NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ MỘT SỐ GEN ĐỘC LỰC CỦA YERSINIA PESTIS VÀ PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR XÁC ĐỊNH YERSINIA PESTIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM Đinh Thị Thu Hằng*; Nguyễn Thái Sơn**; Nguyễn Văn An** Cao Thị Dinh***; Triệu Thị Nguyệt*** TÓM TẮT Mục tiêu: xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể [NST]), pla, caf1 (trên hai plasmid độc lực pPCP1 pMT1) chủng vi khuẩn (VK) Yersinia pestis Yp1 phân lập Việt Nam phát triển kỹ thuật PCR đa mồi xác định nhanh, xác Y pestis gây bệnh Vật liệu phương pháp: chủng Y pestis Yp1 có đầy đủ độc lực lưu giữ “Ngân hàng Chủng Gen” Học viện Quân y Toàn chiều dài gen ypo2088, pla caf1 sau khuếch đại xác tách dòng phân tích trình tự Từ kết phân tích trình tự kết hợp với trình tự chủng tham chiếu Ngân hàng Gen, cặp mồi ypo2088F/R, plaF/R caf1F/R thiết kế để khuếch đại đồng thời gen đích tương ứng phản ứng PCR đa mồi xác định VK dịch hạch gây bệnh Kết kết luận: tách dòng phân tích trình tự đầy đủ gen ypo2088, pla caf1 chủng VK Y pestis Yp1 phân lập Việt Nam Xác định đột biến sai nghĩa gen pla, hai gen lại có mức độ tương đồng 100% so sánh với trình tự tham chiếu (mã số CP000900) Kết lần chứng minh, trình tự gen ypo2088, pla caf1 ổn định, khác biệt đáng kể chủng Y pestis Trình tự đầy đủ gen đăng ký Ngân hàng Gen Quốc tế với mã số KM880027, KM880025 KM880026 Đã thiết kế thành công phản ứng PCR đa mồi khuếch đại đồng thời gen đích xác định xác VK dịch hạch gây bệnh * Từ khóa: Caf1 (F1 capsule antigene); Độc lực; PCR đa mồi; Yersinia pestis Study on the Complete Sequences of Virulence Genes of Yersinia Pestis and Development of a Multiplex PCR Assay for Detection of Pathogenic Yersinia Pestis in Vietnam Summary Objectives: Sequence analysis of the entire ypo2088 gene (within bacterial chromosome), pla and caf1 genes (on the virulence plasmids pPCP1 and pMT1) of the pathogenic Yersinia pestis strain Yp1 isolated in Vietnam and development of a multiplex PCR assay for rapid and accurate detection of pathogenic Y pestis Materials and methods: Y pestis strain Yp1 with full virulence was provided by Strain and Gene Bank of Vietnam Military Medical University Total DNA was extracted from culture media following autoclaved inactivation Subsequently, full-length ypo2088, * Học viện Quân y ** Bệnh viện Quân y 103 *** Đại học Khoa học tự nhiên Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com) Ngày nhận bài: 02/03/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 16/03/2015 Ngày báo đăng: 31/03/2015 57 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 pla and caf1 genes were amplified using high-fidelity PCR The purified PCR products were cloned in pJET1.2/blunt by conventional recombinant methods and they were sequenced from both ends According to these sequencing results and the reference sequences in Genbank, three primer pairs, including ypo2088F/R, plaF/R and caf1F/R, were designed in a multiplex PCR assay for detection of pathogenic Y pestis Results and conclusions: One missense mutation was identified in pla gene, two remaining genes were found to be 100% similar in sequence to the reference sequences of Y pestis Angola (accession number KP000900) These results again demonstrate that ypo2088, pla, caf1 gene sequences are very conservative, with no significant difference among Y pestis strains The complete sequences of these genes were submitted to Genbank with accession number KM880027, KM880025 and KM880026, respectively A multiplex PCR assay that amplifies these three target genes was successfully developed for rapid and accurate detection of pathogenic Y pestis * Key words: Caf1 (capsule fraction gene); Multiplex PCR; pla (plasminogen gene); Yersinia pestis ĐẶT VẤN ĐỀ Y pestis VK Gram âm, không sinh bào tử thuộc chi Yersinia - họ Enterobacteriaceae Trong 11 loài thuộc chi Yersinia, có ba loài gây bệnh người Y pestis, Y pseudotuberculosis Y enterocolitica Loài nguy hiểm nhất, Y pestis gây bệnh dịch hạch viêm phổi cấp tính phân biệt với hai loài lại [8, 10] Tiềm hủy diệt dịch hạch chứng minh qua thùc tÕ lµ 200 triệu ca tử vong lịch sử, dẫn đầu danh sách bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Theo Tổ chức Y tế Thế giới, từ 1989 đến 2003, giới ghi nhận 38.310 ca nhiễm 2.845 ca tử vong, tập trung chủ yếu châu Phi châu Á - nơi thiếu chưa đáp ứng đầy đủ hệ thống giám sát, sở chẩn đoán hay báo cáo dịch [5] Đặc biệt, năm gần đây, mối quan tâm VK dịch hạch đặt mức cao, khả sử dụng Y pestis loại vũ khí sinh học [8] Trên giới, toàn hệ gen số chủng chuẩn Y pestis KIM5 58 (thuộc biovar Mediaevalis), CO92 (chủng biovar Orientalis) giải trình tự, tạo thuận lợi cho nghiên cứu, xác định Y pestis [9] Genome Y pestis (chủng CO92) bao gồm “NST” 4,65 Mb ba plasmid pLcr, pPCP1 pMT1 Ngoài sản phẩm hệ gen NST, yếu tố độc lực Y pestis gen plasmid đảm nhiệm Trong đó, pPCP1 pMT1 plasmid xác định có riêng Y pestis [8] pPCP1 (kích thước 9,6 kb), có gen quan trọng pla mã hóa chất hoạt hóa plasminogen Pla, đóng vai trò quan trọng khả xâm nhập Y pestis vào thể qua da [4] Plasmid lại pMT1 có kích thước tương đối lớn (110 kb) tiêu biểu với gen mã hóa cho kháng nguyên vỏ F1, gen biểu phospholipase D (PID), hai có vai trò lây lan dịch hạch [8] Ở Việt Nam, bệnh dịch hạch xuất rải rác khu vực Tây Nguyên Gia Lai, ĐắK Lắk [5] Nghiên cứu Y pestis bệnh dịch hạch chủ yếu tập trung dịch tễ học, thống kê, TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 giám sát bệnh sở vùng sinh thái Những kết nghiên cứu phân tử VK dịch hạch hạn chế đơn lẻ số gen đích [1, 5] Nghiên cứu tách dòng giải trình tự toàn gen đặc trưng NST - ypo2088 gen độc lực plasmid pPCP1, pMT1 tương ứng pla caf1 chủng Y pestis Yp1 phân lập Việt Nam Đồng thời, nhóm tác giả phát triển kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) sử dụng gen đích để xác định xác VK dịch hạch có độc lực tự nhiên Nghiên cứu góp phần làm phong phú thêm kết đa dạng di truyền gen độc lực VK dịch hạch cung cấp công cụ phân tử hữu hiệu cho phép chẩn đoán nhanh xác Y pestis có độc lực VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chủng vi khuẩn Chủng Y pestis Yp1 có độc lực chủng đối chứng âm E coli ATCC 25922 Ngân hàng Chủng Gen Học viện Quân y cung cấp, xác định đặc điểm hình thể, tính chất sinh vật hóa học card định danh GN46 (Vitek - BioMérieux) thử nghiệm độc lực chuột nhắt trắng để khảo sát khả gây chết hàng loạt Tách chiết ADN PCR Chủng VK bất hoạt điều kiện 121oC/20 phút, sau tách ADN tổng số theo quy trình nhà sản xuất (ADN genome QIAGen minikit) Thiết kế cặp mồi tách dòng dựa trình tự gen ypo2088, pla caf1 Ngân hàng Gen tổng hợp IDT (Mỹ) Sử dụng sinh phẩm Phusion High-Fidelity ADN polymerase (Thermo scientific) để phân lập gen đích với chu trình nhiệt, nhiệt độ gắn mồi TaoC thời gian kéo dài chuỗi sau: biến tính 98oC 30 giây, khuếch đại 30 - 32 chu kỳ (98oC, giây; TaoC, 20 giây; 72oC, 30 - 35 giây), sau hoàn thành kéo dài chuỗi 72º phút Trong đó, nhiệt độ gắn mồi Ta oC thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào trình tự mồi kích thước sản phẩm Bảng 1: Thông tin mồi sử dụng nghiên cứu TÊN MỒI MỤC ĐÍCH TRÌNH TỰ (5’-3’) NHIỆT ĐỘ GẮN KÍCH MỒI (Ta: oC) THƯỚC (bp) PCR/giải trình tự ypo2088F/BamHI PCR GGGATCCGTGATGATTAAGTTCATGCT 52 719 PCR/giải trình tự CCTCGAGGTCTGTATTGCTGAGAAAAG 52 719 plaF/EcoRI PCR CGAATTCGCAGAGAGATTAAGGGTGT 57 1019 plaR/XhoI PCR ACTCGAGTTCCACAGACATCCTCCC 57 1019 caf1F/BamHI PCR AGGATCCGGACACAAGCCCTCTCTAC 60 654 ypo2088R/XhoI 59 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 caf1R/XhoI PCR TCTCGAGCGAGGGTTAGGCTCAAAGT 60 654 pJET1.2_F Giải trình tự CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC 58 - pJET1.2_R Giải trình tự AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG 58 - GGATGAGATAACGCGGGTGT-F 56 103 56 438 56 271 mPCR ypoF1/R1 mPCR AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R plaF1/R1 mPCR CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R cafF1/R1 mPCR CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R Tách dòng giải trình tự gen Multiplex PCR Tiến hành nối ghép trực tiếp sản phẩm Tham khảo trình tự gen ypo2088, PCR tinh gen ypo2088, pla pla caf1 chủng VK dịch hạch caf1 với vector tách dòng pJET1.2/blunt Ngân hàng Gen kết hợp với kết giải nhờ T4-ligase (Thermo scientific) Sản trình tự nghiên cứu này, cặp mồi phẩm nối ghép biến nạp vào tế tương ứng với gen đích bào khả biến E coli DH5 (Invitrogen) thiết kế phản ứng PCR đa mồi xác phương pháp sốc nhiệt Tiến hành kiểm tra thể tái tổ hợp PCR khuẩn lạc (PCR colony), cắt enzym hạn chế AvaI XbaI (Thermo scientific) Xác đinh trình tự gen đích theo hai chiều theo phương pháp Sanger với mồi vector pJET1.2F/R mồi khuếch đại (bảng 1) Sử dụng phần định Y pestis có độc lực (bảng 1) Thành phần mPCR sau: 1,2X Dream Taq Buffer; 0,25 mM dNTPs; MgCl2 0,6 mM; 0,25 μM mồi xuôi, mồi ngược loại; Dream Taq 0,8U; ~ 10 ng ADN khuôn, điều chỉnh H2O đủ thể tích 25 μl Chu trình nhiệt: biến tính 94oC/4 phút, 30 chu kỳ (94oC/30 giây; 56oC/30 giây; 72oC/30 giây), sau hoàn thành mềm Bioedit Genious R7 để xử lý, kéo dài chuỗi 72º phút Sản nối ghép tạo trình tự toàn gen phẩm mPCR điện di kiểm tra ypo2088, pla, caf1, so sánh phân tích gel agarose 1,5% TBE 0,5X; nhuộm ethidium trình tự xác định với trình tự bromide quan sát hệ thống soi Ngân hàng Gen gel Dolphin-DOC 60 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tách dòng giải trình tự toàn gen ypo2088, pla caf1 Hình 1: Kết kiểm tra sản phẩm tổng hợp gen đích Phusion ADN polymerase gel agrose 1,2% a) M: Thang ADN chuẩn 100 bp (Thermo Scientific); 1: Sản phẩm tổng hợp gen ypo2088 b) M: Thang ADN chuẩn kb (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm tổng hợp gen pla, caf1 ADN tổng số chủng Y pestis Yp1 dùng để phân lập gen ypo2088, pla caf1 PCR sử dụng Phusion HighFidelity ADN polymerase với cặp mồi tách dòng tương ứng Điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 1,2% (hình 1) cho thấy, sản phẩm khuếch đại đặc hiệu, thể band đậm, rõ nét, band phụ, kích thước tương đương với tính toán lý thuyết Theo thiết kế, khuếch đại thành công, gen sử dụng cặp mồi ypo2088F/R, plaF/R cafF/R cho sản phẩm có kích thước tương ứng 645, 1019 654 bp, tương đương với kích thước sản phẩm PCR gel điện di Việc lựa chọn gen đặc trưng Y pestis NST ypo2088 gen độc lực pla, caf1 plasmid tham 61 khảo từ số nghiên cứu giới [4, 7, 10] Nhóm nghiên cứu phân lập toàn chiều dài gen để phân tích trình tự chủng VK dịch hạch có độc lực Việt Nam nhằm xác định có sai khác trình tự nucleotid với chủng Y pestis có độc lực giới Như vậy, từ kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen đích gen độc lực Y pestis kết luận, bước đầu khuếch đại thành công gen ypo2088, pla caf1 chủng Y pestis Yp1 phân lập Việt Nam Sau tinh sạch, sản phẩm PCR gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt Plasmid tái tổ hợp chứa gen đích mong muốn, kiểm tra PCR colony enzym hạn chế AvaI XbaI (hình 2) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Hình 2: Kết kiểm tra ADN plasmid từ dòng khuẩn lạc gel agarose 1,2% a Kết PCR colony, M: Thang ADN chuẩn kb (Thermo Scientific); - 4: Các dòng khuẩn lạc - với gen pla; - 8: Các dòng khuẩn lạc - với gen caf1 b Kết cắt kiểm tra cặp enzym hạn chế AvaI XbaI, M: Thang ADN chuẩn kb (Thermo Scientific); - 4: Sản phẩm cắt dòng khuẩn lạc - mang plasmid pJET1.2-pla c Kết cắt kiểm tra cặp enzyme hạn chế AvaI XbaI, M: Thang ADN chuẩn kb (Thermo Scientific); 1, 2: Sản phẩm cắt dòng khuẩn lạc 1, mang plasmid pJET1.2-caf1 Hình 2: minh họa kết kiểm tra thể tái tổ hợp chứa gen đích pla caf1 Thực PCR colony với cặp mồi vector pJET1.2F/R, theo tính toán lý thuyết, đoạn ADN gen đích gắn vào vector thành công tổng kích thước sản phẩm PCR colony kích thước gen đích thêm chiều dài 118 bp (là kích thước đoạn ADN vector tính từ đầu mồi pJET1.2F/R đến đầu đa điểm cắt - Multiple Cloning Site) Hình 2a cho thấy, với gen pla, có dòng khuẩn lạc 1, có sản phẩm band rõ nét, kích thước khoảng 1,1 kb (tương ứng với tính toán lý thuyết 1.137 bp) Tương tự với gen caf1, kích thước sản phẩm PCR colony 772 bp, với hình điện di kiểm tra dòng khuẩn lạc Kết cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp cặp enzym hạn chế AvaI XbaI cho sản phẩm có 62 kích thước lý thuyết Kết lần n÷a khẳng định dòng khuẩn lạc - (với gen pla) dòng khuẩn lạc 1, (với gen caf1) chứa gen đích mong muốn (hình 2b), vector chứa gen pla, đường chạy số - cho sản phẩm có kích thước khoảng 2,9 kb (kích thước vector) 1,1 kb (gen pla) Với hình 2c vector chứa gen caf1, sản phẩm cắt kiểm tra band rõ nét có kích thước tính toán đường chạy số Sở dĩ xuất band có kích thước khoảng 0,2 0,4 kb band 2,9 kb (vector) trình tự gen caf1 chứa trình tự nhận biết XbaI Như vậy, dòng khuẩn lạc - (đối với gen pla), dòng 1, (đối với gen caf1) mang plasmid chứa gen đích tương ứng Các gen đích tách dòng thành công vector pJET1.2/blunt TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Kết giải trình tự gen đích vector tách dòng cho thấy, gen ypo2088 caf1 chủng Y pestis Yp1 có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu Ngân hàng Gen Chỉ có đột biến điểm xác định gen pla (TC)836 so sánh với trình tự gen tương ứng chủng Y pestis Angola mã số CP000900 (vị trí nucleotid đột biến tính theo trình tự nucleotid gen pla chủng Y pestis Angola) Hình 3: So sánh trình tự nucleotid gen pla chủng Y pestis Yp1 với chủng tham chiếu Ngân hàng Gen (đoạn nucleotid có xảy đột biến) Các chủng tham chiếu ký hiệu theo thứ tự mã số, tên chủng/phân lập, dấu chấm biểu thị nucleotid giống nhau, có đột biến biểu thị nucleotid Sự xuất đột biến điểm tìm thấy chủng tham chiếu lựa chọn Y pestis CO92, biovar Medievalis Kim5 Đây đột biến sai nghĩa, làm thay đổi axít amin isoleucine thành threonine Thay đổi từ axít amin không phân cực (Isoleucine) thành axít amin phân cực (Threonine) có ý nghĩa định Tuy nhiên, để tìm hiểu thêm cần có công trình nghiên cứu protein tái tổ hợp Như vậy, từ kết nghiên cứu kết luận, tách dòng xác định trình tự đầy đủ gen ypo2088, pla caf1 chủng Y pestis Yp1 phân lập Việt Nam Trình tự gen đăng ký Ngân hàng Gen với mã số KM880027, KM880025 KM880026 Thiết kế phản ứng multiplex PCR Phản ứng mPCR thiết kế với cặp mồi ypo2088F/R, plaF/R caf1F/R 63 để xác định có mặt gen tương ứng đặc trưng cho Y pestis gây bệnh Những chủng Y pestis chứa đầy đủ gen tự nhiên xác định đầy đủ độc lực Để thực phản ứng mPCR, cặp mồi phát thiết kế có chiều dài nhiệt độ gắn mồi tương đương Nồng độ cặp mồi tối ưu (0,25 mM mồi xuôi, mồi ngược loại), sau thực phản ứng PCR đơn gen tương ứng Khảo sát gradient nhiệt độ gắn mồi từ 52 - 60oC, lựa chọn nhiệt độ gắn mồi tối ưu 56 oC Sản phẩm phản ứng mPCR khuếch đại đồng thời gen đích VK dịch hạch có kích thước 103, 438 271 bp xác định gen tương ứng ypo2088, pla caf1, dễ dàng phân biệt điện di agarose 1,5% (hình 4) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 canh khuẩn VK dịch hạch (với lượng 50 - 100 cfu/phản ứng) Kết mPCR với mẫu Y1 không xuất band đích nào, cho thấy mẫu âm tính với Y pestis Còn mẫu Y2 xuất đầy đủ band có kích thước với mẫu đối chứng (+), xác định mẫu Y pestis có đầy đủ độc lực Khi dịch bệnh xảy ra, việc xác định nhanh xác mầm bệnh nghi ngờ cần thiết để tránh nhầm lẫn với loài không gây bệnh có quan hệ gần gũi Hình 4: Hình ảnh điện di xác định VK Y pestis có độc lực PCR đa mồi gel agarose 1,5% [7] Phương pháp PCR sử dụng đích gen M: Marker 100 bp (Thermoscientific), ĐC (-): Đối chứng âm sử dụng chủng E coli ATCC 25922; ĐC(+): Đối chứng dương sử dụng plasmid tái tổ hợp chứa gen pla, caf1 ypo2088; Y1, Y2: Các mẫu cần kiểm tra giả giới xác định vùng gen Trong phản ứng mPCR này, đối chứng âm sử dụng VK E coli chủng ATCC 25922 để kiểm tra phản ứng chéo E coli VK phân bố rộng rãi tự nhiên, họ VK đường ruột với Y pestis Hình cho thấy, mẫu đối chứng (-) không xuất band Trong đó, mẫu đối chứng dương plasmid tái tổ hợp chứa gen ypo2088, pla, caf1 thông qua tách dòng cho sản phẩm mPCR band có kích thước với đoạn gen tương ứng cần khuếch đại Mẫu kiểm tra Y1 Y2, mẫu môi trường đất gây nhiễm giả định Với mẫu Y1 mẫu đất thông thường không gây nhiễm mẫu Y2 mẫu đất có gây nhiễm 64 đặc trưng, gen độc lực cho Y pestis để chẩn đoán lựa chọn khả thi Một số tác NST đặc trưng cho Y pestis, từ thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho PCR chứng minh không xảy phản ứng chéo với loài có quan hệ gần gũi [2, 8] Những gen đặc trưng có ưu điểm: chúng nằm NST (bền), có mặt VK đích (tránh tượng dương tính giả), xuất tất chủng (loại bỏ tượng âm tính giả) Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu trước tập trung vào việc xác định gen độc lực hai plasmid đặc trưng Y pestis pPCP1 pMT1 Trên thực tế, nhiều trường hợp plasmid không bền thao tác di truyền, có chủng tự nhiên hay nhiều plasmid [10] Như vậy, việc xác định chủng Y pestis có độc lực tự nhiên cần kết hợp gen đích NST TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 gen plasmid độc lực cho kết xác định nhanh, xác VK Y pestis có chẩn đoán xác Với phản ứng độc lực tự nhiên mPCR này, nhóm tác giả sử dụng đồng thời cặp mồi xác định có mặt KẾT LUẬN gen đích pla, caf1, ypo2088 Đã tách dòng giải trình tự thành Trong đó, pla caf1 gen đích thường công toàn chiều dài gen ypo2088, sử dụng để xác định Y pestis pla caf1 chủng VK Y pestis Yp1 Ngoài ra, gen pla thường có 150 - 200 phân lập Việt Nam Xác định copy/tế bào, đặc điểm đột biến sai nghĩa (TC)836 làm thay đổi tăng tính nhạy phản ứng PCR [3] axít amin (IsoleucineThreonine) Điều quan trọng nữa, pla định tính gen pla, hai gen lại có mức độ tương độc Y pestis đường lây truyền đồng 100% so sánh với trình tự tham qua da; chủng VK thiếu gen pla chiếu Kết phù hợp với có độc lực thấp [4] Gen caf1 mã hóa nghiên cứu giới cho thấy trình tự kháng nguyên vỏ F1 (fraction 1), có tác gen ypo2088, pla caf1 bền vững, dụng giúp cho Y pestis không bị hấp thu khác biệt đáng kể đại thực bào [8] Việc xác định có chủng Y pestis Thiết kế thành công phản mặt gen cho phép khẳng ứng mPCR khuếch đại đồng thời gen định tính độc chủng Y pestis đích, xác định xác VK dịch hạch có tự nhiên Gen đích đặc trưng thứ ba độc lực, có ý nghĩa phát sớm sử dụng công trình thuộc dự phòng dịch bệnh NST ypo2088 mã hóa cho putative methyltransferase, 28 marker Zhou CS xác định [10] Trước đây, nhà khoa học sử dụng gen pla để phát Y pestis mẫu lâm sàng Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu ra, có tỷ lệ chủng Y pestis bị gen pla định vị plasmid có kích thước tương đối nhỏ Vì vậy, việc sử dụng thêm ypo2088 - gen đích nằm NST, đặc trưng cho Y pestis ưu tiên lựa chọn, cho phép chẩn đoán xác VK dịch hạch [4, 6] Với kết trên, phản ứng mPCR thiết kế 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thanh Hòa, Nguyễn Thị Bích Nga, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đỗ Ngọc Khuê Xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh VK dịch hạch (Yersinia pestis) từ mẫu đất nước nhiễm khuẩn Tạp chí Nghiên cứu Y học 2005, 38 (5), tr.1-6 Chain P S G, Carniel E, Larimer F W et al Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole-genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2004, 101 (38), pp.13826-13831 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 Leal N C, Almeida A M Diagnosis of plague and identification of virulence markers in Yersinia pestis by multiplex-PCR Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1999, 41 (6), pp.339-342 Matero P, Pasanen T, Laukkanen R et al Real-time multiplex PCR assay for detection of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis APMIS 2009, 117 (1), pp.34-44 Pham H V, Dang D T, Tran Minh N N et al Correlates of environmental factors and human plague: an ecological study in Vietnam Int J Epidemiol 2009, 38 (6), pp.1634-1641 Radnedge L, Agron P G, Worsham P L et al Genome plasticity in Yersinia pestis Microbiology 2002, 148 (Pt 6), pp.1687-1698 Radnedge L, Gamez-Chin S, McCready P M et al Identification of nucleotide sequences for the specific and rapid detection of Yersinia pestis Appl Environ Microbiol 2001, 67 (8), pp.3759-3762 Rollins S E, Rollins S M, Ryan E T Yersinia pestis and the plague Am J Clin Pathol 2003, 119 Suppl, pp S78-85 Thoerner P, Bin Kingombe C I, Bogli-Stuber K et al PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution Appl Environ Microbiol 2003, 69 (3), pp.1810-1816 10 Zhou D, Han Y, Dai E et al Identification of signature genes for rapid and specific characterization of Yersinia pestis Microbiol Immunol 2004, 48 (4), pp.263-269 63 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2015 64