Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời bacillus anthracis và yersinia pestis (tt)

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Bacillus anthracis Yersinia pestis hai loài vi khuẩn gây bệnh tối nguy hiểm tương ứng bệnh than dịch hạch, gây nên nỗi kinh hoàng lịch sử lồi người, bị lợi dụng làm vũ khí sinh học Ở Việt Nam, B anthracis xuất rải rác tỉnh miền núi phía Bắc, Y pestis tồn số loài gặm nhấm khu vực Tây Nguyên bùng phát thành dịch lúc Mặt khác, cần có phương án ứng phó nhanh, kịp thời phòng chống khủng bố sinh học Trong vụ cơng nghi ngờ có khủng bố sinh học hay mẫu môi trường nghi nhiễm mầm bệnh này, việc phát nhanh, xác tác nhân sinh học yếu tố định đến sức khỏe cộng đồng an ninh quốc gia Việc sàng lọc nhanh mẫu nghi ngờ giúp kiểm soát lây lan đảm bảo điều trị xác Phương pháp nuôi cấy truyền thống xem “tiêu chẩn vàng” xác định B anthracis Y pestis Tuy nhiên, có độ nhạy cao, phương pháp đòi hỏi thời gian - ngày, số trường hợp độ đặc hiệu không cao, cần tiến hành thử nghiệm bổ sung Ngoài ra, phương pháp cần tiến hành điều kiện phòng an tồn sinh học cấp (BSL-3) với nhân viên đào tạo có kinh nghiệm Các phương pháp miễn dịch nghiên cứu dạng que thử nhanh thuận tiện độ nhạy, độ đặc hiệu thấp Do đó, phương pháp khó ứng dụng chẩn đốn thực địa phòng chống khủng bố sinh học Hiện nay, có số kỹ thuật dựa PCR dùng để xác định nhanh xác B anthracis Y pestis phát triển với ưu điểm bật độ nhạy, độ đặc hiệu cao thực với mẫu bất hoạt (nên cần thực điều kiện phòng an tồn sinh học cấp 2) Tuy nhiên, hầu hết kỹ thuật phát loại plasmid độc lực với tác nhân nên không phát trường hợp chủng thiếu plasmid Đối với B anthracis tự nhiên, để chẩn đốn xác chủng gây bệnh, ngồi gen đặc trưng nhiễm sắc thể, cần có mặt đầy đủ hai plasmid độc lực pXO1 pXO2 Trong thực tế có chủng B anthracis thiếu hai plasmid nên khả gây bệnh thay đổi Tương tự, Y pestis chứa hai plasmid liên quan đến tính độc pPCP1 pMT1 với gen đặc trưng tương ứng Do đó, kỹ thuật khơng đánh giá đầy đủ tình trạng độc lực B anthracis, Y pestis phải phụ thuộc vào thiết bị chuyên dụng đắt tiền bỏ sót chẩn đốn, chưa đề cập đến chúng khơng phù hợp với số chủng nước Ở Việt Nam, việc sử dụng kỹ thuật dựa PCR để chẩn đoán B anthracis Y pestis số tác giả công bố, nhiên nghiên cứu dừng việc thiết kế kỹ thuật PCR để chẩn đoán loại vi khuẩn Điều có nghĩa thực tế bệnh dịch xảy mà chưa biết tác nhân sử dụng, dùng PCR với tác nhân thứ cho kết âm tính phải dùng PCR lần thứ hai với tác nhân khác, đòi hỏi thời gian kinh phí Do đó, kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR mPCR) xác định xác đồng thời hai loại tác nhân B anthracis Y pestis lựa chọn khả thi Xuất phát từ vấn đề trên, thực đề tài: “Nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis Yersinia pestis” Mục tiêu nghiên cứu - Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis Yersinia pestis - Đánh giá khả phát kỹ thuật multiplex PCR mẫu chuẩn chủng phân lập Nội dung nghiên cứu đề tài - Thiết kế cặp mồi cho kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis - Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis - Đánh giá khả phát kỹ thuật mPCR chẩn đốn đồng thời B anthracis Y pestis phòng thí nghiệm chủng phân lập - Phân tích trình tự gen đích đặc trưng gen độc lực chủng B anthracis Y pestis Đóng góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam thành cơng nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis Kỹ thuật multiplex PCR với cặp mồi thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời sản phẩm bao gồm: gen đích vrrA (thuộc nhiễm sắc thể), pagA (thuộc plasmid pXO1), capA (thuộc plasmid pXO2) B anthracis; gen đích ypo2088 (thuộc nhiễm sắc thể), pla (thuộc plasmid pPCP1), caf1 (thuộc plasmid pMT1) Y pestis, gen chứng nội plasmid tái tổ hợp để xác minh kết chẩn đốn Do đó, khắc phục tượng dương tính giả trường hợp chủng vi khuẩn B anthracis Y pestis không đầy đủ độc lực, phân biệt với chủng gây bệnh, giúp giảm giá thành chẩn đoán so với việc phải thực lần PCR riêng rẽ, rút ngắn thời gian chẩn đoán Cấu trúc luận án Luận án gồm 139 trang, chia thành phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (30 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (14 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (47 trang); Chương 4: Bàn luận kết (21 trang); Kết luận kiến nghị (2 trang); Các cơng trình cơng bố tác giả (1 trang) Tóm tắt nội dung luận án tiếng Anh (6 trang), Tài liệu tham khảo (15 trang) Luận án có 16 bảng biểu, 44 hình 151 tài liệu tham khảo tiếng Việt tiếng Anh Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tài liệu nước vấn đề chính: (1) Tổng quan vi khuẩn B anthracis Y pestis: đặc điểm sinh học, hệ gen liên quan B anthracis, Y pestis vũ khí sinh học; (2) Các phương pháp xác định B anthracis Y pestis: phương pháp vi sinh truyền thống, xác định sinh hóa, dựa lực phương pháp dựa axit nucleic; (3) Kiểm định kit mPCR chẩn đoán B anthracis trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae Chi Bacillus gồm vi khuẩn Gram dương sinh bào tử, đa số không gây bệnh, số gây nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn (Bacillus cereus), số có lợi cho người (Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus mycoides) Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hố, tính chất ni cấy loài thuộc chi Bacillus giống Tuy nhiên, B anthracis có đặc điểm khác biệt với lồi trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, có plasmid pXO1 mã hóa kháng nguyên bảo vệ pXO2 mã hoá vỏ Y pestis thuộc chi Yersinia, họ Enterobacteriaceae Chi Yersinia có 11 lồi, vi khuẩn Gram âm, khơng sinh bào tử Trong chi Yersinia, có ba loài gây bệnh người Y pestis, Yersinia pseudotuberculosis Yersinia enterocolitica (Radnedge, 2001) Loài nguy hiểm nhất, Y pestis gây bệnh dịch hạch viêm phổi cấp tính Vũ khí sinh học trở thành mối quan tâm hàng đầu an ninh quốc gia bị tổ chức khủng bố lợi dụng chiến tranh sinh học Trong tác nhân WHO CDC nêu ra, B anthracis, Y pestis đánh giá tác nhân có nguy cao khủng bố gây bệnh nguy hiểm, dễ nuôi cấy, tăng sinh khối với số lượng lớn, không cần trang bị đại lại dễ sử dụng, vận chuyển gây nhiễm Ở Việt Nam có số nghiên cứu phòng chống chiến tranh sinh học đề phòng tình địch cơng vũ khí sinh học Sự quan tâm đặt mức đặc biệt với hai loại vi khuẩn B anthracis Y pestis Xác định tầm quan trọng việc xác định nhanh xác hai loại vi khuẩn này, đề tài KCB 01-09 số đề tài thiết kế phản ứng PCR chẩn đoán cho loại tác nhân Năm 2005, Lê Thanh Hòa cs nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đốn nhanh Y pestis loại mơi trường giả định Tuy nhiên, cơng trình dừng lại việc khẳng định Y pestis thông qua đoạn gen plasmid gây độc pPCP1 (Lê Thanh Hòa, 2005) Trên thực tế, số chủng Y pestis plasmid pPCP1 bị sản phẩm nghiên cứu không áp dụng (Marston, 2005) Hay nghiên cứu tách dòng đọc trình tự gen pagA mã hóa kháng nguyên bảo vệ từ chủng B anthracis VCM1167 (Phạm Thúy Kiều, 2006) Như vậy, nói đề tài B anthracis Y pestis Việt Nam riêng lẻ cho loại tác nhân Do đó, việc nghiên cứu phát triển kỹ thuật mPCR xác định nhanh xác đồng thời hai tác nhân nguy hiểm cấp thiết, đáp ứng yêu cầu an ninh quốc phòng phòng chống dịch bệnh Kỹ thuật mPCR phát triển nhằm xác định đồng thời B anthracis Y pestis cách xác việc sử dụng cặp mồi thiết kế nhiễm sắc thể, đồng thời sử dụng cặp mồi để phát gen độc lực plasmid Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ Các chủng vi khuẩn, plasmid Chủng chuẩn B anthracis 17JB (ký hiệu: Ba) Y pestis SVCM7 (ký hiệu: Yp) đầy đủ độc lực Chủng chuẩn đối chứng âm: Bacillus cereus ATCC 6464, E coli ATCC 25922, Y enterocolitica ATCC 27729 Các chủng vi khuẩn phân lập nghi ngờ B anthracis: gồm 23 chủng B anthracis Ba1-Ba23; chủng Y pestis Yp1, Yp2 Plasmid pJET1.2-capA chứa tồn trình tự gen capA (thuộc plasmid pXO1) B anthracis Sinh phẩm, hố chất, thiết bị: Sinh phẩm, hóa chất sử dụng thí nghiệm đặt mua từ hãng: Thermo Scientific, Integrated DNA Technologies- IDT, Qiagen, Norgen, bioMérieux, Biolabs, Gibco, Invitrogen Các trang thiết bị Bộ môn Vi sinh y học, Trung tâm Nghiên cứu Y Dược học Qn sự, Học viện Qn y Phòng Cơng nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nghiên cứu thiết kế theo phương pháp thực nghiệm mơ tả, phân tích phòng thí nghiệm thực địa với kỹ thuật vi sinh kinh điển sinh học phân tử Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu gồm: 2.2.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 2.2.2 Tách chiết DNA tổng số 2.2.3 Khuếch đại gen PCR 2.2.4 Điện di DNA gel agarose 2.2.5 Tinh DNA 2.2.6 Thiết kế kỹ thuật mPCR xác định đồng thời gen đặc trưng gen độc lực B anthracis Y pestis 2.2.7 Tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis 2.2.8 Thiết kế chứng nội tái tổ hợp kỹ thuật mPCR 2.2.9 Tối ưu kỹ thuật mPCR chứa chứng nội 2.2.10 Thiết lập đánh giá mẫu chuẩn đánh giá độ nhạy, đặc hiệu ổn định kit mPCR 2.2.11 Xác định chủng phân lập nuôi cấy, định danh 2.2.12 Thử nghiệm kỹ thuật mPCR chủng phân lập 2.2.13 Kiểm tra chủng vi khuẩn giải trình tự Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B anthracis VÀ Y pestis 3.1.1 Nghiên cứu thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho mPCR Kỹ thuật mPCR lý tưởng để xác định đồng thời B anthracis Y pestis phải thiết kế phát đồng thời B anthracis, Y pestis đánh giá đầy đủ mức độ độc lực khác chúng tự nhiên Trong đó, với B anthracis cần cặp mồi nhiễm sắc thể (lựa chọn gen vrrA) cặp mồi plasmid pXO1 pXO2 tương ứng gen pagA capA Tương tự, với Y pestis, gen ypo2088 (trên nhiễm sắc thể), pla (pPCP1) caf1 (pMT1) lựa chọn Như vậy, cặp mồi đặc hiệu cho mPCR thiết kế đảm bảo khuếch đại gen đích kích thước khác Với gen vrrA, dựa vào trình tự tham chiếu NCBI, thiết kế cặp mồi cho khuếch đại phần trình tự gen đích (Hình 3.2) Cặp mồi gen vrrA chưa lựa chọn phụ thuộc vào kết thiết kế cặp mồi cho gen đích lại Tương tự cho thiết kế cặp mồi gen pagA, capA (B anthracis) ypo2088, pla, caf1 (Y pestis) Sau kiểm tra khả hình thành cấu trúc bậc hay bắt cặp chéo mồi phù hợp kích thước sản phẩm, cặp mồi lựa chọn vrrA Hình Thông tin cặp mồi khuếch đại gen vrrA Bảng Thông tin cặp mồi mPCR xác định B anthracis Y pestis Tên mồi Trình tự (5’-3’) Tổng số base Tm* Kích thước (bp) vrrAF1/R1 CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA-F CCTCGCGCACTTCTTTTTCT-R 20 59.76 59.13 222 pagAF1/R1 AAATGGAGCACGGCTTCTGA-F AGCCTGTATCCACCCTCACT-R 20 59.96 59.96 751 capAF1/R1 TGACGATGACGATGGTTGGT-F GCTTCCTGTCTAGGACTCGG-R 20 59.39 59.26 610 ypoF1/R1 GGATGAGATAACGCGGGTGT-F AGAGAATCGTGATGCCGTCC-R 20 59.90 59.90 103 plaF1/R1 CGGGATGCTGAGTGGAAAGT-F ATTACCCGCACTCCTTTCGG-R 20 60.04 60.11 438 cafF1/R1 CGCTTACTCTTGGCGGCTAT-F GCTGCAAGTTTACCGCCTTT-R 20 60.25 59.69 271 *Tm Nhiệt độ nóng chảy 3.1.2 Nghiên cứu thiết kế kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR thiết kế đánh giá chủng chuẩn có đầy đủ độc lực B anthracis Ba Y pestis Yp đối chứng âm B cereus E coli, Y enterocolitica 3.1.2.1 PCR đơn mồi phát gen vrrA, pagA, capA B anthracis Để có sở cho thiết kế kỹ thuật mPCR phát đồng thời gen đích B anthracis, PCR đơn mồi thực ban đầu giúp kiểm tra có mặt gen quan tâm độ đặc hiệu cặp mồi Hình Sản phẩm khuếch đại gen đích pagA, vrrA, capA B anthracis Ba PCR đơn mồi ĐC(-) Đối chứng âm nước khử ion; M Marker 100 bp (Thermo Scientific) Các gen pagA (751 bp), vrrA (222 bp) capA (610 bp) xuất băng đặc hiệu khơng có băng phụ (Hình 3.8) Như vậy, nồng độ thành phần, chu trình nhiệt PCR đơn mồi sử dụng cho mPCR 3.1.2.2 Kỹ thuật mPCR phát đồng thời gen vrrA, pagA, capA B anthracis Kỹ thuật mPCR khuếch đại đồng thời gen đích B anthracis 3.1.2.3 PCR đơn mồi phát gen ypo2088, pla, caf1 Y pestis PCR đơn mồi cho Y pestis thực tương tự, sản phẩm pla (438 bp), caf1 (271 bp), ypo2088 (103 bp) (Hình 3.10) Hình 10 Sản phẩm khuếch đại gen đích pla, caf1, ypo Y pestis Yp PCR đơn mồi ĐC(-) Đối chứng âm nước khử ion; M Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.4 Kỹ thuật mPCR phát đồng thời gen ypo2088, pla, caf1 Y pestis Kỹ thuật mPCR khuếch đại đồng thời gen đích Y pestis 3.1.2.5 Kỹ thuật mPCR với cặp mồi tác nhân Để kiểm tra cặp mồi tác nhân có bắt cặp chéo với DNA tác nhân lại, kỹ thuật mPCR với cặp mồi khuôn DNA B anthracis Y pestis thực Đường chạy Yp với khuôn DNA Y pestis xuất băng đích Y pestis Tương tự, đường chạy Ba xuất băng đích B anthracis (Hình 3.12) Như vậy, cặp mồi thiết kế đặc hiệu cho B anthracis, Y pestis khơng có tượng bắt cặp chéo bp ĐC(-) Yp Ba M bp Hình 12 Sản phẩm PCR với cặp mồi, loại DNA khuôn ĐC(-) Đối chứng âm nước khử ion; Yp Sản phẩm mPCR với khuôn DNA Y pestis; Ba Sản phẩm mPCR với khuôn DNA B anthracis; M Marker 100 bp (Thermo Scientific) 3.1.2.6 Kỹ thuật mPCR với cặp mồi tác nhân Kỹ thuật mPCR với cặp mồi loại khuôn thu băng đích Y pestis 3.1.3 Nghiên cứu tối ưu kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis Cần tối ưu thông số mPCR để đảm bảo xác định đồng thời B anthracis Y pestis như: nồng độ mồi, đệm, MgCl 2, dNTPs điều kiện chu trình nhiệt để thu đồng thời băng sản phẩm đích đặc hiệu Nồng độ mồi Y pestis 0,1 μM B anthracis 0,6 μM tối ưu mPCR (Hình 3.14) Hình 14 Tối ưu nồng độ mồi mPCR M Marker 100 bp (Thermo Scientific); 0,1 μM; 0,2 μM; 0,4 μM; 0,6 μM Với nhiệt độ gắn mồi 56oC, nồng độ MgCl2 dNTPs tối ưu tương ứng 0,6 mM 0,25 mM, phản ứng mPCR cho kết băng đặc hiệu rõ nét Nồng độ dung dịch đệm khảo sát mức (1; 1,2; 1,4; 1,5X), nồng độ 1,2X lựa chọn 3.1.4 Nghiên cứu thiết kế chứng nội tái tổ hợp kỹ thuật mPCR Trong chẩn đoán phân tử, chứng nội (Internal amplification control - IC) cần thiết để loại trừ trường hợp âm tính giả q trình tách chiết khơng hiệu hay chất ức chế ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR Do đó, song song với việc thiết kế mPCR, thiết kế IC cho mPCR, đảm bảo kết chẩn đốn xác đường tái tổ hợp Q trình tạo dòng IC đạt kết sau: đoạn gen lef (IC1) phân lập từ B anthracis cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI, tạo dòng phụ vector pJET1.2-blunt, kiểm tra vector pJET1.2-IC1 tái tổ hợp PCR khuẩn lạc (Hình 3.18) Cặp enzyme BamHI NdeI sử dụng cắt đồng thời vector pJET1.2-IC1 pJET1.2-capA Đoạn IC1 (0,65 kb từ pJET1.2-IC1) phần lại vector pJET1.2-capA (~4 kb) tinh gel, nối ghép tạo thể tái tổ hợp pJET1.2capA-IC1 Plasmid kiểm tra enzyme giới hạn giải trình tự Plasmid chứa trình tự nhận biết cặp mồi capAF1/R1 nên khuếch đại mPCR, cho sản phẩm kích thước 1000 bp phân biệt với sáu sản phẩm gen chẩn đốn Hình 18 Phân lập gen lef cặp mồi IC1F-BamHI/R-NdeI tạo dòng phụ vector pJET1.2/blunt a) Sản phẩm khuếch đại gen lef (IC1) gel agarose 1,2%; M Marker 100 bp (Thermo Scientific); Sản phẩm khuếch đại gen lef b) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp PCR khuẩn lạc gel agarose 1,2%, M Marker kb (Thermo Scientific); 1-3 Các dòng khuẩn lạc 1-3 chứa Hình 20 Kiểm tra mPCR vector táibổtổsung hợp pJET1.2-IC1 IC trình tách chiết DNA nồng độ khác với mẫu B anthracis M Marker 100 bp (Thermo Scientific); 109-103 Các mức nồng độ IC tương ứng Để kiểm sốt tồn cơng đoạn xét nghiệm, IC bổ sung vào trình tách chiết với lượng tối thiểu phát nhằm loại bỏ tối đa ảnh hưởng đến hiệu tách chiết mPCR Kết cho thấy, băng chứng nội (1 kb) xuất rõ mức nồng độ plasmid từ 10 9-105 copy/ mẫu Ở mức nồng độ IC 106-105 copy/ mẫu xuất đầy đủ băng đích B anthracis băng IC Trong đó, băng IC xuất rõ nét, khơng bị smear quan trọng hơn, băng đích capA xuất Còn mức nồng độ IC 104 103 copy khơng xuất băng IC (Hình 3.20) Qua trình tối ưu mẫu B anthracis, Y pestis, mPCR-IC cho băng đích rõ nét, tách biệt gồm băng cho xác định B anthracis Y pestis băng IC Có thể thấy rằng, mức nồng độ IC 5x104copy/ mẫu cho băng rõ nét nồng độ lựa chọn sau tối ưu lại nồng độ cặp mồi capAF1/R1 (0,64 µM), thơng số khác mPCR tối ưu ban đầu giữ nguyên (Hình 3.21) Như vậy, thiết kế thành công kỹ thuật mPCR-IC xác định đồng thời B anthracis Y pestis Chu trình nhiệt: Biến tính 94oC/4 phút, 32 chu kỳ (94oC/1 phút; 56oC/45 giây; 72oC/50 giây), 72oC/10 phút Hình 21 Kiểm tra mPCR tối ưu có bổ sung IC nồng độ 105 5x104 copy M Marker 100 bp (Thermo Scientific); 1, Mẫu Y pestis; 3, Mẫu B anthracis Y pestis; 5, Mẫu B anthracis 3.1.5 Chế tạo kit mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis Sau xây dựng quy trình kỹ thuật mPCR, tiến hành chế tạo master mix theo thành phần tối ưu Bước đầu chế tạo 1000 test, 50 test/bộ, bảo quản điều kiện -20oC cho đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện, độ ổn định kit mPCR theo thời gian thử nghiệm chủng phân lập (Ký hiệu kit BaYp-mPCR) (Hình 3.22) Hình 22 Master mix mPCR đóng gói kèm hướng dẫn sử dụng 3.2 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP 3.2.1 Đánh giá khả phát kỹ thuật mPCR mẫu chuẩn Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn xác định độ nhạy kit mPCR Ngưỡng nồng độ DNA tối thiểu phát PCR thông số cần khảo sát trước xây dựng mẫu chuẩn độ nhạy Mẫu gốc DNA tách chiết, tinh đạt nồng độ 120 ng/µl, từ mẫu pha loãng nước khử ion B50 B51 B52 B53 B54 B55 B56 B57 B58 B59 M ĐC(-) Hình 23 Xác định ngưỡng phát B anthracis M Marker 50 bp; B50-B59 mức nồng độ DNA; ĐC(-) Đối chứng âm Mẫu có nồng độ DNA thấp cho khả phát B55 (mã số gốc PBA19) (Hình 3.23), nồng độ 0,000092 ng/µl tương đương 81,5 copy/ phản ứng mPCR sử dụng µl DNA Với kết xác định ngưỡng mPCR phát B anthracis trên, tiến hành thiết lập mẫu chuẩn độ nhạy 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EB1 đến EB10) x 10 cột Sử dụng 10 mức nồng độ mẫu chuẩn xác định ngưỡng mPCR phát B anthracis từ PBA10 (0,046875 ng/µl) - PBA19 (0,000092 ng/µl) tương ứng ký hiệu EB1 - EB10 Tương tự, ngưỡng phát mẫu chuẩn Y pestis 130,5 copy/ phản ứng Bộ mẫu chuẩn độ nhạy mPCR xác định Y pestis thiết lập gồm 100 ống (50 µl/ống), bao gồm: 10 hàng (ký hiệu EY1 đến EY10) x 10 cột Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn độ đặc hiệu chẩn đoán kit mPCR Các mẫu chuẩn độ đặc hiệu mPCR B anthracis thiết lập tương tự với mẫu chuẩn độ nhạy, sử dụng chủng B cereus Tương tự, sử dụng chủng E coli Y enterocolitica cho Y pestis Nghiên cứu thiết lập mẫu chuẩn xác định độ nhạy, độ đặc hiệu kit mPCR chẩn đoán B anthracis Y pestis Để thuận tiện cho việc đánh giá nội bộ, sau thiết lập mẫu chuẩn độ nhạy đặc hiệu xác định tác nhân, tiến hành phối trộn mẫu chuẩn riêng rẽ tương ứng để tạo mẫu chuẩn hỗn hợp đồng thời B anthracis Y pestis Đánh giá kit mPCR chẩn đoán B anthracis Y pestis mẫu chuẩn Khả phát B anthracis kit mPCR kiểm tra 100 mẫu (từ mẫu EB1 đến EB10, mẫu lặp lại 10 lần) mẫu chuẩn độ nhạy với B anthracis cho kết 100% mẫu phát đầy đủ gen đặc trưng B anthracis Tương tự cho đánh giá độ nhạy kit mPCR Y pestis, đồng thời B anthracis Y pestis cho kết 100% Chúng tiến hành kiểm tra độ đặc hiệu kit BaYp - mPCR 100 mẫu (từ C1 đến C10 mẫu lặp lại 10 lần) mẫu chuẩn độ đặc hiệu thiết lập từ B cereus Kết 100% mẫu không xuất gen đặc trưng capA, pagA B anthracis 100% mẫu dương tính với gen vrrA Với Y pestis, độ đặc hiệu kit mPCR 100% Các thành phần kit BaYp-mPCR có ổn định 12 tháng bảo quản điều kiện -20oC (Hình 3.32) Hình 32 Kiểm tra độ ổn định mPCR sau thời gian 12 tháng M Marker 100 bp; 1-10 Các mẫu DNA EBY2 3.2.2 Đánh giá khả phát kỹ thuật mPCR chủng phân lập Kỹ thuật mPCR với cặp mồi xác định đồng thời gen đặc trưng, gen độc lực B anthracis Y pestis thiết kế tối ưu thành công chủng chuẩn Việc đánh giá khả phát kỹ thuật mPCR mẫu chuẩn điều kiện lý tưởng -điều kiện tiên cho kit trước đưa thử nghiệm lâm sàng Với chủng lâm sàng B anthracis Y pestis, đặc biệt mẫu phân lập ngồi mơi trường hay lưu trữ thời gian dài phòng thí nghiệm, số tính chất kiểu hình, kiểu gen bị biến đổi Do đó, để khẳng định việc thiết kế thành công kỹ thuật mPCR, chủng phân lập B anthracis Y pestis sau kiểm tra, xác định nuôi cấy, xác định kỹ thuật mPCR Kết xác định mPCR khẳng định phân tích trình tự tồn chiều dài số gen tiêu biểu nhiễm sắc thể, plasmid độc lực Xác định chủng phân lập nuôi cấy, định danh Các chủng nghi ngờ B anthracis chủng chuẩn B anthracis Ba (đối chứng dương) nuôi cấy môi trường thạch máu cừu 37oC/CO2 5%/ 24 Kết quả, tất chủng cho khuẩn lạc dạng R, màu xám, trực khuẩn Gram dương, hình vng hai đầu, xếp đôi, chuỗi, bào tử không làm biến đổi hình dạng vi khuẩn, 11 chủng không tan máu β môi trường thạch máu cừu - có chủng hình thành vỏ (B anthracis Ba, Ba1, Ba3, Ba4) 13 chủng lại tan máu β Định danh cho 11 chủng B anthracis, lại B cereus (ID > 90%) Chủng Y pestis Yp1, Yp2 cho kết mọc khuẩn lạc kích thước - mm dạng S, màu xám đục, bờ đều, bề mặt nhẵn, trung tâm lồi giống hình trứng oplet không tan máu, trực khuẩn Gram âm nhỏ, oxydase (-) Định danh Y pestis với ID Yp1, Yp2 98,6 96,4% Thử nghiệm kỹ thuật mPCR Kỹ thuật mPCR thử nghiệm mẫu nghiên cứu B anthracis, Y pestis mẫu đối chứng âm B cereus, E coli Mẫu hỗn hợp tạo cách trộn lẫn chủng B anthracis Y pestis sau tiến hành tách DNA tổng số Ở tất mẫu đối chứng mẫu thử nghiệm xuất băng chứng nội IC, điều chứng tỏ trình tách chiết DNA mPCR đảm bảo, theo kết xác định đáng tin cậy (minh họa Hình 3.36) Mẫu đối chứng âm xuất băng có kích thước khoảng 220 bp - tương ứng với gen vrrA, ngồi khơng xuất thêm băng khác Điều phù hợp, đối chứng âm sử dụng chủng B cereus, gen vrrA có mặt lồi nhóm “B cereus” Còn mẫu đối chứng dương xuất gen đích tác nhân (Hình 3.36a), xuất gen đích tác nhân (Hình 3.36b) (+) (-) M BY2 Yp1 Yp2 Ba4 M Ba5 Ba6 (+) (-) M Ba3 Ec Hình 36 Xác định đồng thời B anthracis Y pestis kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội IC M Marker 100 bp (Thermo Scientific); a) (+) Đối chứng dương hỗn hợp B anthracis Y pestis; (-) Đối chứng âm hỗn hợp B cereus E coli; BY2 Mẫu thử nghiệm hỗn hợp B anthracis Ba4 Y pestis Yp2; Yp1 Y pestis Yp1; Yp2 Y pestis Yp2; Ba4 B anthracis Ba4; Ba5 B anthracis Ba5; Ba6 B anthracis Ba6; b) (+) Đối chứng dương mẫu B anthracis Ba; (-) Đối chứng âm B cereus; Ba3 B anthracis Ba3; Ec E coli Kết thử nghiệm kỹ thuật mPCR cho thấy, xuất băng có kích thước tương ứng với gen đích vrrA (mẫu Ba5 Hình 3.36a) hay khơng xuất băng đích (mẫu Ec Hình 3.36b), xác định mẫu âm tính với B anthracis Y pestis gây bệnh (tương ứng mẫu B anthracis Ba5 E coli) Cụ thể, kết Hình 3.36a, đường chạy ký hiệu BY2 xuất đầy đủ băng đích có kích thước với mẫu đối chứng dương, xác định mẫu dương tính đồng thời với B anthracis Y pestis có đầy đủ độc lực Mẫu ký hiệu Yp1, Yp2, Ba4 (Hình 3.36a) mẫu Ba3 (Hình 3.36b) xuất đầy đủ băng gen đích cho đối tượng, xác định chủng Y pestis B anthracis gây bệnh Trong đó, đáng ý Hình 3.36a, mẫu Ba6 xuất băng có kích thước tương ứng với gen đích pagA vrrA, không xuất băng thị gen capA Đây mẫu B anthracis bị thiếu plasmid pXO2, không đầy đủ độc lực (chủng B anthracis Ba6) Như vậy, 10 chủng phân lập B anthracis, kỹ thuật mPCR xác định chủng B anthracis đầy đủ độc lực (Ba1, Ba3 Ba4), chủng giảm độc thiếu gen capA thuộc plasmid pXO2 (chủng B anthracis Ba6), chủng lại B anthracis không độc Đồng thời với Y pestis, kỹ thuật mPCR xác định 2/2 chủng Y pestis có đầy đủ gen độc lực Để khẳng định kết quả, băng điện di đặc hiệu cho gen đích chẩn đốn tinh gel giải trình tự Kết quả, tất trình tự thuộc gen đích tương ứng B anthracis Y pestis Như vậy, kỹ thuật mPCR thử nghiệm thành công chủng chuẩn chủng phân lập Phân tích trình tự gen đặc trưng gen độc lực B anthracis Y pestis Kỹ thuật mPCR phát triển chứa cặp mồi xác định đoạn ngắn trình tự bảo thủ gen đích tương ứng Tuy nhiên, gen đích có chiều dài khác phân bố vị trí khác Cụ thể, với B anthracis, gen đặc trưng vrrA thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pagA, capA thuộc plasmid pXO1, pXO2 Với Y pestis, gen đặc trưng ypo2088 thuộc nhiễm sắc thể, gen độc lực pla, caf1 thuộc plasmid pPCP1, pMT1 Để đánh giá kỹ thuật mPCR phát triển, đồng thời nghiên cứu trình tự gen đặc trưng gen độc chủng phân lập Việt Nam có giống khác với chủng quốc tế, tiến hành phân tích trình tự tồn chiều dài gen độc lực gen đặc trưng B anthracis Y pestis Phân lập toàn chiều dài gen đặc trưng gen độc lực Đối với B anthracis, gen vrrA, pagA, cya, lef, capA, capB, capC nhân dòng cho xác định tồn trình tự Các gen khuếch đại thành cơng, sản phẩm PCR có kích thước 551, 2323, 2544, 2580, 1325, 1439 561 bp với lý thuyết Đối với Y pestis, gen đặc trưng nhiễm sắc thể ypo2088 gen plasmid pPCP1 pMT1 tương ứng pla caf1 cho sản phẩm kích thước 645, 1019 654 bp Nghiên cứu tạo dòng tồn chiều dài gen đặc trưng gen độc lực Sản phẩm khuếch đại gen đích tinh tạo dòng vector pJET1.2/blunt Chúng tơi lựa chọn số enzyme giới a) b) hạn để cắt kiểm tra dòng plasmid tái tổ hợp, BglII sử dụng tất trường hợp nằm vùng đa điểm cắt Ngoài ra, số trường hợp, sử dụng thêm số enzyme khác có trình tự nhận biết vector trình tự gen đích Q trình cắt kiểm tra enzyme giới hạn minh họa với vector tái tổ hợp pJET1.2-pagA (Hình 3.39) Hình 39 Tạo dòng gen pagA vector pJET1.2/blunt a) Sơ đồ biểu trình cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA BglII; b) Cắt kiểm tra vector pJET1.2-pagA gel agarose 1,2% Sử dụng enzyme giới hạn BglII, cặp enzyme XbaI EcoRI, chúng tơi chọn dòng tế bào mang plasmid chứa gen pagA cho sản phẩm kích thước khoảng 4,0 1,2 kb (cắt XbaI EcoRI) khoảng 2,8; 2,4 kb BglII Như vậy, gen đích tách dòng thành cơng Phân tích trình tự gen đích đặc trưng gen độc lực Phân tích trình tự gen vrrA 10 chủng B anthracis phân lập cho thấy, gen vrrA giống hoàn toàn, độ tương đồng từ 99-100% so với chủng tham chiếu Phân tích trình tự gen pagA chủng B anthracis độc lực (Ba1, Ba3 Ba4) xác định đột biến điểm (T→C), đột biến đồng nghĩa (T→C)195, đột biến sai nghĩa (T→C)1693 (T→C)1799 so sánh với chủng B anthracis Vollum-USA Nghiên cứu trình tự gen cya lef (pXO1), xác định đột biến đồng nghĩa (T→C)600 gen cya chủng B anthracis Ba3 Ba4, gen lef có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu Một đột biến sai nghĩa hoàn toàn (A→G)1048 gen capA chủng B anthracis Ba1 làm thay đổi axit amin lysine thành glutamic (Hình 3.43) Hai gen lại capB, capC có tính bảo tồn cao, không xảy đột biến điểm Các gen đăng ký Genbank với mã số: KP213102-7; KP759885-93 Hình 43 So sánh trình tự axit amin protein mã hóa gen capA chủng B anthracis Ba1, Ba3 Ba4 với 12 chủng tham chiếu Với Y pestis, gen ypo2088 caf1 chủng Y pestis Yp1, Yp2 có mức độ tương đồng 100% so với chủng tham chiếu Chỉ có đột biến điểm xác định gen pla (T→C)836 so sánh với chủng Y pestis Angola Trình tự phân tích gen đăng ký Genbank với mã số KM880025-7 Như vậy, kỹ thuật mPCR thiết kế xác định đồng thời B anthracis, Y pestis thử nghiệm dựa chủng phân lập nước hồn tồn chẩn đốn cho chủng từ khu vực khác giới 3.2.3 Kiểm định kit BaYp-mPCR chẩn đoán B anthracis Y pestis Kỹ thuật mPCR xác định nhanh, đồng thời B anthracis Y pestis phát triển thành kit BaYp-mPCR, kiểm định Viện kiểm định Quốc gia Vắc xin Sinh phẩm, Bộ Y tế cho kết đạt tiêu chuẩn sở, độ nhạy, độ đặc hiệu 100% panel mẫu chuẩn Chương BÀN LUẬN KẾT QUẢ 4.1 THIẾT KẾ KỸ THUẬT mPCR XÁC ĐỊNH NHANH ĐỒNG THỜI B anthracis VÀ Y pestis Kỹ thuật mPCR cho phép tiết kiệm thời gian, kinh phí đóng vai trò quan trọng chẩn đốn phân tử Thực tế, việc nghiên cứu thiết kế mPCR tối ưu đòi hỏi nhiều cơng đoạn so với PCR thông thường Các thành phần tham gia phản ứng chu trình nhiệt cần đánh giá, tối ưu Đồng thời, việc nghiên cứu, thiết kế mồi mPCR có vai trò quan trọng Đối với tác nhân B anthracis Y pestis, cần chủng gây bệnh (có đầy đủ độc lực) hay không Với B anthracis, gen pagA (pXO1) WHO khuyến cáo sử dụng chủng B anthracis thiếu gen khơng thể gây độc Ngồi ra, gen capA (pXO2) lựa chọn nhiều chẩn đoán (Skottman, 2007; Kurosaki, 2009) Một gen đích sử dụng để phát tất chủng vi khuẩn than vrrA nằm nhiễm sắc thể - có tính ổn định cao bền vững Trong xác định Y pestis, pla, caf1, ypo2088 gen đích thường sử dụng, cho phép chẩn đốn xác Y pestis Như vậy, cần thiết kế cặp mồi mPCR cho xác định đồng thời B anthracis Y pestis Khi thực mPCR với nhiều cặp mồi, xác suất tạo sản phẩm không đặc hiệu, bắt cặp chéo mồi tăng lên Do đó, sau nghiên cứu thiết kế mồi, tối ưu mPCR điều kiện tiên để hạn chế tối đa tương tác lẫn cặp mồi việc tạo thành sản phẩm phụ Cho đến trước nghiên cứu này, có cơng trình phát triển kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis tác nhân truyền nhiễm khác có kết hợp cặp mồi chẩn đoán xác định gen đặc trưng nhiễm sắc thể gen độc lực plasmid chứng nội để xác minh kết Hầu hết cơng trình lựa chọn gen đích độc lực plasmid (Batra, 2013; Safari Foroshani, 2013; Whiteduck-Leveillee, 2016), không đánh giá đầy đủ tình trạng độc lực chủng vi khuẩn gây bệnh bỏ sót chẩn đốn Để khắc phục hạn chế này, số nghiên cứu kết hợp gen nhiễm sắc thể gen độc lực, nhiên lại tác nhân riêng rẽ (Chen, 2012; Ogawa, 2015; Riojas, 2015; Lindsey, 2017) Mặt khác, nhiều cơng trình lại khơng thiết kế chứng nội để kiểm soát kết chẩn đoán lâm sàng Kỹ thuật mPCR phát triển luận án sử dụng cặp mồi có chứng nội để phát nhanh, đồng thời xác B anthracis Y pestis gây bệnh cách kết hợp gen đích nhiễm sắc thể gen đích độc lực plasmid cho loại tác nhân Đặc biệt, thiết kế IC cạnh tranh (Abdulmawjood, 2002; Hoorfar, 2004), sử dụng chung cặp mồi chẩn đốn capAF1/R1 Như vậy, khơng phải thiết kế thêm cặp mồi cho IC công đoạn tối ưu rút ngắn Như vậy, kỹ thuật mPCR có chứa cặp mồi cho phép khuếch đại đồng thời sản phẩm gồm gen đích B anthracis, gen đích Y pestis gen IC Kỹ thuật cung cấp công cụ hữu ích góp phần xác định nhanh, đồng thời tác nhân vi khuẩn có nguy cao sử dụng làm vũ khí sinh học ống phản ứng, giúp giảm giá thành, công sức thời gian chẩn đoán 4.2 KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN CỦA KỸ THUẬT mPCR TRÊN CÁC BỘ MẪU CHUẨN VÀ CÁC CHỦNG PHÂN LẬP Kỹ thuật mPCR xác định đồng thời B anthracis Y pestis sau thiết kế, tối ưu thành công chế tạo thử nghiệm thành kit (kit BaYp-mPCR) Để đảm bảo chất lượng, kit chế tạo phải đánh giá với tiêu chí quan trọng là: độ nhạy, độ đặc hiệu độ ổn định mẫu chuẩn - điều kiện tiên cho kit chẩn đoán trước đưa vào thử nghiệm thực địa (WHO, 2004; Bunk, 2007; Madej, 2010; NIBSC, 2014) Các loại mẫu chuẩn dùng kiểm định tìm danh mục WHO NIBSC lý tưởng Tuy nhiên, khơng có loại thiết lập mẫu chuẩn nội cần thiết (Belak, 2001), đặc với B anthracis Y pestis lồi vi khuẩn tối nguy hiểm, khơng có sẵn mẫu chuẩn Các chủng chuẩn sử dụng tách chiết DNA cho thiết lập mẫu chuẩn nội kiểm tra, đánh giá tính chất sinh vật, hóa học điển hình Các mẫu DNA có độ tinh nồng độ cao sử dụng làm mẫu chuẩn Theo cách này, mẫu chuẩn có độ đồng cao pha lỗng thành nồng độ xác, hướng thiết lập WHO khuyến cáo Giá trị ngưỡng phát cho B anthracis Y pestis tương ứng 81,5 130,5 copy/phản ứng, tương đương với kết cơng trình cơng bố (Heinz Ellerbrok, 2002; Batra, 2013; Nghiem, 2015), độ nhạy 100% thử nghiệm số mẫu đủ lớn 100, đạt tiêu chuẩn sở Kết đánh giá độ đặc hiệu cho thấy, sử dụng gen nhiễm sắc thể (vrrA) chẩn đốn nhầm B anthracis B cereus (Bode, 2004; Rasko, 2004) Mặt khác, dựa vào gen plasmid nguy âm tính giả với chủng plasmid độc lực Với B anthracis, để khẳng định vi khuẩn than gây bệnh cần có mặt đồng thời gen vrrA, pagA, capA Kết minh chứng cho yêu cầu phải kiểm định panel mẫu với tất kit thương mại trước đưa thị trường Như vậy, panel độ nhạy độ đặc hiệu thiết lập đảm bảo có ý nghĩa đánh giá giá trị khoa học kit, có khả kiểm định tiêu chuẩn kit PCR chẩn đoán B anthracis Y pestis với nhiều cách thiết kế mồi khác Đánh giá kit PCR chẩn đoán mẫu chuẩn kiểm định điều kiện lý tưởng Trên thực tế, B anthracis Y pestis tồn tự nhiên hay bị gây nhiễm ngồi mơi trường, mẫu phức tạp, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR, đòi hỏi cần xác định nhanh, xác trường hợp nghi ngờ Kỹ thuật mPCR thử nghiệm chủng chuẩn chủng phân lập (sau kiểm tra tính chất sinh vật, hóa học, định danh) Đồng thời, để có sở đánh giá kỹ thuật mPCR phát triển cho ứng dụng xác định chủng địa phương chủng quốc tế, tiến hành phân tích trình tự tồn chiều dài gen đặc trưng gen độc lực tiêu biểu B anthracis (thuộc plasmid pXO1, pXO2), Y pestis (thuộc pPCP1, pMT1) Kết cung cấp liệu nucleotide tương đối hoàn chỉnh số gen tiêu biểu chủng B anthracis, Y pestis phân lập Việt Nam Kỹ thuật mPCR chứa chứng nội tối ưu xác định xác chủng B anthracis, Y pestis riêng lẻ hay đồng thời B anthracis Y pestis có đầy đủ độc lực (B anthracis Ba1, Ba3, Ba4, Y pestis Yp1, Yp2) phân biệt với chủng giảm độc (B anthracis Ba6) hay không độc (B anthracis Ba2, Ba5, Ba7-Ba9, Ba11) (minh họa Hình 3.36) Với trường hợp chủng B anthracis không độc (thiếu plasmid pXO1 pXO2), kỹ thuật mPCR không phân biệt với chủng B cereus gen vrrA có mặt lồi thuộc nhóm “B cereus” Như vậy, sử dụng gen vrrA khó phân biệt lồi thuộc nhóm Điều khẳng định, cần kết hợp với gen đặc trưng tương ứng plasmid pXO1 pXO2 để xác định xác B anthracis gây bệnh (Radnedge, 2003; Kim, 2015) Đồng thời, pXO1 pXO2 coi đặc trưng cho B anthracis, có số báo cáo rằng, số chủng thuộc nhóm “B cereus” gặp chứa plasmid có tương đồng với plasmid (Rasko, 2007; Koehler, 2009) Trường hợp ngoại lệ bao gồm thể lâm sàng nhiễm B cereus với triệu chứng bệnh than, mang plasmid pXO1 giống đến 99,6% với pXO1 B anthracis (Hoffmaster, 2004) Và trường hợp mẫu lâm sàng từ khỉ hoang dã cỡ lớn mà chết bệnh giống than, khơng có kiểu hình B anthracis, chứa plasmid giống pXO1 pXO2, có khả tạo kháng nguyên bảo vệ tạo vỏ Xác định trình tự đa locus chủng cho thấy chúng có quan hệ gần với B anthracis chủng B cereus B thuringiensis độc gặp (Koehler, 2009) Đến nay, có vài trường hợp báo cáo giới, làm thay đổi quan niệm cũ bệnh than giới hạn B anthracis (Hoffmaster, 2004; Klee, 2006; Kim, 2015) Đây trường hợp hiếm, cá thể bị nhiễm chủng đặc biệt bị tử vong giống bệnh than, xác định kỹ thuật mPCR phát triển (Chun, 2012; Irenge, 2012; Girault, 2014) Như vậy, kỹ thuật mPCR tối ưu chứa chứng nội tái tổ hợp cho phép xác định B anthracis Y pestis gây bệnh Kỹ thuật mPCR chứng tỏ cơng cụ hữu ích cho việc xác định nhanh đồng thời phân biệt xác chủng B anthracis, Y pestis độc lực không độc lực tự nhiên KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Phát triển thành công kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis Phát triển thành công kỹ thuật mPCR tối ưu với cặp mồi chứng nội tái tổ hợp, cho phép xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis, đó: - cặp mồi phát gen đặc hiệu B anthracis vrrA, pagA, capA cặp mồi phát gen đặc hiệu Y pestis ypo2088, pla, caf1 kỹ thuật mPCR - Chứng nội tái tổ hợp pJET1.2-capA-IC1 bổ sung trình tách chiết với nồng độ 5x104 copy/ mẫu để xác minh kết chẩn đốn, tránh tượng âm tính giả Đánh giá thành công khả phát kỹ thuật mPCR mẫu chuẩn chủng phân lập Các mẫu chuẩn thiết lập gồm mẫu chuẩn DNA độ nhạy, độ đặc hiệu riêng rẽ B anthracis, Y pestis hỗn hợp B anthracis Y pestis Kỹ thuật mPCR có khả xác định đồng thời B anthracis Y pestis độc lực đạt độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 100%, độ ổn định kit 12 tháng mẫu chuẩn Đã xác định trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (nhiễm sắc thể), gen độc lực pagA, lef, cya (plasmid pXO1), capA, capB, capC (plasmid pXO2) 10 chủng B anthracis gen đặc trưng ypo2088 (nhiễm sắc thể), gen độc lực pla (plasmid pPCP1), caf1 (plasmid pMT1) 02 chủng Y pestis Việt Nam Các chủng B anthracis Y pestis có tính ổn định cao, khơng có biến đổi đáng kể trình tự nucleotide so với chủng tham chiếu Kỹ thuật mPCR có khả xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis chủng phân lập, cho phép phân biệt chủng đầy đủ độc lực với chủng không đầy đủ độc lực tự nhiên KIẾN NGHỊ Nghiên cứu thử nghiệm kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis để đánh giá bổ sung mẫu thực địa, sẵn sàng sử dụng có tình cơng sinh học phòng chống dịch bệnh  ... tiêu nghiên cứu - Phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời Bacillus anthracis Yersinia pestis - Đánh giá khả phát kỹ thuật multiplex PCR mẫu chuẩn chủng phân lập Nội dung nghiên. .. nghiên cứu đề tài - Thiết kế cặp mồi cho kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis - Thiết kế, tối ưu kỹ thuật mPCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis - Đánh giá khả phát. .. thành công nghiên cứu phát triển kỹ thuật multiplex PCR xác định nhanh đồng thời B anthracis Y pestis Kỹ thuật multiplex PCR với cặp mồi thiết kế, tối ưu cho phép khuếch đại đồng thời sản phẩm