng chế (Phụ lục 2) Plasmid thiết kế theo hướng sử dụng chung với cặp mồi chẩn đoán capAF1/R1 (Bảng 1)7 Bảng Các moi sử dụng phản ứng mPCR chứa IC Kích Gen đích Trình tự (5'-3’) thước (bp) vrrA (nhiễm vrrAF1 :CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA 222 sắc thể) vrrARI :CCTCGCGCACTTCT TTTTCT pagA (plasmid pagAF1 :AAATGGAGCACGGCTTCTGA 751 pX01) pagARI :AGCCTGTATCCACCCTCACT capA (plasmid capAFI :TGACGATGACGATGGTTGGT 610 pX02) capARI: 1000 PJET1.2GCTTCCTGTCTAGGACTCGG capA-ICI Phương pháp Nghiên cứu thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mơ tả, phân tích phịng thí nghiêm thực địa, sử dụng kỹ thuậí vi sinh kinh điển sinh tìọc phân tử Các kỹ thuậỉ tóm tắt sau: Tách dòng giải trinh tự: Chủng vi khuẩn than bấí hoạt đieu kiện 121°C/20 phút sau tách DNA tổng số theo quy trình nhà sản xuất (QIAamp DNA Mini Kit) Phản ứng PCR có độ xác cao thực máy PCR Eppendorf Mastercycíer pros (Đức) sử dụng hóa chat PCR High Fidelity (Thermo scientific) Sản phẩm PCR tinh kií GeneJet PCR purification dịng hóa vào vector pJET1.2/blunt (Thermo scientific) Các piasmid tái tổ hợp sau khỉ kiểm tra có chứa gen mong muốn giải trình tự theo nguyên lý Sanger máy ABI 3730XL, sử dụng phần mềm Bioeđit Genious R7 để xử lý, nối ghép tạo trinh tự tồn gen đích, so sánh phân tích trinh tự thu với trình tự tham chiếu Genbank Multiplex PCR chứa chứng nội tại: Từ kết giải trình tự, phản ứng FCR đa mồi chứa chứng nội ổược thiết kế đề phát xác chủng B anthracis gây bệnh tự nhiên Chứng nội bồ suríg vào mẫu q trình tách chiết DNA với nồng độ khác để xác định lượng tối thiểu vừa đủ phát Các thử nghiệm tiến hành song song với mẫu không chứa IC để so sánh mẫu đối chửng âm (nước deion) để kiểm soát ngoại nhiễm nhiễm chéo Phản ứng mPCR có thành phần sau: 1X Dream Taq Buffer; 2t0U Dream Taq Polymerases; dNTPs 0,25 mM ioại; 0,6-0,64 (aM mồi xuôi, mồi ngược loại, khoảng 10 ng DNA khuôn, điều chỉnh H20 đủ thể tích 25 Ị i l (Thermo scientific) Chu trinh mPCR thiết kế: Biền tính 94oC/4 phút, !à 30 chu kỳ (940C/45 giây; 56oC/40 giây; 72oC/40 giây), sau hồn thành keo dài chuỗi 72° phút Sản phẩm mPCR điện dí kiểm tra gel agarose 1,5% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide chụp ảnh ánh sáng u v (UVP Eppendorf) Cơng trình thực Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học Bộ môn Khoa Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y từ tháng 05/2014 đến tháng 02/2015 KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u Nghiên cứu trình tự gen đặc trưng gen độc lực B anthracis Gen vrrA (chromosome): Kết phân tích tồn gen vrrA 10 chủng B anthracis nghiên cứu cho thấy gen vrrA giống hồn tồn trình tự nucleotide chủng B arìthracis tương đồng từ 99-100% so vởi chủng tham chiếu So với chủng B anthracis Vollum-USA, trình tự gen vrrA chủng phân lập Việt Nam sai khác nucleotide (thêm nucleotide A vị trí 346) Gen pagA, cya, !ef (pX01): Ket phân tích tồn trình tự gen pagA chủng than gây bệnh xác định đột biến điểm (T-»C), gồm đột biến đồng nghĩa (T-»C)195 đột biến sai nghĩa (T~>C)1693, (T ^ C )Í7 9 so sánh với trình tự tham chiếu B anthracĩs Volium-USA Chỉ xác định đột biến đồng nghĩa (T~»C)600 gen cya chủng B anthracis Ba3 Ba4 Đột biến trước tìm thấy chủng B aníhracis A2012, 481 Ames Ancestor, BFV Trong đó, gen ief có trình tự giống tương đồng 100% so vởỉ chủng tham chiếu Gen capA, capB, capC (pX02): Trên pX02, đột biến sai nghĩa hoàn toàn (A->G)1048 xác định gen capA chủng B anthràcis Ba1 làm thay đồi amino acid lysine íhành aiuíamic Đây !à đột biến 1010 í 1020 trước chưa tìm thấy nghiên cứu giới khẳng định đay ià đột biến mới, phát chủng Việt Nam (Ba1) (Hình 1) Hai gen cịn lại capB, capC cổ tính bảo tồn cao, khong xảy đột biến điềm chùng nghiên cứu Í0 1040 -.0 1060 1070 1080 - I I I I 1050 I • • • • ! • • • • ! 1100 -•••!■■'•