Nghiên cứu phát triển bệnh viêm ruột hoạt tử ở lợn và gà do chủng vi khuẩn clostridium perfringens bằng kỹ thuật pcr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC “NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH VIÊM RUỘT HOẠT TỬ Ở LỢN VÀ GÀ DO CHỦNG VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS BẰNG KỸ THUẬT PCR” NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 7420201 Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Bích Hồng Sinh viên thực : Nguyễn Lê Nhật Trang Mã sinh viên : 1653070317 Lớp : K61A – CNSH Khóa học : 2016 - 2020 Hà Nội -2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn TS Hà Bích Hồng tận tình hướng dẫn, bảo suốt q trình thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trường Đại học Lâm nghiệp giúp đỡ, bảo tận tình cho em khơng q trình làm khóa luận mà trình học tập, bồi dưỡng Trường Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuân lợi trình học tập, sinh hoạt, làm nghiên cứu khoa học hồn thành Khóa luận tốt nghiệp Vì điều kiện thời gian, khả thân cịn có hạn chế nên Khóa luận tốt nghiệp cịn có thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp q báu thầy giáo, nhà khoa học bạn sinh viên để khóa luận em hồn thiện Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Sinh viên thực Nguyễn Lê Nhật Trang i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU vi CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Bệnh truyền nhiễm 1.1.1 Khái niệm bệnh truyền nhiễm 1.1.2 Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm 1.2 Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà lợn 1.2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử ở gà lợn 1.2.3 Bệnh viêm ruột hoại tử gà 11 1.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm gia súc, gia cầm 15 1.3.1 Phương pháp truyền thống 15 1.3.2 Phương pháp đại 16 1.3.3 Chẩn đoán kĩ thuật PCR 19 CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Mục tiêu đề tài 28 2.1.1 Mục tiêu tổng quát 28 2.1.2 Mục tiêu cụ thể 28 2.2 Đối tượng nghiên cứu 28 2.3 Phạm vi nghiên cứu 28 2.3 Nội dung nghiên cứu 28 2.4 Mẫu bệnh phẩm, hóa chất trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 29 ii 2.4.1 Mẫu bệnh phẩm 29 2.4.2 Hóa chất thí nghiệm 29 2.4.3 Trang thiết bị nghiên cứu 29 2.4.4 Dụng cụ thí nghiệm 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 30 2.5.1 Thu nhận, bảo quản mẫu bệnh phẩm 30 2.5.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm 30 2.5.3 Kỹ thuật PCR 30 2.5.4 Kỹ thuật điện di 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết tách chiết DNA 33 3.1.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm lợn 33 3.1.2 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm gà 34 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn 35 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở gà 38 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 4.1 Kết luận 42 4.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết đầy đủ STT Từ viết tắt AC-ELISA AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome DNA Deoxyribonucleic Acid ELISA FA Flourescence Assay ILT Infectious Laryngotracheitis ILTV IP ITS Internal Strancribed Spacer 10 NE Necrotic Enteritis 11 ORT Ornithobacterium Rhinotracheale 12 PCR Polymerase Chain Reaction 13 RNA Ribonucleic Acid 14 SARS Severe Acute Respiratory Syndrom 15 SDS 16 Ta Temperature annealing 17 Tm Temperature melting Antigen Capture Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Enzyme Linked Immunosorbent Assay Infectious Laryngotracheitis Virus Immunoperoxidase Sodium Dodecyl Sulfate iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Các typ độc tố vi khuẩn C perfringens Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn 13 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR 31 Bảng 2.2: Mồi sử dụng đề tài 31 Bảng 2.3 : Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 32 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Clostridium perfringens qua kính hiển vi Hình 3.1: Kết kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác lợn chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử gel agarose 1% 33 Hình 3.2: Kết kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 34 Hình 3.3: Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 16S_F/R mẫu DNA tách từ phân Heo chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 36 Hình 3.4: Kết PCR với cặp mồi 16S_F/R 37 Hình 3.5: Kết nhân đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens từ mẫu bệnh phẩm gà 38 Hình 3.6: Quy trình phát bệnh ở gia súc, gia cầm phương pháp PCR 41 vi MỞ ĐẦU Trong lĩnh vực chăn nuôi gia xúc, gia cầm, bệnh truyền nhiễm xem trở ngại lớn ảnh hưởng đến tăng trưởng phát triển bền vững ngành chăn nuôi ở nước ta Những tác hại mà bệnh truyền nhiễm mang đến như, bệnh nhẹ: vật chủ tăng trưởng – chất lượng thịt kém, giảm sản lượng trứng, bệnh nặng: tử vong hàng loạt – gây ô nhiễm mơi trường Để kiểm sốt giảm thiểu hậu bệnh truyền nhiễm mang lại, cần phải xác định tác nhân gây bệnh làm sở để lựa chọn hoàn thiện giải pháp nhằm hạn chế sinh trưởng phát triển tác nhân gây bệnh Bệnh viêm ruột hoại tử (Necrotic Enteritis) bệnh truyền nhiễm điển hình thường gặp ở ngành chăn nuôi chủng vi khuẩn Clostridium perfringens gây Bệnh thừa nhận toàn cầu thách thức bệnh dẫn đầu, ước tính phí tổn ngành gia cầm gần tỷ USD riêng năm 2015 Ở Việt Nam, công tác chẩn đoán bệnh gia xúc, gia cầm áp dụng kĩ thuật chẩn đoán truyền thống chủ yếu, hầu hết dựa vào triệu chứng vết bệnh tích ở vật chủ, hình thái, cấu tạo hoạt tính sinh học tác nhân gây bệnh, điều ảnh hưởng đến hiệu sử dụng thuốc thuốc kháng sinh bệnh có bệnh lý triệu chứng tương đồng Tình trạng sử dụng thuốc kháng sinh không hiệu dẫn đến bệnh khơng tiêu diệt triệt để, hình thành ổ dịch tự nhiên, thúc đẩy tích lũy đột biến ở tác nhân gây bệnh Với phát triển lĩnh vực sinh học phân tử, tiêu biểu kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) kéo theo hàng loạt thành tựu khoa học mang tính thực dụng cao Ưu điểm phương pháp này: đơn giản, giá thành thấp nhanh chóng Do đó, lĩnh vực chẩn đoán bệnh, PCR xem phương pháp chẩn đốn xác tác nhân gây bệnh, phát đến phân chủng, áp dụng với nhiều dạng hàm lượng mẫu bệnh phẩm khác Xuất phát từ tính chất vượt trội kỹ thuật PCR lĩnh vực chẩn đốn bệnh, tơi thực đề tài: “Nghiên cứu phát nhanh bệnh viêm ruột hoạt tử lợn gà chủng vi khuẩn Clostridium perfringens kỹ thuật PCR” CHƯƠNG I TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Bệnh truyền nhiễm 1.1.1 Khái niệm bệnh truyền nhiễm Bệnh truyền nhiễm loại bệnh có khả lây lan nhanh chóng (từ quần thể nhỏ đến cộng đồng), thời gian ủ bệnh tương đối dài nên việc phát kiểm sốt bệnh vấn đề khó khăn y tế dự phịng Bên cạnh số bệnh có biểu hiện, triệu chứng bệnh có điểm tương tự nhau, bệnh xâm nhiễm ở loài hay nhiều loài định, mức độ phát tán bệnh trạng phụ thuộc vào đặc tính hình thái, cấu tạo cấu trúc sinh học tác nhân gây bệnh Bệnh truyền nhiễm nguyên nhân chủ yếu làm trì trệ phát triển bền vững lĩnh vực chăn nuôi, không thiệt hại kinh tế, mà cịn ảnh hưởng đến mơi trường, sức khỏe cộng đồng Một số bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại ngành chăn nuôi gia cầm ở Việt Nam như: dịch cúm gia cầm (12/2003), nước ta phải thiêu hủy 38 triệu tương đương với 380 tỷ đồng (https://www.nhandan.com.vn/kinhte/item/8045602-.html), hàng năm phải tiêu hủy hàng nghìn gia cầm trận dịch nhỏ, lẻ xảy thường xuyên rải rác khắp nước; hay bệnh viêm ruột hoại tử (NE), ORT (Vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale), viêm khí quản (Gallid herpesvirus 1), tiêu chảy (Vi khuẩn Escherichia Coli), thương hàn (Salmonella Gallinarum), bệnh phổ biến ở Việt Nam, bệnh xảy thường xuyên gặp điều kiện thời tiết dinh dưỡng thích hợp năm Điển hình trận dịch lợn tai xanh (Arterivirus), lở mồm long móng (Aphthovirus) gần dịch tả lợn Châu Phi (African swine fever virus) gây thiệt hại vô cùng lớn cho ngành chăn ni (Đỡ Tiến Duy, 2015, 2016; Ngũn Đình Qt, 2015) Một số bệnh không gây tử vong thiệt hại kinh tế chúng mang đến chí cịn nghiêm trọng bệnh gây tử vong, bởi hậu bệnh làm vật chủ chậm phát triển giảm sản lượng trứng Các tác nhân gây bệnh hầu hết sinh vật nhân sơ, chúng sinh vật đơn bào có tần số đột biến cao, lợi vòng đời ngắn ngủi giúp cho tác nhân gây bệnh dễ dàng hình thành nên quần thể kháng kháng thể (hoặc kháng thuốc kháng sinh) thông qua tích lũy đột biến yếu tố chọn lọc Ngồi ra, ở sinh vật nhân sơ khơng có yếu tố sửa sai hệ gen ở sinh vật nhân thực, điều dẫn đến tỉ lệ đột biến ở sinh vật nhân sơ tăng cao Thứ yếu, phát tán bệnh từ quần thể cách ly nhỏ, bệnh lan truyền qua đường vận chuyển quốc tế, truyền máu, Thứ ba, phát tán virus có sẵn ở sinh vật khác địa vực (sống cách ly), nhà khoa học ước lượng ba phần tư bệnh bắt nguồn theo cách Các loài sinh vật xem ổ chứa tự nhiên chủng virus, bệnh SARS bùng phát năm 2002 ở Trung Quốc, nguyên nhân dơi, ổ chứa bệnh SARS bán làm thức ăn cùng thời điểm (World Health Organization) Một cách thức quan trọng khác tái tổ hợp di truyền vật chủ bị lây nhiễm nhiều chủng virus thời điểm Cụ thể virus cúm, xem nguyên nhân dẫn đến bùng phát đại dịch cúm Tây Ban Nha năm 1918, virus 1918 gây đại dịch cho hậu đại 02 chủng virus cúm từ động vật có vú lồi chim thơng qua trơi dạt kháng ngun (antigenic drift), (https://www.cdc.gov/flu/about/viruses/change.htm) Bệnh phát tán thường thông qua đường sol khí, tiếp xúc trực tiếp với dịch thể nhiễm bệnh (máu, nước bọt , ), dụng cụ ô nhiễm (kim tiêm, đồ dùng sinh hoạt , ), hay vật trung gian (côn trùng, thức ăn ô nhiễm , ) Các tác nhân gây bệnh phá hủy hay giết tế bào việc giải phóng enzyme thủy phân từ lysosome làm phân giải màng tế bào vật chủ, thân tác nhân có thành phần phân tử độc tố phần protein lớp áo virus, phần lipid vi khuẩn… Mức độ phá hủy tế bào chủ mà tác nhân gây phụ thuộc vào khả tái sinh mơ bị lây nhiễm qua q trình phân chia tế bào Nhiều triệu chứng tạm thời liên quan đến lây nhiễm (như virus, ), bao gồm sốt cao, đau nhức thường nỗ lực đáp ứng thể nhằm chống lại virus tế bào bị chết bởi virus 1.1.2 Một số nhóm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm Những tác nhân gây bệnh gồm virus, vi khuẩn, động vật ngun sinh, vi nấm; ngồi cịn có viroid (hiện vật chủ thực vật) prion (gây tổn hại đến hệ thần kinh động vật) xem hai tác nhân gây bệnh nguy hiểm đơn giản (Campbell, 2008) Bệnh virus vi khuẩn gây có tỉ lệ tử vong cho vật chủ cao so với tác nhân gây bệnh khác Hiện chưa có loại thuốc hay kháng sinh tác động hữu hiệu đến virus, chủng ngừa virus thơng qua tiêm phịng vaccin 1.1.2.1 Virus Virus xem tác nhân gây bệnh nguy hiểm khó kiểm soát nhất, phần lớn ca tử vong mắc bệnh truyền nhiễm tác nhân virus gây Virus dạng sống ký sinh nội bào bắt buộc Virus gồm lõi (axit nucleic) bọc vỏ capsid (protein), số chủng có thêm màng ngồi Virus gây độc vật chủ cách tiết enzyme thủy phân làm ly giải màng tế bào, thân lớp vỏ capsid virus độc tố gây độc tế bào ảnh hưởng đến q trình sinh hóa tế bào Hình thức sinh sản Chu kỳ sinh tan: virus xâm nhập tế bào chủ thông qua thụ thể đặc hiệu tồn tế bào chủ tiêm vật chất di truyền (DNA, RNA) vào tế bào chủ Virus trưng dụng hệ enzyme nguyên vật liệu (dNTPs, ) tế bào chủ để chép (tạo vật chất di truyền) phiên mã, dịch mã (tạo vỏ capsid) Hàm lượng vật chất di truyền vỏ capsid đủ lớn, chúng tự đóng gói lại với hồn thiện thành hạt virus hồn chỉnh Sau q trình đóng gói chúng làm chết tế bào cách ạt phá vỡ tế bào di chuyển sang tế bào lân cận hay thay đổi trạng thái sinh lý tế bào Chu kỳ tiềm tan: virus chèn vật chất di truyền chúng vào hệ gen tế bào chủ chép, phiên mã, dịch mã với hệ gen tế bào chủ Virus ở dạng tiềm tan khơng gây chết đến tế bào Bên cạnh đó, gặp số điều kiện kích thích định, virus ở dạng tiềm tan chuyển sang dạng sinh tan làm chết tế bào 1.1.2.2 Vi khuẩn Vi khuẩn xem bậc thầy khả thích nghi từ Deinococcus radiodurans sống ở xạ triệu rads đến Picrophilus oshimae sinh trưởng ở pH 0.03 (Campbell, 2008) Một số vi khuẩn có khả hình thành nội bào tử gặp điều kiện mơi trường bất lợi Vi khuẩn hay cịn gọi vi trùng (sinh vật nhân sơ) vừa sinh vật gây hại vừa sinh vật có ích trung lập, vi khuẩn gây hại phần lớn vi khuẩn có dạng sống dị dưỡng (ký sinh) có ích gồm dạng sống cộng sinh (hệ vi sinh đường ruột, ) số vi khuẩn có dạng sống tự dưỡng Vi khuẩn có cấu tạo phức tạp virus, gồm màng tế bào, vùng nhân, plasmid ribosome Hệ gene vi khuẩn có từ vài trăm đến vài nghìn gene Có hình dạng phổ biến gồm hình cầu, hình que hình xoắn Dựa vào cấu trúc bề mặt tế bào, vi khuẩn chia làm loại gồm khuẩn Gram (-) khuẩn Gram (+) Bên cạnh khả kháng kháng sinh nhờ cấu trúc màng ngồi, vi khuẩn cịn có plasmid R (DNA sợi đơn, dạng vòng) loại plasmid chứa gen kháng kháng sinh Khả sinh sản nhanh chóng ưu vi khuẩn, vi khuẩn sinh sản cách phân đôi, từ tế bào mẹ tạo thành hai tế bào y hệt chúng tiếp tục phân đôi Trong điều kiện tối thích hợp, nhiều chủng vi khuẩn 1-3 tiếng lại phân chia, số lồi tạo hệ thời gian 20 phút Vi khuẩn gây bệnh cách tạo chất độc gồm ngoại độc tố nội độc tố Ngoại độc tố protein tiết bởi vi khuẩn độc tố botulinum tạo thông qua lên men nhiều loại thức ăn Nội độc tố thành phần lớp màng lipopolysaccharide nhóm khuẩn Gram (-) 1.1.2.3 Động vật nguyên sinh Động vật nguyên sinh nhóm động vật đơn bào (hoặc đa bào) hay gọi ký sinh trùng thuộc nhóm nguyên sinh vật Một số chủng phổ biến gây bệnh ở gia cầm Histomonias -bệnh đầu đen, chi Eimeria – bệnh cầu trùng, bệnh ký sinh trùng máu Leucocytotozoone, loại bệnh giun, sán dây bệnh nghiêm trọng nhóm động vật đơn bào gây gia cầm Hình thức sinh sản nhóm động vật nguyên sinh phức tạp, số sinh sản vơ tính, số khác cịn sinh sản hữu tính sử dụng q trình hữu tính giảm phân thụ tinh Hoặc vừa sinh sản vơ tính vừa sinh sản hữu tính Chi Eimeria thuộc nhóm động vật nguyên sinh vừa sinh sản hữu tính vừa sinh sản vơ tính Động vật ngun sinh gây bệnh cách phá hủy tế bào, mô hay tổ chức quan enzyme thủy phân, ngoại tiết tố làm cân nội môi ly giải màng tế bào 1.2 Bệnh viêm ruột hoại tử (NE) ở gà và lợn NE bệnh nhiễm trùng ruột cấp tính; bệnh gây bởi vi khuẩn Clostridium perfringens, mức độ diện cao C perfringens môi trường bên lẫn bên thể dẫn đến bệnh phổ biến khắp giới bệnh có tỷ lệ tử vong cao đàn C perfringens loại vi khuẩn gần có mặt ở khắp nơi, từ đất, bụi, thức ăn đường ruột động vật Bệnh xảy thay đổi hệ vi sinh đường ruột tình trạng dẫn đến tổn thương niêm mạc ruột (chẳng hạn, bệnh cầu trùng, hay nhiễm khuẩn Salmonella thường tác nhân dẫn đến viêm ruột hoại tử) Tóm lại, yếu tố thúc đẩy phát triển mức C perfringens đường ruột làm xuất bệnh viêm ruột hoại tử (Vijay Durairaj, 2007) 1.2.1 Một số hiểu biết vi khuẩn Clostridium perfringens Vi khuẩn Clostridium perfringens (thuộc giống Clostridium) phát vào năm 1892, với tên gọi lúc đầu Bacillus aerogenes capsulatus Sau này, vi khuẩn đổi tên thành Bacillus enteritidis sporogenes, Bacillus perfringens, Bacterium welchii Clostridium welchii Mặc dù tên gọi khơng thức C welchii, sử dụng từ năm 1939 tìm thấy cách viết người Anh Từ năm 1980, tên khoa học thức vi khuẩn Clostridium perfringens (C perfringens) Phân loại khoa học Tên khoa học: Clostridium perfringens (C perfringens) Phân loại: Giới : Bacteria Ngành : Firmicutes Lớp : Clostridia Bộ : Clostridiales Họ : Clostridiaceae Chi : Clostridium Loài : C perfringens 1.2.1.1 Phân loại typ độc tố Trong trình sinh trưởng, C.perfringens sản sinh 17 loại độc tố khác nhau, dựa vào khả sản sinh loại độc tố độc tố alpha (a), beta (β), epsilon (ε), lota (ι) chủng vi khuẩn C.perfringens phân thành typ khác nhau, gọi typ độc tố (toxinotype: A, B, C, D, E) Typ A sinh độc tố α; typ B sinh độc tố α, β, ε; typ C sinh độc tố α, β; typ D sinh độc tố α, ε; typ E sinh độc tố α, ι (xem bảng 1) Bảng 1.1: Các typ độc tố vi khuẩn C perfringens Typ độc tố a β ε + A + + + B + + C + + D + E Chú thích: có sản sinh độc tố (+); không sản sinh độc tố (-) Ι + C perfringens typ A thường có ở đường ruột gà, lợn khoẻ với số lượng nhỏ, gặp điều kiện bất lợi thay đổi chế độ chăm sóc ni dưỡng, mật độ chăn ni cao nhiễm cầu trùng, vi khuẩn nhân lên nhanh chóng sản sinh độc tố (chủ yếu độc tố α) gây viêm ruột hoại tử C perfringens typ C phân lập từ gà khỏe, lợn khỏe độc tố α β xác định yếu tố độc lực chủ yếu trình sinh bệnh C perfringens typ C Type C perfringens A C perfringens C liên quan đến khả gây bệnh gia cầm chi C perfringens (H To, 2017) C perfringens không hoạt động 74oC 4oC Ở nước ta, C.perfringens typ A D đóng vai trò quan trọng bệnh viêm ruột tiêu chảy ở dê, cừu, trâu, bị; số chủng có độc lực mạnh (Lê Lập cs, 2009; Nguyễn Quang Tính, 2008; Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2010) 1.2.1.2 Đặc điểm hình thái C perfringens vi khuẩn yếm khí khơng triệt để (thường phải bổ sung - 10% CO2), khơng di động, hình thành giáp mơ mơ bào; trực khuẩn to, thẳng, hai đầu tròn, đứng riêng lẻ thành đơi, có kích thước từ 0,6 - 0,8 x - µm, bắt màu Gram dương Có dạng hình que sinh nội bào tử yếm khí có khả gây bệnh ở vật ni, động vật hoang dã ở người Khuẩn lạc tròn, nhẵn bóng bao bởi vịng bên dung huyết hoàn toàn ( độc tố beta) vịng bên ngồi khơng dung huyết hồn tồn( độc tố alpha) Người ta gọi tượng tượng dung huyết beta mơi trường ni cấy có bổ sung máu động vật Hình 1.1: Clostridium perfringens qua kính hiển vi 1.2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến bệnh viêm ruột hoại tử gà và lợn 1.2.2.1 Chế độ dinh dưỡng Chế độ ăn uống tạo thành yếu tố nguy có tác động mạnh mẽ đến tỷ lệ mắc bệnh viêm ruột hoại tử ở gà cơng nghiệp Protein chế độ ăn khó tiêu, chẳng hạn protein có động vật thịt bột xương bột cá, tiêu hóa hấp thụ ở phần đường ruột Thay vào đó, protein tích tụ ở phần đường ruột, sau hoạt động chất cho hệ vi sinh vật đường ruột Quá trình lên men protein tạo sản phẩm sản phẩm phụ gây bất lợi cho đường ruột amin, amoniac, tạo điều kiện thuận lợi cho tăng sinh vi khuẩn gây bệnh Một loạt thành phần thức ăn yếu tố tiêu hóa khiến vật ni bị viêm ruột hoại tử, bao gồm:  Protein khó tiêu hóa  Viêm ruột / kích thích / tổn thương  Chế độ ăn nhiều chất xơ, tăng trưởng nhanh, lượng cao, độ nhớt cao chế độ ăn giàu protein  Axit amin (mức độ thấp Arginine glutamine)  Mức độ cao axit lactic 1.2.2.2 Độc tố nấm mốc Mycotoxin - chất chuyển hóa nấm độc hại Độc tố nấm mốc hay cịn gọi độc tố chuyển hóa thứ cấp sản xuất bởi số loại nấm mốc phổ biến lẫn phần ăn gia cầm trực tiếp làm giảm tính tồn vẹn ruột Do dẫn đến giảm hấp thu tiêu hóa chất dinh dưỡng chế độ ăn uống tăng tính thấm ở ruột, hậu làm chức hàng rào biểu mô ruột Giảm hấp thu chất dinh dưỡng rò rỉ protein huyết tương vào lòng vi phạm dẫn đến tăng nồng độ protein lòng ruột, tạo chất cho tăng sinh C perfringens Mycotoxin ảnh hưởng xấu đến khả miễn dịch có mối tương quan chặt chẽ với nhiễm trùng đường ruột Với vô số tác hại mycotoxin, phát triển quy trình kiểm sốt tác hại độc tố mycotoxin điều cần thiết để bảo vệ toàn vẹn đường ruột lĩnh vực chăn ni nói riêng y tế nói chung Sự nhiễm thức ăn ở gà công nghiệp với độc tố nấm Fusarium deoxynivalenol fumonisin kết hợp hai yếu tố ảnh hưởng đến viêm ruột hoại tử ở gà thịt 1.2.2.3 Bệnh cầu trùng Những trường hợp nhiễm trùng cầu trùng phần lớn thay đổi yếu tố tự nhiên (nhiệt độ, độ ẩm, ) Bên cạnh đó, vaccine nguyên nhân gây nhiễm cầu trùng không sử dụng cách (chẳng hạn tình trạng sức khỏe vật chủ tiêm phòng) sử dụng vaccine không đạt tiêu chuẩn Bệnh cầu trùng thường dẫn đến tổn thương ở biểu mơ ruột, tổn thương gây cân nội môi bên quan ruột, tạo điều kiện thuận lợi cho phát triển C perfringens Sự tăng sinh kiểm soát C perfringens dẫn đến bệnh viêm ruột hoại tử ở vật chủ mắc phải 1.2.2.4 Paratyphoid Nhiễm khuẩn Salmonella thyphimurium ở gà yếu tố ảnh hưởng đáng kể viêm ruột hoại tử ở gà thịt 10 1.2.3 Bệnh viêm ruột hoại tử gà Viêm ruột hoại tử thường thấy ở gà thịt đến tuần tuổi nuôi lứa ở gà tây đến 12 tuần tuổi Bệnh tồn đàn từ đến 10 ngày, gây tử vong từ 2% đến 50% (Cẩm nang thú y Merck, 1998) Viêm ruột hoại tử thường mô tả ở gà thịt Tuy nhiên, lớp gà tây bị ảnh hưởng bởi tình trạng (Broussard et al., 1984; Gazdzinski Julian, 1991; Droual et al., 1994, 1995; Dhillon et al., 2004) 1.2.3.1 Triệu chứng lâm sàng Viêm gan viêm đại tràng liên quan đến viêm ruột hoại tử mô tả (Randal et al, 1983; Hutchincon Ridell 1990, Loveland Kaldhusdal 1999; Sasaki et al 2000) Viêm đường mật gây bởi thắt ống mật viêm C perfringens (Onderka et al 1990, Sasaki et al 2000), viêm gan hoại tử C perfringens ở gà nở (Sasaki et al 2003), viêm túi mật, lách mề xảy Bệnh có 02 dạng độc lực gồm: dạng độc lực cao có triệu chứng trầm cảm nặng, bỏ ăn, tiêu chảy sẫm màu lông xù, tỷ lệ chết cao Triệu chứng ở dạng độc lực thấp thường không rõ ràng, chúng ủ rũ, ăn ít, lơng xù giảm sản lượng trứng (Vijay Durairaj, 2007) Thời gian ủ bệnh từ đến 24 (thường 10-12) sau ăn thực phẩm bị ô nhiễm, bệnh kéo dài từ – 10 ngày, tỉ lệ tử vong – 50% Bệnh xảy với thể cấp tính thể mãn tính Thể cấp tính gà bệnh giảm ăn, chậm chạp, ỉa phân khơ có màu đen, đơi lẫn máu nhầy gần giống triệu chứng bệnh Cầu trùng Gà hay nằm sấp gục đầu, xã cánh, tự đứng di chuyển Trong thể mãn tính triệu chứng lâm sàng khơng điển hình Gà chậm lớn, giảm cân, ăn uống bình thường bị chết gầy Bệnh xảy ở thể cấp tính với tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết cao Bệnh có tính dịch địa phương, thường xảy ở đàn gà thịt 4-8 tuần tuổi 1.2.3.2 Bệnh tích gà Gà nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử thường có biểu sau: 11 - Gà gầy ốm - Niêm mạc đường ruột sưng có nhiều đốm đỏ tấy, xuất huyết thành vệt, thành mảng Rất nhiều trường hợp mổ thấy vùng viêm hoại tử tạo vết loét đám loét phủ lớp màu vàng ngà - Đặc biệt ở phần ruột già, chất chứa đường tiêu hóa có màu đậm, dính chặt thối - Bệnh viêm loét kéo dài thủng ruột, phân tràn ngồi gây viêm dính phúc mạc - Gan, lách khơng to màu sắc lại thay đổi Màu gan thâm vàng bình thường.Trên bề mặt gan có nhiều điểm lấm hoại tử màu vàng - Thân lách sưng to biến màu, khó quan sát điểm hoại tử 1.2.3.3 Đường truyền bệnh Vi khuẩn C perfringens loại vi khuẩn yếm khí sống đường ruột gây bệnh cho gà khơng có yếu tố thúc đẩy Các yếu tố nguy stress có hại gà đói, khát, thay đổi đột ngột nguồn thức ăn, nước uống, thức ăn bị ôi thiu, nấm mốc làm thay đổi môi sinh đường ruột cầu trùng, giun sán, rối loạn tiêu hóa Hay chuồng trại ẩm thấp, chất độn chuồng không không khô, cắt mỏ, Những lí có lợi cho việc phát triển C perfringens gây bệnh Nguy hiểm số chủng có khả sinh tồn cao, nhiễm bên trường, dụng cụ thiết bị người lí mang mầm bệnh vào đàn gà bệnh xảy với quy mơ lớn 1.2.1.4 Cơ chế sinh bệnh Cũng giống vi khuẩn E.coli, vi khuẩn C perfringen kí sinh bình thường đường ruột mà không gây bệnh Chúng tham gia vào trình lên men, phân hủy thức ăn giúp gà đồng hóa tăng trưởng tốt Thế có bệnh yếu tố thúc đẩy(đã nêu trên) làm cho nhu động đường ruột thay đổi tạo điều kiện thuận lợi cho C perfringens sinh trưởng nhanh, phá vỡ cân vi sinh có lợi cho vật chủ 12 Trên sở rối loạn tiêu hóa, bệnh cầu trùng, giun sán,… phá vỡ cấu trúc niêm mạc ruột tạo điều kiện cho C perfringens bám vào long mao niêm mạc ruột gây viêm xuất huyết hoại tử ruột Chúng không dừng lại ở mà tiếp tục vào đường huyết gây nên tượng nhiễm trùng máu C perfringens tồn lâu môi trường dịch thể máu, thể chúng bị phân hủy nhanh chóng sau chết giải phóng nội độc tố vào vật chủ, dẫn đến tình trạng bệnh vật chủ trở nên trầm trọng tử vong 1.2.4 Bệnh viêm ruột hoại tử lợn Bảng 1.2: Các type Clostridium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn Bệnh ở lợn Vi khuẩn Clostridium perfringens type A Viêm ruột hoại tử (sinh ngoại độc tố) Clostridium perfringens type C Viêm ruột hoại tử xuất huyết Clostridium difficile Viêm đại tràng 1.2.4.1.Triệu chứng lâm sàng Thể cấp tính: xảy nhanh vòng sau sinh, heo trở nên yếu ớt chết Thường khơng biểu triệu chứng bên ngồi, đơi quan sát thấy tiêu chảy máu Thể cấp tính: thường thấy heo khoảng – ngày tuổi Dấu hiệu chết kèm theo tiêu chảy máu, bệnh xảy nhanh, heo chết nhanh sau tiêu chảy máu Heo phân thường có màu nâu đỏ, ngà vàng, phân có chứa mảng nhầy niêm mạc ruột hoại tử màu nâu vàng có bọt, heo trở nên yếu dần chết sau – ngày mắc bệnh Thể mãn tính: Lợn tiêu chảy dai dẳng khoảng tuần Phân nhiều nước, màu vàng xám có lẫn chất nhày Heo gầy cịm nhợt nhạt, chết sau vài tuần còi cọc sau khỏi triệu chứng 13 1.2.4.2 Bệnh tích lợn Lợn nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử thường có biểu cụ thể sau: - Heo gầy còm, yếu ớt rõ rệt trước chết - Phù vùng bụng - Cả hệ thống tiêu hoá ở heo xung huyết xuất huyết - Ruột non xuất huyết, thành ruột non mỏng, chứa đầy khí, sinh thường ở vùng không tràng hồi tràng - Ruột già giãn, nhợt nhạt, chất chứa nhão - Tổn thương niêm mạc (màu đỏ màu đen), với xuất huyết dội bọt khí (hoặc sợi huyết + bọt khí) - Hạch bạch huyết màng treo ruột sung huyết hay xuất huyết - Biểu mơ bị hoại tử, xuất huyết khắp niêm mạc lớp niêm 1.2.4.3 Đường truyền bệnh Bệnh lan truyền qua đường tiêu hóa, thông qua nguồn nước thực phẩm bị ô nhiễm Do vi khuẩn Clostridium perfringens , chúng sống ruột già heo lứa tuổi Bình thường Clostridium perfringens diện ở quan tiêu hoá tất heo trước cai sữa Vi khuẩn xâm ngập vào heo qua tổn thương da tổ chức mô, da, đặc biệt giai đoạn nái nuôi nguồn truyền bệnh cho heo Nếu chăm sóc ni dưỡng khơng tốt, yếu tố ngoại cảnh xấu, sức đề kháng heo yếu thể heo dễ phát bệnh 1.2.4.4 Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn C perfringens có hệ vi sinh vật đường ruột bình thường động vật Vì thường có yếu tố gây nên bệnh tiêu chảy ở gia súc: thứ vi khuẩn sẵn có đường ruột, thứ hai thức ăn bị nhiễm khuẩn C perfringens, cùng với số thay đổi đột ngột môi trường, phần thức ăn, thức ăn chứa nhiều protein, dẫn tới thể bị giảm hấp thu ruột, giữ lại vi khuẩn thể cuối cùng thể hấp thu độc tố 14 gây bệnh Cacbon hydrate không tiêu hóa mơi trường thuận lợi cho vi khuẩn C perfringens sinh trưởng phát triển nhanh chóng Bình thường vi khuẩn có nhiều ở ruột già sức đề kháng thể giảm, vi khuẩn lại xâm nhập lên ruột non sản sinh lượng lớn độc tố, gây nhiễm độc huyết đường ruột Trong đường tiêu hóa, với bội nhiễm số lượng, vi khuẩn C perfringens công vào lớp màng nhầy vào lớp biểu mô ruột, tác dụng độc tố gây xuất huyết, hoại tử tổ chức nhung mao ruột, từ lan dần vào sâu tới lớp niêm mạc ruột Trong nhiều trường hợp, vi khuẩn xâm nhập sâu vào thành ruột tạo thành ổ viêm nhiễm, gây khí thũng lớp niêm mạc lớp hay sâu vào tổ chức hay hạch lympho lân cận 1.2.4.5 Chẩn đốn bệnh Chẩn đốn sơ thơng qua tổn thương quan sát nhuộm Gram, từ rút ngắn phạm vi tiến hành làm tan máu C.perfringens có khả làm tan máu Hoặc chẩn đốn cách ni cấy số mơi trường thích hợp kiểm định kết thơng qua phương pháp hóa sinh, 1.3 Một số phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm gia súc, gia cầm 1.3.1 Phương pháp truyền thống 1.3.1.1 Hóa sinh phân tích Hóa sinh phân tích phương pháp định tính định lượng sản phẩm tác nhân gây bệnh tiết Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh cách đưa vào môi trường nuôi cấy hợp chất tương ứng để enzyme mà tác nhân gây bệnh tiết phân giải chuyển hóa hợp chất đó, người làm thí nghiệm thu nhận kết thông qua xử lý liệu thu Phương pháp chủ yếu sử dụng vi khuẩn vi nấm, vi sinh vật có dạng sống tự dưỡng 15 1.3.1.2 Chẩn đoán bệnh dựa đặc điểm lâm sàng bệnh lý Trong trình mang bệnh, vật chủ biểu số triệu chứng (đáp ứng thể chống lại tác nhân lạ) định ảnh hưởng tác nhân gây bệnh (nội độc tố, ngoại độc tố, ) mang đến Mặt khác, kéo dài thời gian mang bệnh hình thành tổn thương vết bệnh tích số mơ quan bị nhiễm bệnh; hình dạng, màu sắc, kích thước vết bệnh tích phụ thuộc vào tác nhân gây bệnh Dựa vào yếu tố trên, người làm cơng tác chẩn đốn bệnh chẩn đốn sơ cá thể, quần thể nhiễm bệnh tác nhân gây ra, độ xác khơng đảm bảo 1.3.1.3 Chẩn đoán bệnh dựa cấu tạo hình thái kính hiển vi Chẩn đốn bệnh dựa cấu tạo hình thái phương pháp quan sát hình thái đặc điểm cấu tạo tác nhân gây bệnh thơng qua kính hiển vi quang học, từ kết quan sát người làm thí nghiệm nhận dạng tác nhân gây bệnh tình trạng bệnh nhiễm Phương pháp thường dùng chẩn đoán bệnh ký sinh trùng gây ra, phần lớn ký sinh trùng có đường kính lớn nên dễ dàng quan sát kính hiển vi tác nhân lại Ưu điểm phương pháp giá thành thấp, đơn giản tiết kiệm thời gian Nhược điểm hình thái, kích thước số phân loài chi có độ tương đồng cao nên khó mà phân biệt xác 1.3.2 Phương pháp đại 1.3.2.1 Phản ứng huyết học ELISA ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay – Xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme Phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptide, protein, kháng thể, hormone ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng Kĩ thuật ELISA gồm thành phần tham gia phản ứng (kháng thể, kháng 16 nguyên chất - chất tạo màu), kĩ thuật tiến hành qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: kết hợp kháng thể kháng nguyên - Phản ứng hóa học: sau kết hợp kháng thể kháng nguyên diễn ra, quan sát đọc kết thơng qua hoạt tính xúc tác enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử O từ H2O2 để oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỡn hợp dung dịch thí nghiệm Phân loại ELISA ELISA trực tiếp: kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp với giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) Tuy nhiên độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng nguyên có epitop, ở dạng sử dụng kháng thể ELISA gián tiếp: kháng nguyên cần phát gắn vào giá thể sau kết hợp với kháng thể đặc hiệu (khơng gắn enzyme), cuối chúng ủ với kháng kháng thể (có gắn enzyme) hình thành phức giá thể KN-KT-KKT Nhược điểm độ đặc hiệu kháng huyết (kháng kháng thể) khác Do cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để có kết tin tưởng ELISA Sandwich trực tiếp: “Sandwich” kết thí nghiệm đánh giá thông qua kết hợp hai loại kháng thể kháng thể bắt (capture antibodies) kháng thể phát (detection antibodies) ELISA Sandwich gồm dính thụ động kháng thể bắt vào pha rắn, kháng thể sau kết hợp với kháng nguyên, bổ sung kháng thể phát (có gắn enzyme) vào phức KT-KN ELISA Sandwich gián tiếp: Ngoài phức KT-KN-KT(không gắn enzyme) ELISA sandwich trực tiếp, ở dạng gián tiếp bổ sung kháng kháng thể (được gắn enzyme) kết hợp với phức KT-KN-KT hình thành phức KT-KN-KT-KKT 17 Hạn chế phương pháp ELISA - Khơng phản ánh xác độc lực chủng virus phân lập - Kết chẩn đốn dương tính giả (kháng thể từ mẹ thức ăn ảnh hưởng đến kết quả) - Kết chẩn đoán âm tính giả (bệnh ở giai đoạn nhiễm) 1.3.2.2 Phản ứng miễn dịch huỳnh quang IFA Phương pháp IFA (Immunoflourescence Assays - Xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang) phương pháp dựa kết hợp đặc hiệu kháng thể kháng nguyên, với số yếu tố khác chất đánh dấu huỳnh quang (thường FITC – Flourescein Isothiocynate), nguồn sáng huỳnh quang (tia UV) Đồng dạng với kỹ thuật ELISA, phức chất xuất màu chứng tỏ mẫu ta chẩn đốn dương tính (khơng loại trừ khả nhận dương tính giả) Ở kĩ thuật này, kháng thể gắn với kháng nguyên đánh dấu huỳnh quang, phức KT – KN – Chất đánh dấu huỳnh quang, kiểm tra kính hiển vi nguồn sáng UV, phức phát sáng Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp: sử dụng kháng thể liên kết hóa học với flourophore, kháng thể nhận dạng kháng ngun đích hình thành liên kết thụ thể đặc hiệu, hay cịn gọi epitop Sau đó, ta quan sát thấy bước sóng cụ thể bị kích thích kính hiển vi huỳnh quang Nhược điểm: nhạy so với phản ứng gián tiếp, tốn Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: sử dụng kháng thể kháng huyết (kháng kháng thể), kháng thể tạo liên kết với kháng nguyên đích, kháng kháng thể gắn flourophore hình thành liên kết với kháng thể Nhược điểm: phức tạp, nhiều thời gian 1.3.2.3 Phát trình tự DNA đặc hiệu lai với mẫu dò acid nucleic Phương pháp lai với mẫu dò axit nucleic phương pháp cho phép người làm thí nghiệm xác định trình tự DNA đặc hiệu từ hỗn hợp nhiều phân tử 18 DNA khác Ở đây, tế bào đưa lên màng nylon, màng nylon sau xử lý để phá vỡ tế bào biến tính DNA nhằm thu mạch đơn DNA dính kết màng Sau màng ủ dung dịch chứa phân tử mẫu dị đánh dấu phóng xạ có trình tự bổ sung với gen đích Màng sau đặt lên phim cho phép điểm phát phóng xạ tự chụp 1.3.3 Chẩn đoán kĩ thuật PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – Phản ứng chuỗi trùng hợp) kĩ thuật cho phép người làm thí nghiệm khuếch đại đoạn nucleotide đích (DNA hay RNA) mà khơng qua tạo dịng, nhằm mục đích lưu trữ hay sử dụng lĩnh vực sinh học phân tử Phương pháp Kary Mullis đưa năm 1985 Saiki hoàn thiện năm 1988 Kỹ thuật PCR ứng dụng nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính phơi, Ngun tắc kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR phương pháp tổng hợp DNA dựa mạch khn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA Primer đoạn DNA ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với mạch đoạn DNA khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn primer kéo dài để hình thành mạch (trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003) Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước sau : Bước 1: (Biến tính tách đơi sợi DNA, denaturation) Tiến hành gia nhiệt để tách sợi DNA kép thành sợi đơn Bước 2: (bắt cặp, annealing) Mồi bắt cặp bổ sung với sợi DNA đơn theo chiều 5' → 3' ủ ở điều kiện nhiệt độ thích hợp 19 Bước 3: (kéo dài, elongation – extension) DNA polymerase trượt phức mồi – DNA sợi đơn để bắt cặp loại Nu tương thích vào sợi DNA, hoàn thiện sợi DNA kép 1.3.3.1 Tối ưu hóa phản ứng PCR a) Thành phần phản ứng PCR DNA khuôn Sử dụng mẫu DNA chất lượng cao, DNA tinh khiết Nồng độ khuôn DNA từ 30 – 50ng (cho phản ứng 25µl), độ tinh khiết DNA tốt 1.77 – 1.89 (OD 260-280nm) Trong phản ứng PCR, nồng độ DNA cao có xu hướng làm giảm tính đặc hiệu đoạn DNA đích khuếch đại Mồi (Primer) Mồi đoạn oligonucleotide ngắn, sử dụng nhiều kỹ thuật chẩn đốn, phân loại, giải trình tự, Các đoạn mồi với vai trò bắt cặp bổ sung với đoạn gene đoạn DNA (RNA) đích, từ người làm thí nghiệm khuếch đại chúng theo chu kỳ PCR Chiều dài mồi nên từ 17 – 28 bazơ nitơ Tỷ lệ G – C đoạn mồi 50% – 60% Nhiệt độ nóng chảy (Tm) thường khoảng 55 – 65oC Nồng độ lý tưởng mồi 10pM PCR Master Mix PCR Master Mix dung dịch hỗn hợp gồm enzyme DNA polymerase, dNTPs, MgCl2 đệm (buffer) - dNTPs (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) nguyên liệu để tổng hợp sợi bổ sung; 800µM dNTPs (200µM tương ứng với mỡi loại) cho phản ứng 50µl, 400µM dNTPs cho phản ứng 25µl (geneticeducation.co.in) - MgCl2 cofactor DNA polymerase; nồng độ MgCl2 từ 1.0 – 2.0µM (tối đa 5.0µM) phản ứng PCR - Đệm (buffer) đóng vai trị dung dịch đệm tạo mơi trường tối ưu cho phản ứng PCR 20 DNA polymerase DNA polymerase enzyme xúc tác cho tổng hợp DNA Nồng độ enzyme tối ưu phản ứng đặc trưng cho loại phản ứng, nồng độ cho phản ứng PCR ứng dụng chẩn đoán phổ biến từ 0.8 - 1U Có nhiều loại Taq DNA polymerase khác sử dụng kỹ thuật PCR, tùy thuộc vào mục đích thí nghiệm mà lựa chọn enzyme cho phù hợp Các loại enzyme gồm: i-taq, one taq, hot start (enzyme liên kết với kháng thể), Pfu, Q5 DNA polymerase, (Genetic Education, 4/2019) b) Chu kỳ nhiệt Biến tính - Nhiệt độ biến tính thường khoảng 900C – 98oC, đặc trưng cho phản ứng - Nhiệt độ hay thời gian biến tính phụ thuộc vào tỉ lệ G:C - Đối với hầu hết phản ứng PCR, thời gian biến tính từ 1s – 10s cho mỗi chu kỳ Gắn mồi - Ta (nhiệt độ gắn mồi) tối ưu thường thấp khoảng 5oC so với Tm (nhiệt độ kéo dài chuỗi) - Các giá trị để ước tính Ta gồm Tm, tỉ lệ G:C đoạn mồi độ dài mẫu DNA đích - Các mồi có Tm cao ( > 60oC ) cho kết khả quan Kéo dài chuỗi - Tm khuyến nghị từ 65oC – 75oC, đặc trưng cho phản ứng; - Thời gian kéo dài chuỗi dao động từ 10s – 60s; - Tăng thời gian kéo dài ch̃i có xu hướng làm xuất băng giả giảm sản lượng đoạn khuếch đại 1.3.3.2 Một số phương pháp PCR cải tiến Kĩ thuật Real-time – PCR: kĩ thuật PCR mà kết khuếch đại DNA đích hiển thị sau mỡi chu kỳ phản ứng PCR, tương đồng với 21 việc người làm thí nghiệm khơng cần phải làm tiếp thí nghiệm khác để thu nhận kết Kĩ thuật RT – PCR: kĩ thuật khuếch đại DNA với nguyên liệu RNA, theo nguyên lí phiên mã ngược RNA thành cDNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Kĩ thuật ứng dụng chẩn đốn tác nhân có hệ gene RNA Kĩ thuật có dạng dạng thường real-time Kĩ thuật Nested – PCR: kĩ thuật nhằm làm giảm khả xuất liên kết không đặc hiệu, cải thiện độ nhạy độ đặc hiệu phản ứng PCR Nested-PCR sử dụng cặp mồi khác tương ứng với phản ứng PCR liên tiếp Sản phẩm lần PCR với cặp mồi đầu ủ phản ứng tiếp tục với cặp mồi thứ hai Kĩ thuật Multiplex – PCR: kĩ thuật đồng thời khuếch đại số chuỗi DNA khác với nhiều mồi đặc hiệu với chuỗi DNA Ứng dụng nhiều chẩn đoán cùng lúc nhiều chủng mẫu bệnh phẩm 1.3.3.3 Một số thành tựu lĩnh vực chẩn đoán bệnh PCR a) Thành tựu ở Việt Nam  Trên gia cầm: Nguyễn Thị Loan cộng chẩn đốn thành cơng bệnh viếm phế quản truyền nhiễm (INFECTIOUS BRONCHITIS- IB) gà ở số tỉnh phía Bắc Việt nam kĩ thuật RT-PCR (9/2016) Mẫu bệnh phẩm sử dụng nghiên cứu bao gồm phổi, khí quản thận gà đẻ trứng giống ISA Brown nghi mắc bệnh IB thu thập ở số trang trại thuộc Ba Vì Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT - PCR để chẩn đoán bệnh IB gà cặp mồi IBF/IBR đặc hiệu cho gene S1 IBV (Feng et al., 2012) Cặp mồi gồm có mồi xi IBF: 5’ -TTTTGGTGATGACAAGATGAA-3’ mồi ngược IBR: 5’-GCATTGTTCCTCTCCTC - 3’ Sản phẩm PCR thu có kích thước theo cơng bố khoảng 403 bp Phản ứng PCR thực theo 22 chương trình sau: 94°C phút; 94°C 30 giây, 54°C 30 giây, 72°C 45 giây lặp lại 30 chu kỳ; 72°C 10 phút Sản phẩm PCR kiểm tra gel agarose 1,5% Kết chẩn đoán cho thấy 34/71 (47,88%) mẫu bệnh phẩm cho kết dương tính với IBV Xác định diện Duck circovirus (DuCV) Riemerella anatipestifer (RA) từ ca bệnh bại huyết vịt Bùi Hữu Dũng cộng (2016) 76 mẫu bệnh phẩm (não, tim, lách, gan, túi fabricius túi khí) thu thập phương pháp mổ khám thường quy 76 ca bệnh có dấu hiệu bại huyết vịt ở tỉnh thành khác ( Bến Tre, Tiền Giang, Bình Dương, Bà Rịa-Vũng Tàu TP HCM) Hai cặp mồi sử dụng phản ứng PCR để phát DuCV DuCV/F 5’ - CCCGCCGAA AACAAGTATTA - 3’, DuCV/R 3’TCGCTCTTGTACCAATCACG-5’ RA/F 5’-TAGCAT CTCTTGGATTCCCTTC 3’; RA/R 3’ - CAGTTTTTAACCACCATTACCC - 5’ (Fringuelli cs, 2005; Rubbenstroth cs, 2013) Phản ứng PCR quy trình luân nhiệt tối ưu hiệu chỉnh ở phịng thí nghiệm cho xét nghiệm DuCV RA với tng lng phn ng l 25àl, gm 10àl GoTaqđ Green Master Mix 2x (Promega, Mỹ), 1µl mồi xi (10pmol), 1µl mồi ngược (10pmol), 3µl khn mẫu (DuCV: 1300ng/μl; RA: 1250ng/μl; xác định kỹ thuật đo OD) 10µl nước PCR free-nuclease Nồng độ mồi nhiệt độ bắt cặp phản ứng PCR cho thấy tối ưu (sản phẩm rõ nét) ở mức µl (10pmol/µl)/phản ứng 540C (RA), 450C (DuCV) Phản ứng PCR phát bệnh DuCV thực theo chương trình sau: 94°C phút; 94°C 45 giây, 54°C 30 giây, 72°C 30 giây lặp lại 35 chu kỳ; 72°C phút Phản ứng PCR phát bệnh RA thực theo chương trình sau: 95°C phút; 94°C 45 giây, 54°C 30 giây, 72°C 45 giây lặp lại 35 chu kỳ; 72°C phút Kết Sản phẩm PCR gel điện di 1,5% (100V) thời gian 25 phút ở kích thước 230bp 338bp tương ứng DuCV RA giải trình tự so sánh độ tương đồng với 70 chủng DuCV 17 chủng RA cho kết tương đồng ở 97- 99% 23 94-100% (GenBank, NCBI) Nguyễn Tiến Minh cộng sử dụng kỹ thuật real-time PCR để chẩn đoán nhanh cúm A/H5N1 virus hợp bào đường hô hấp (2007)  Trên gia súc, vật nuôi: Nguyễn Tuấn Anh cộng xây dựng thành công quy trình Multiplex PCR phát ba lồi vi khuẩn có khả gây tiêu chảy cấp ở lợn bao gồm Salmonella spp., Clostridium perfringens E coli ETEC bệnh phẩm, phân mô ruột DNA sau tách chiết nhân phản ứng multiplex PCR Hỗn hợp phản ứng multiplex PCR bao gồm 1U hTaq DNA polymerase (Solgent), 200 µM dNTPs, mM MgCl2, 1X PCR buffer, 200 nM mồi CL-F/R, 200 nM mồi EC-F/R, 350 nM mồi SA-F/R, 50 nM mồi chứng nội IC (Porcine β-actin) µl DNA tách chiết tổng thể tích phản ứng 25 µl Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: 15 phút ở 950C, 40 chu kỳ lặp lại gồm 30 giây ở 940C, 30 giây ở 610C 30 giây ở 720C, phút ở 720C Sản phẩm nhân phân tích qua điện di gel agarose 2% với thang phân tử 100 bp (Solgent) Kết cho thấy, sản phẩm nhân phản ứng monoplex PCR với vi khuẩn có kích thước phù hợp với kích thước dự kiến, 570 bp S typhimurium, 158 bp E coli (ETEC), 327 bp cho C perfringens 243 bp cho chứng nội Các sản phẩm nhân bản, kiểm tra giải trình tự, phù hợp với trình tự gene tương ứng công bố Võ Tấn Đạt cộng so sánh hiệu chẩn đoán bệnh Care chó phương pháp gồm: xét nghiệm nhanh RT-PCR (2016) Mẫu bệnh phẩm dịch tiết mắt, mũi chó chưa tiêm vacxin có biểu nghi ngờ bệnh Care Xét nghiệm nhanh thực theo quy trình KIT thương mại (Asan Pharm, Hàn Quốc) Xét nghiệm dựa vào nguyên lí ELISA để phát kháng nguyên CDV Đầu tiên dùng tăm vô trùng thấm dịch mắt mũi chó, cho tăm bơng chứa mẫu dịch vào ống nghiệm có chứa dung dịch bảo quản pha lỗng Trộn mẫu ống nghiệm, để 24 lắng phút Xé bao đựng thiết bị xét nghiệm, đặt lên mặt phẳng, dừng pipet hút dịch nổi, nhỏ 3-4 giọt vào vùng S ( vị trí nhỏ mẫu) Đọc kết 5-10 phút Kết dương tính xuất hai vạch đỏ (test line) ở vị T C, kết âm tính xuất vạch đỏ ở vị trí đối chứng C Xét nghiệm cần thực lại vạch đối chứng C không xuất Phản ứng RT-PCR, dùng tăm vô trùng lấy dịch mắt mũi 72 chó nghi bệnh Care, cho tăm lấy mẫu vào ống Eppendorf vơ trùng có chứa sẵn 300 µl dung dịch đệm PBS (Phosphat buffer saline) Đoạn mồi phản ứng RT-PCR Cặp mồi đặc hiệu với gen N sử dụng phản ứng RT-PCR bao gồm mồi xuôi N-F 5’ACAGGATTGCTGA GGACCTAT-3 Mồi ngược N-R 5’- CAAGATAACCA TGTACGGTGC-3’ với kích thước sản phẩm 287 bp chu trình luân nhiệt sau: phiên mã ngược ở nhiệt độ 420C 15 phút, 940C 10 phút; với 40 chu kỳ lặp lại: 940C phút, 59,50C phút, 720C phút; 720C 10 phút (Frisk ctv,1999) Tương tự, cặp mồi đặc hiệu với đoạn gen H sử dụng phản ứng RT-PCR với kích thước sản phẩm 613 bp gồm mồi xi DHI-F 5’-TGGTTCACAAGATGGTATTC-3’, mồi ngược DHI-R 5’-CAACA CCACTAAATTGGACT - 3’và chu trình luân nhiệt sau: phiên mã ngược ở nhiệt độ 450C 45 phút, 940C phút, với 30 chu kỳ lặp lại: 940C 30 giây, 510C 30 giây, 720C 30 giây; 720C 10 phút (Gasmiz ctv, 2011) Quy trình RT-PCR thiết kế với thành phần phản ứng sau: 10 µl Go taq® green master mix 2X (Promega, Mỹ); µl MgCl2 (25 mM); 0,5 µl M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus); 0,5 µl mồi xi; 0,5 µl mồi ngược µl mẫu RNA chiết tách 8,5µl nước tinh Sản phẩm RT-PCR điện di gel agarose với nồng độ 1,5% (trong TBE 0,5X) hòa tan với (3µl/100ml TBE 0,5X) ethidium bromide Điện di sản phẩm RT-PCR (10 µl) ở 100V 40 phút Sản phẩm khuếch đại đọc trực tiếp qua máy chiếu tia UV Sáu sản phẩm RT-PCR dương tính với virus Care (khuếch đại đoạn 613 bp gen H) Kết nghiên cứu cho 25 thấy chẩn đoán bệnh Care dựa triệu chứng lâm sang cho tỷ lệ dương tính 58,33% 66,67% so sánh với phương pháp xét nghiệm nhanh kỹ thuật RT-PCR Chẩn đốn thành cơng Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) xác định typ 1, 2, 5, kỹ thuật PCR Ngũn Đình Qt cộng (2015); Đỡ Tiến Duy cộng phát triển quy trình multiplex PCR để chẩn đoán vi khuẩn virus gây bệnh rối loạn hô hấp heo (2015); Võ Khánh Hưng cộng (2012) định lượng định chủng virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo kỹ thuật real-time RT-PCR Kiều Mạnh Hùng (2012) nghiên cứu chế tạo kit RT-PCR để chuẩn đốn virus lở mồm long móng (LMLM) đại diện lưu hành ở Việt Nam Huỳnh Thị Mỹ Lệ cộng (2012) nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật NESTED PCR phát định Type Porcine Circovirus Type (PCV2) ở đàn lợn nuôi số tỉnh miền Bắc b) Thành tựu giới Magouz cộng (2018) chẩn đoán ILTV gà bị nhiễm bệnh ở Ai Cập phương pháp chẩn đoán khác Yan Zhao cộng (2013) chẩn đoán ILTV gà nhiễm bệnh tự nhiên gà nhiễm bệnh thực nghiệm kỹ thuật real-time PCR Phát xác định type độc tố C perfringens kỹ thuật PCR bởi Josephine (Wu cộng sự, 2008) Fumiya Kawahara cộng (2008) thành công ứng dụng kỹ thuật real-time PCR để phát phân loài chi Eimeria Hakan Kalender (2004) phân lập C perfringens chẩn đoán thành cơng gene mã hóa độc tố type α kỹ thuật PCR Ứng dụng thành công kỹ thuật multiplex-PCR để phát phân biệt loài Eimeria gây bệnh gia cầm (S Fernandez cộng sự, 2003) Ahsani M R cộng (2010) xác định phân lập thành công chủng C.perfringens kĩ thuật Multiplex – PCR Mẫu bệnh phẩm 26 lấy từ phân 130 cừu ở vùng phía nam Iran Sử dụng mồi ( Cpa, Cpb, etx , iap) để phát loại Phản ứng PCR thực với thể tích 50 µL thành phần gồm: μL of 10x PCR buffer (10 mM TrisHCL, pH 9.0, 50 mM KCl), μL 50 mM MgCl2, 250 μM of each deoxynucleotide triphosphate, U of Taq DNA polymerase, 100 pmol mồi μL DNA.Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR : 95°C 10 phút , với 35 chu kì lặp lại 94°C 45 giây, 55°C 30 giây, 72°C 90 giây Sản phẩm PCR điện di gel agarose với nồng độ 1,5% bổ sung ethidium bromide Kết phân lập thành cơng 23 loại xét nghiệm sinh hóa với tỷ lệ 17.39% type A, 21.74% type B, 34.78% type C, 26,09% type D Sử dụng cặp mồi thích hợp nhân xác định đoạn gen độc tố định Gen mã hóa độc tố khuếch đại phương pháp PCR đơn, đoạn 324 bp thuộc gen độc tố α, chia sẻ bởi tất loại Mặt khác, đoạn 196 bp từ gen mã hóa độc tố β, tồn ở loại B C Đoạn 655 bp từ gen mã hóa độc tố ε quan sát ở loại D Gen mã hóa độc tố ι có loại E tạo mảnh 446 bp Piatti R M cộng (2004) nghiên cứu phân lập chủng C perfringens PCR Cặp mồi đặc hiệu sử dụng Cpa : Cpa/ F 5’ GCT AAT GTT ACT GCC GTT GACC 3’ Cpa /R 3’ TCT GAT ACA TCG TGT AAG 5’ Phản ứng PCR thực với thể tích 50 µL thành phần gồm: 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KCl, 50 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 10 pmol mồi Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR : 95oC phút , lặp lại 35 chu kì phút ở 94oC, 1phút ở 53oC, phút ở 72oC, 10 phút ở 72oC C perfringens type A ATCC 3624 sử dụng làm đối chứng dương, nước làm đối chứng âm Sản phẩm PCR đem điện di 10 µL gel agarose % đệm TBE 0.5 X (0.045M Tris-borate and 1mM EDTA, pH 8.0) bổ sung 0.5 µg/mL ethidium bromide Kết cho thấy, phân lập 89 chủng C perfringens sản phẩm nhân phản ứng PCR với có kích thước phù hợp với kích thước dự kiến 324 bp 27 CHƯƠNG II MỤC TIÊU, NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu đề tài 2.1.1 Mục tiêu tổng quát Phát nhanh bệnh viêm ruột hoại tử ở gà lợn chủng vi khuẩn Clostridium perfringens kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm hoàn thiện kit chẩn đoán bệnh ứng dụng lĩnh vực chẩn đoán bệnh truyền nhiễm gia cầm, gia súc 2.1.2 Mục tiêu cụ thể - Tìm hiểu qui trình tách chiết DNA loại mẫu bệnh phẩm khác chẩn đoán lâm sàng - Tìm hiểu tham khảo/thiết kế cặp mồi đặc hiệu tác nhân gây bệnh truyền nhiễm sử dụng để chẩn đoán đề tài nghiên cứu - Tối ưu hóa nhiệt độ cho cặp mồi đặc hiệu gradient nhiệt - Xác nhận diện tác nhân gây bệnh có mẫu bệnh phẩm chẩn đoán lâm sàng kỹ thuật PCR 2.2 Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu tác nhân gây bệnh truyền nhiễm gà lợn : Clostridium perfringens 2.3 Phạm vi nghiên cứu - Phạm vi thời gian: thời gian nghiên cứu từ tháng 09/2019 đến tháng 05/2020 - Phạm vi không gian: thí nghiệm thực phịng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ gen Di truyền phân tử, Viện CNSH Lâm nghiệp – Đại học Lâm Nghiệp 2.3 Nội dung nghiên cứu - Tách chiết DNA từ loại mẫu bệnh phẩm khác - Tham khảo lựa chọn cặp mồi đặc hiệu để phát chủng gây bệnh 28 viêm ruột hoại tử ở gà lợn - Tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi cặp mồi sử dụng đề tài nghiên cứu - Xác nhận diện tác nhân gây bệnh mẫu bệnh phẩm tương ứng 2.4 Mẫu bệnh phẩm, hóa chất và trang thiết bị sử dụng nghiên cứu 2.4.1 Mẫu bệnh phẩm Sử dụng mẫu máu, mẫu mô, mẫu phân từ đối tượng gà lợn chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử 2.4.2 Hóa chất thí nghiệm - Bộ Kit “G-spinTM Total DNA - NaCl bão hòa Extraction Kit” - Nitơ lỏng - Tris-HCl - Cồn 70o, cồn 100o - EDTA - Proteinase K, RNase - SDS 20% - PCR Master Mix 2X - Nucleic acid Loading dye 6X - H2O đề ion (dH2O) - TAE 50X - Redsafe - Agarose - dNTPs - MgCl2 2.4.3 Trang thiết bị nghiên cứu Sử dụng máy móc, thiết bị phịng thí nghiệm cơng nghệ gen, Viện CNSH Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Các thiết bị bao gồm: tủ an toàn sinh học cấp 2, nồi hấp khử trùng, bể ổn nhiệt, lị vi sóng, máy vortex, máy ly tâm lạnh, máy PCR, máy điện di, máy soi gel, cân điện tử, tủ lạnh tủ lạnh sâu 2.4.4 Dụng cụ thí nghiệm - Pipet pipet tips - Chai, lọ thủy tinh; - Ống ly tâm 1.5ml 2ml, Ống - Bảng đổ gel, lược, bể điện di; 29 PCR 0.2ml; - Ống đong; - Bộ cối chày sứ; - Dao, kẹp 2.5 Phương pháp nghiên cứu 2.5.1 Thu nhận, bảo quản mẫu bệnh phẩm - Thu nhận mẫu:  Mẫu máu: thu nhận cách cắt tiết gà lấy máu từ vùng tĩnh mạch cánh gà kim tiêm  Mẫu mô: thu nhận mẫu nội tạng quan sát thấy vết bệnh tích có nội tạng tương ứng với chẩn đoán lâm sàng  Mẫu phân : phân lấy tăm tiệt trùng - Bảo quản mẫu:  Các ống chứa chất chống đông (EDTA) dùng để chứa bảo quản mẫu máu  Các ống chứa cồn tuyệt đối dùng bảo quản mẫu ruột  Các mẫu bệnh phẩm bảo quản thùng nhựa giữ nhiệt chứa đá khô tạo mơi trường thích hợp để ức chế hoạt động enzyme có sẵn mẫu bệnh phẩm Các mẫu bệnh phẩm sau bảo quản tủ lạnh 4oC sử dụng 2.5.2 Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm Mẫu máu ruột tách chiết theo bước nhà sản xuất cung cấp Kit “G-spinTM Total DNA Extraction Kit” InTRON - Hàn Quốc Bộ Kit thiết lập dựa phương pháp tách chiết DNA cột Silica (kỹ thuật tách chiết DNA pha rắn/lỏng), xem phương pháp sử dụng rộng rãi phịng thí nghiệm tiết kiệm thời gian thí nghiệm suất tách chiết DNA cao (geneticeducation.co.in) 2.5.3 Kỹ thuật PCR Phản ứng PCR thực để nhân đoạn gen mục tiêu với thành phần phản ứng bảng 2.1 30 Các cặp mồi sử dụng đề tài mô tả bảng 2.2 Thể tích hỡn hợp mỡi phản ứng PCR 20l, chứa thành phần nồng độ chất tham gia phản ứng Chu kỳ nhiệt cho PCR: 950C phút; (950C: 30 giây, tiến hành thí nghiệm gradient PCR với dải nhiệt độ 500C - 600C: 30 giây, 720C: phút) lặp lại 35 chu kỳ; 720C 10 phút; bảo quản sản phẩm PCR ở 40C Được mô tả qua bảng 2.3 Bảng 2.1: Thành phần phản ứng PCR Nồng độ Hóa chất Đệm 2X dNTPs 2mM Taq DNA polymerase 5U PCR Master Mix 2x Thể tích (µ) 10 Mồi xi/ngược 10µM DNA khn 20-50ng Nước deion Tổng 20 Bảng 2.2: Mồi sử dụng đề tài Tên Trình tự mồi 5’ – 3’ 16S_F 16S_R AAAGATGGCATCATCA TTCAAC TACCGTCATTATCTTC CCCAAA Tỉ lệ G-C % 36 Kích Tm thước o C mồi (bp) 55 Kích thước đoạn Nguồn khuếch đại (bp) Rong-Fu 22 279 Wang cộng 41 31 55 22 (1994) Bảng 2.3 : Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Các bước Số chu kì Nhiệt độ (oC) Thời gian Khởi động 95oC phút 95oC 30 giây 500C - 600C 30 giây 72oC phút 72oC 10 phút 4oC ∞ Tách mạch Gắn mồi 35 Kéo dài Ổn định Bảo quản 2.5.4 Kỹ thuật điện di Chuẩn bị dung dịch đệm Công thức: 980mL nước cất + 20mL TAE 50X tạo thành 1L dung dịch đệm TAE 1X, tương ứng với pha loãng 50 lần dung dịch TAE 50X Sử dụng dung dịch đệm TAE 1X để pha gel agarose Chuẩn bị gel điện di Pha 50ml gel agarose với nồng độ 1% agarose, đong 50ml TAE 1X thêm 0.5g agarose, lắc nhẹ đồng dung dịch lị vi sóng Quan sát thấy agarose tan hoàn toàn, để nguội đến khoảng 60oC bổ sung thuốc nhuộm axit nucleic Redsafe, lắc nhẹ cho tan Redsafe đổ bảng gel cài lược sẵn, chờ gel đặc lại ở nhiệt độ phịng Với gel khơng sử dụng Redsafe, mix mẫu DNA PCR với dye liên kết ethidium bromide Hiệu chỉnh thông số Thiết lập hiệu điện thế, phổ từ 60 – 80V, thời gian từ 30 phút đến 1h, hiệu điện cao sinh lượng lớn nhiệt làm ảnh hưởng đến q trình di chuyển DNA, cịn ở hiệu điện thấp kéo dài thời gian điện di Thu nhận xử lý số liệu Kết điện di quan sát tia UV, xuất băng vạch DNA lên màu hồng cam kích thước tương đối băng vạch tính tốn dựa marker DNA 100bp 32 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách chiết DNA Đối với bệnh truyền nhiễm ở gia súc, gia cầm trước tiến hành lấy mẫu để tách chiết DNA phải có thông tin loại tác nhân gây bệnh, quan mô nơi tác nhân gây bệnh ký sinh Từ đó, đưa định thu loại mẫu bệnh phẩm để tách chiết axit nucleic (DNA, RNA) phục vụ cho việc phát bệnh phương pháp PCR Cụ thể, với tác nhân gây bệnh virus thu dịch thể mơ để tách chiết axit nucleic, vi khuẩn thu dịch thể, mô, ký sinh trùng thu dịch thể, mơ, phân 3.1.1 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm lợn Hình 3.1: Kết kiểm tra DNA tởng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác lợn chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử gel agarose 1% Trong đó, mẫu máu (giếng 1), mẫu phân ( giếng 2), mẫu ruột (giếng 3) lợn chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử Hình 3.1 kết tách chiết DNA tổng số từ 03 mẫu bệnh phẩm lợn chẩn đoán mắc bệnh viêm ruột hoại tử DNA tách từ mẫu máu (Giếng 1, Hình 3.1) mẫu ruột (Giếng 3, Hình 3.1) có chất lượng tương đối tốt, hàm lượng DNA không nhiều đủ tiêu chuẩn để làm khuôn cho phản ứng 33 PCR Riêng DNA tách từ mẫu phân (Giếng 2, Hình 3.1) gần khơng quan sát thấy băng sáng nhiên sản phẩm tách DNA sử dụng để tiến hành phản ứng PCR PCR kỹ thuật nhạy cần lượng nhỏ DNA khn nhân đoạn gen mong muốn 3.1.2 Kết tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm gà DNA tách chiết từ mẫu máu sử dụng kit tách chiết “G-spinTM Total DNA Extraction Kit” theo hướng dẫn sử dụng Kết tách chiết DNA từ 06 mẫu máu bệnh phẩm thể hình 3.2 Trong đó, 04 mẫu máu chẩn đốn bệnh viêm ruột hoại tử có chất lượng hàm lượng DNA khác (Hình 3.2A) Cụ thể, mẫu số 01 có hàm lượng DNA lớn so với mẫu lại chất lượng DNA tương đối tốt thể vạch sáng rộng dải smear (tạo thành DNA bị đứt gãy thành đoạn nhỏ) ngắn bên vạch DNA (Giếng 1, Hình 3.2A) Mẫu 02 03 có hàm lượng DNA thấp hẳn so với mẫu 01, chất lượng DNA tương đối tốt (Giếng 2, 3; Hình 3.2A) Riêng mẫu số 04 gần khơng nhìn thấy vạch sáng DNA, điều cho thấy hiệu tách chiết DNA từ mẫu chưa tốt (Giếng 4; Hình 3.2A) mẫu khơng sử dụng cho bước nghiên cứu Hình 3.2: Kết kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm khác gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử Trong đó, mẫu máu (A), mẫu ruột (B) gà chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử 34 Kết tách chiết DNA tổng số từ 02 mẫu bệnh phẩm ruột Gà thể ở Hình 3.2B Trong đó, mẫu số 01 có hàm lượng DNA tương đối lớn DNA bị đứt gãy thể ở dải smear kéo dài xuống phía (Giếng 1, Hình 3.2.B) Sự đứt gãy DNA trình nghiền mẫu nitơ lỏng với lực mạnh thời gian nghiền mẫu khơng hồn tồn bảo quản lạnh nitơ, mà có thời điểm mẫu nghiền hết nitơ tạo điều kiện enzyme DNase tế bào hoạt động cắt phần DNA tổng số thành đoạn ngắn Với hàm lượng DNA lớn mẫu 01 cần pha lỗng 50 lần để đạt hàm lượng DNA thích hợp cho tiến hành phản ứng PCR Mẫu 02 không xuất vạch DNA (Giếng 2, Hình 3.2.B), điều cho thấy hiệu tách chiết DNA mẫu 02 không đạt mẫu không sử dụng cho bước nghiên cứu Nguyên nhân nhầm lẫn cột chứa dung dịch có DNA ống ly tâm 2.0ml khơng chứa DNA Vì vậy, tách chiết DNA người làm thí nghiệm cần phải tập trung cẩn thận với bước trình làm thí nghiệm, tránh chủ quan dẫn đến sai sót 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn Tiểu đơn vị nhỏ 16S - rRNA hai tiểu phần quan trọng cấu thành nên ribosome vi khuẩn, chúng ngắn (chỉ 1.542 nucleotide) Với vai trò quan trọng việc dịch mã tổng hợp nên protein ribosome tính bảo thủ lồi sinh giới cao, hầu hết lồi cịn tồn đến hậu duệ loài tổ tiên từ 3,5 tỷ năm trước (Campbel cộng sự, 2008) Tuy nhiên, gen 16S - rRNA từ vi khuẩn khác có vài nucleotide khác nằm rải rác trình tự, dựa vào sai khác mà gen 16S-rRNA thường sử dụng để phân biệt loài Bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn loài vi khuẩn C perfringens gây nên Chủng vi khuẩn C perfringens diện ở quan tiêu hóa, chủ yếu ruột non Trong nghiên cứu này, 16S-rRNA chọn làm đối tượng 35 để thiết kế mồi nhằm phát tác nhân gây bệnh C perfringens mẫu bệnh phẩm thu từ cá thể lợn chẩn đoán lâm sàng Cặp mồi 16S_F/R sử dụng nghiên cứu bắt cặp bổ sung với đoạn gen mã hóa cho 16S - rRNA C perfringens (Wang cộng sự, 1994) Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA có kích thước 279bp đặc hiệu loài C perfringens Wang cộng (1994) công bố nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 55oC, từ tham khảo chúng tơi chọn dải nhiệt độ 50oC, 52oC, 55oC, 58oC, 60oC để thực phản ứng PCR gradient nhằm tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu Đối với DNA tách từ mẫu máu ruột lợn không xuất sản phẩm PCR ở tất nhiệt độ Mẫu phân hàm lượng DNA tổng số ít, khơng nhìn thấy ảnh điện di kiểm tra DNA tổng số (Giếng 2, Hình 3.1) xuất sản phẩm PCR ở bốn nhiệt độ 52oC, 55oC, 58oC, 60oC, riêng ở nhiệt độ 50oC khơng xuất sản phẩm PCR (Hình 3.3) Dựa vào độ sáng băng sản phẩm PCR hình 3.3 cho thấy nhiệt độ gắn mồi thích hợp cặp mồi 16S_F/R 60oC Hình 3.3: Kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 16S_F/R mẫu DNA tách từ phân Heo chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử Nhiệt độ gắn mồi tương ứng 500C (giếng 1), 520C (giếng 2), 550C (giếng 36 3), 580C (giếng 4), 600C (giếng 5), M: ADN Marker 100bp Hình 3.4: Kết PCR với cặp mồi 16S_F/R Trong đó: giếng –mẫu máu ; giếng – mẫu phân; giếng – mẫu ruột, giếng – đối chứng âm không bổ sung DNA khuôn mà thay nước, M: marker 100bp Trong thí nghiệm cặp mồi 16S_F/R sử dụng để nhân đoạn gen 16S-rRNA 03 mẫu bệnh phẩm lợn (mẫu máu, ruột phân) Kết hình 3.4 có mẫu phân cho kết dương tính với băng DNA đặc hiệu với kích thước gần 300 bp kích thước dự kiến (Giếng 2, Hình 3.4), cịn mẫu từ máu ruột khơng xuất băng sản phẩm PCR Với kết này, chúng tơi khẳng định mẫu phân lợn sử dụng nghiên cứu có nhiễm vi khuẩn C perfringens Hai mẫu lại máu ruột, lấy cùng lợn lại khơng xuất băng DNA đặc hiệu lợn nhiễm khuẩn vi khuẩn chưa xâm nhiễm vào máu ruột Một điều quan trọng mẫu DNA tách từ phân gần không xuất điện di gel agarose 1% kết PCR lại khẳng định có DNA mẫu tách chiết với hàm lượng nhỏ Tuy nhiên, hàm lượng DNA đủ để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân thành công đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens 37 3.2 Kết phát bệnh viêm ruột hoại tử ở gà Bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủng vi khuẩn C perfringens gây nên Do đó, cặp mồi 16S_F/R sử dụng để phát bệnh viêm ruột hoại tử gà Nhiệt độ gắn mồi cặp mồi 16_F/R tối ưu ở thí nghiệm 60oC Phản ứng PCR thực 03 mẫu DNA tách từ máu 01 mẫu DNA tách từ ruột Kết phản ứng PCR thể hình 3.5 Hình 3.5: Kết nhân đoạn gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens từ mẫu bệnh phẩm gà Giếng 1: Đối chứng âm (không bổ sung DNA khuôn mà thay H2O); giếng 2: mẫu ruột 01; giếng 3-5: mẫu máu 01-03; M: DNA marker kb Trong tổng số 04 mẫu DNA tách chiết từ 01 mẫu ruột 03 mẫu máu gà có mẫu ruột cho kết dương tính với cặp mồi 16S_F/R Sản phẩm PCR từ mẫu ruột có kích thước 279bp dự kiến với băng DNA đặc hiệu (Giếng 2, Hình 3.5) Kích thước đoạn DNA khuếch đại sử dụng cặp mồi 16S_F/R ở nhiệt độ gắn mồi 60oC thu từ mẫu ruột tương đồng với kết Rong-Fu Wang cộng (1994) Điều khẳng định việc sử dụng kỹ thuật PCR để phát bệnh 38 viêm ruột hoại tử ở gà khả thi loài C perfringens tác nhân gây bệnh mẫu gà nghiên cứu Tuy nhiên, mẫu DNA từ máu lại không xuất băng DNA dự kiến (Giếng 3, 4, 5; Hình 3.5) Mẫu DNA tách từ máu không xuất sản phẩm PCR đặc hiệu mẫu bệnh phẩm khơng chứa DNA lồi vi khuẩn C perfringens Nguyên nhân tác nhân gây bệnh chưa xâm nhiễm vào hệ thống máu Hoặc q trình sinh sản vơ tính C perfringens bị bất hoạt bởi thuốc kháng sinh sử dụng điều trị cho gà nên ở mẫu máu khơng cịn tồn tác nhân gây bệnh Bên cạnh đó, khả tồn C perfringens máu thấp, vi khuẩn C perfringens loại vi khuẩn yếm khí sống đường ruột Mẫu ruột cho lên băng DNA đặc hiệu với đoạn gen 16S rRNA chủng vi khuẩn C perfringens, nhiên băng DNA không sáng nét Do vi khuẩn bám lông nhu ruột, kí sinh nên thu thập mẫu tách DNA mẫu DNA có chứa DNA vi khuẩn, từ cho kết dương tính với cặp mồi 16S_F/R Băng lên khơng rõ số khuếch đại đoạn DNA đích vi khuẩn C perfringens tương đối thấp Trong nghiên cứu Josephine Wu cộng (2008) phát gen mã hóa độc tố 16S rRNA vi khuẩn Clostridium perfringens ở mẫu mô ngâm paraffin PCR với cặp mồi 16S_F/R DNA pha loãng 10 lần từ 5.105 đến copy chạy với chu trình nhiệt 35 chu kỳ phút ở 94°C, phút ở 53°C, phút ở 72°C cho kết dương tính với cặp mồi 16S_F/R phát C perfringens Qua cho thấy phản ứng PCR có độ nhạy cao dù số lượng đoạn DNA đích khuếch đại khơng cao vi khuẩn phát Tương tự Rong-Fu Wang cộng (1994) phát nhanh chóng gen 16S-rRNA vi khuẩn C perfringens có loại thực phẩm (đùi gà) sau chế biến, cặp mồi 16S_F/R với phương pháp PCR Phản ứng chạy với chu trình nhiệt 95°C phút , 35 chu kỳ 95°C giây, 55 giây phút 39 ở 76°C Các sản phẩm PCR đoạn DNA 279 bp Tất chủng C perfringens thử nghiệm cho kết dương tính xét nghiệm PCR Qua cho thấy phản ứng PCR có độ nhạy cao xác Thực phẩm sau chế biến cịn tồn vi khuẩn, phản ứng PCR phát cách nhanh chóng kịp thời xử lí Như vậy, chúng tơi thành cơng việc chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử mẫu ruột ở gà kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 16S_F/R Chẩn đoán bệnh viêm ruột hoại tử kỹ thuật PCR cho ta kết xác nhanh chóng, q trình chẩn đốn khoảng 04 Điều đặc biệt quan trọng việc lập kế hoạch phịng ngừa hiệu chương trình kiểm soát bệnh viêm ruột hoại tử Từ kết thấy chẩn đốn bệnh phương pháp truyền thống có độ tin cậy thấp, nhiều tác nhân gây bệnh khác có biểu bệnh lý giống có biểu triệu chứng tương tự Vì vậy, để phịng ngừa kiểm sốt dịch bệnh hiệu cần phải kết hợp chẩn đoán lâm sàng chẩn đoán kỹ thuật PCR dịch bệnh có tính nguy hại cao Đối với bệnh vi khuẩn gây yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thành cơng phương pháp chẩn đốn PCR xác định loại mẫu bệnh phẩm chứa nhiều mầm bệnh để từ tách chiết DNA RNA vi khuẩn gây bệnh Đối với cặp mồi 16S_F/R cần tiếp tục nghiên cứu tối ưu phương pháp tách chiết DNA từ mẫu máu, cụ thể tách chiết DNA từ mẫu huyết tương khơng sử dụng mẫu máu tổng số Có thể tiếp tục thu thêm loại mẫu bệnh phẩm khác từ gà chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử để tìm loại mẫu bệnh phẩm cho kết chẩn đốn bệnh xác Để phát bệnh gia súc, gia cầm phương pháp PCR cần đảm bảo điều kiện sau: Tách chiết ADN từ mẫu bệnh phẩm tối ưu hóa phản ứng PCR nhân đoạn gen đặc hiệu tác 40 nhân gây bệnh sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng Do đó, kit phát bệnh ở gia súc, gia cầm bao gồm: hóa chất tách chiết ADN, hóa chất PCR, hóa chất chạy điện di Trong nghiên cứu này, quy trình hồn chỉnh từ nhận mẫu bệnh phẩm tới trả kết tối ưu hóa với tổng thời gian 04 (Hình 3.6) Điều cho thấy hiệu việc sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán sớm bệnh ở gia súc, gia cầm Hình 3.6: Quy trình phát bệnh ở gia súc, gia cầm phương pháp PCR 41 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã tách chiết thành công DNA từ mẫu bệnh phẩm thu được, bao gồm: mẫu máu, mẫu ruột, mẫu phân từ lợn chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử; mẫu máu mẫu ruột từ gà chẩn đoán nhiễm bệnh viêm ruột hoại tử - Đã phát thành công bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn phương pháp PCR sử dụng cặp mồi 16S_F/R để phát loài vi khuẩn C perfringens Trong đó, bệnh viêm ruột hoại tử phát hiệu với mẫu bệnh phẩm phân, mẫu máu mẫu ruột khơng phát - Đã phát thành công bệnh viêm ruột hoại tử ở gà chủng vi khuẩn C perfringens gây kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi 16S_F/R Tuy nhiên, kết phát bệnh thành công mẫu ruột, cịn mẫu máu khơng phát 4.2 Kiến nghị Do thời gian thực đề tài hạn chế, nên số kết chưa đạt mong muốn Do đó, đề tài có số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu sử dụng cặp mồi 16S_F/R phát loài vi khuẩn C perfringens gây bệnh viêm ruột hoại tử đối tượng gia súc, gia cầm khác - Tiếp tục sử dụng đoạn gen 16S - rRNA để nhận biết phát typ khác vi khuẩn C perfringens 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Khánh Hưng cs, 2012, “Xác định quy trình real-time RT-PCR với chất nhuộm Evagreen định lượng định chủng virut gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp heo”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 1, Tập 19, 30-35 Đỗ Tiến Duy cs, 2015, “Phát triển quy trình multiplex PCR phát mầm bệnh vi khuẩn virus gây rối loạn hơ hấp heo”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 7, Tập 22, 28-36 3.Nguyễn Đình Quát cs, 2015, “Chẩn đoán Actinobacillus Pleuropneumoniae (APP) xác định typ 1,2,5,8 kỹ thuật PCR”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Nông Lâm nghiệp, Số 3, 15-20 Nguyễn Thị Loan cs, 2016, “Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR để chẩn đoán bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (Infectious Bronchitis) ở gà đẻ trứng số tỉnh phía Bắc Việt Nam”, Tạp chí khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Số 9, Tập 14, 1387-1394 Đỗ Tiến Duy cs, 2016, “Xác định diện Duck Circovirus Reimerella Anatipestifer từ ca bệnh bại huyết vịt kỹ thuật PCR”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 6, 14-21 Nguyễn Tiến Minh cs, “Ứng dụng kỹ thuật real-time PCR để chẩn đoán nhanh cúm A/H5N1 virus hợp bào đường hơ hấp”, Tạp chí cơng nghệ sinh học, Số 1, Tập 5, 19-24 Võ Tấn Đại cs, 2016, “So sánh hiệu chẩn đoán bệnh Care chó phương pháp xét nghiệm nhanh kỹ thuật RT-PCR, phân tích đoạn gen hemagglutinin virus gây bệnh”, Tạp chí khoa học kỹ thuật Thú y, Số 8, Tập 23, 29-36 Tiếng Anh S Fernandez, et al, 2003, “A multiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of the seven Eimeria species that infect domestic fowl”, Parasitology, Vol.127, No.4, 317-325 Hakan Kalender, 2004, “Isolation of Clostridium perfringens from Chickens and Detection of the Alpha Toxin Gene by Polymerase Chain Reaction (PCR)”, Turk J Vet Anim Sci, Vol.29, No.3, 847-851 10 F Kawahara, et al, 2008, “Detection of five avian Eimeria species by species-specific real-time polymerase chain reaction”, 10.1637/8351050908-Reg.1 11 Josephine Wu, et al, 2008, “Detection and Toxin Typing of Clostridium perfringens in Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue Samples by PCR”, 10.1128/JCM.01324-08 12 Yan Zhao, et al, 2013, “Detection of Infectious Laryngotracheitis Virus by Real-Time PCR in Naturally and Experimentally Infected Chickens”, 10.1371/journal.pone.0067598 13 A Magouz, et al, 2018, “Detection of infectious laryngotracheitis virus (Gallid herpesvirus-1) from clinically infected chickens in Egypt by different diagnostic methods”, Iran J Vet Res, Vol.19, No.3, 194-201 14 R F Wang, et al, 1994, “A 16S rDNA-based PCR method for rapid and specific detection of Clostridium perfringens in food”, 10.1006/mcpr.1994.1018 15 H Hamidinejat, et al, 2010, “Characterization of Eimeria Species in Commercial Broilers by PCR Based on ITS1 Regions of rDNA”, Iranian J Parasitol, Vol.5, No.4, 48-54 16 Siun Chee Tan, at el, 2009, “DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present”, J Biomed Biotechnol, 10.1155/2009/574398 17 Sara Samadi Shams, et al, 2011, “Highly effective DNA Extraction Method from Fresh, Frozen, Dried Clotted Blood Samples”, Bioimpacts, Vol.1, No.3, 183-187 18 Narsin Mohammadi, et al, 2015, “A simple, Inexpensive and Safe Method for DNA Extraction of Frigid and Clotted Blood Samples”, Novelty in Biomedicine, Vol.3, No.3, 10.22037/nbm.v3i3.9507 19 Jorge C Pereira, et al, 2011, “An Efficient Method for Genomic DNA Extraction from Different Molluscs Species”, Int J Mol Sci, Vol.12, No.11, 8086-8095 20 Saeed El-Ashram, et al, 2016, “Nuleic Acid protocols: Extraction and Optimization”, Biotechnol Rep (Amst), Vol.12, 33-39 21 Lihua Xiao, et al, 2000, “Identification of Species Sources of Cryptosporidium Oocysts in Storm Waters with a Small-Subunit rRNABased Diagnostic and Genotying Tool”, Appl Environ Microbiol, Vol.66, No.12, 5492-5498 22 Shan-Chia Qu, et al, 2012, “Infectious Laryngotracheitis Virus in Chickens”, World J Virol, Vol.1, No.5, 142-149 23 Jennifer Humberd, et al, 2002, “Detection of Infectious Laryngotracheitis Virus in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue by Nested Polymerase Chain Reaction”, Avian Diseases, Vol.46, No.1, 54-74 24 Salameh Barhoom, et al, 2012, “Molecular Diagnosis of Explosive Outbreak of Infectious Laryngotracheitis(ILT) by Polymerase Chain Reaction in Palestine”, Iraqi Journal of Veterinary Medicine, Vol.36, No 2, 104-109 25 T J Bagust, et al, 2000, “Avian Infectious Laryngotracheitis”, Rev sci tech Off int Epiz, Vol.19, No.2, 483-492 26 Furkan Alaraji, et al, 2019, “Molecular detection and Phylogenetic tree of infectious laryngotracheitis virus in layers in Al-Diwaniyah province,Iraq”, Veterinary World, Vol.12 27.Vasudevan Gowthaman, et al, 2014 “Molecular detection and characterization of infectious laryngotracheitis virus (Gallid herpesvirus1) from clinical samples of commercial poultry flocks in India”, Virusdisease, Vol.25, No.3, 345-349 28 Vijay Durairaj, et al, 2007, “Necrotic Enteristis”, Center of Excellence for Poultry Science, University of Arkansas, Vol.9, No.2 29 Rosa Estela Quiroz-Castañeda, et al, 2015, “Control of Avian Coccidiosis: Future and Present Natural Alternatives”, Biomed Res Int, Vol.2015, Artile ID: 430610 30 J I Rood, et al, 1991, “Molecular genetics and pathogenesis of Clostridium perfringens”, Microbiol Rev, Vol.55, No.4, 621-648 31 H To, et al, 2017, “Experimental induction of necrotic enteritis in chickens by a netB-positive Japanese isolate of Clostridium perfringens”, J Vet Med Sci, Vol.79, No.2, 350-358 32 Sourabh Sharma, et al, 2015, “Phathomorphological alterations associated with chicken coccidiosis in Jammu division of India”, J Parasit Dis, Vol.39, No.2, 147-151 33 V Vrba, et al, 2011, “The discovery of the two types of small subunit ribosomal RNA gene in Eimeria mitis contests the existence of E mivati as an independent species”, Vet Parasitol, Vol.183, No.1-2, 47-53 34 M W Shirley, et al, 1983, “Studies to determine the taxonomic status of Eimeria mitis, Tyzzer 1929 and E.mivati, Edgar and Seibold 1964”, Parasitology, Vol.87, Pt.2 35 D L J Lafontaine, et al, 2001, “The funtion and synthesis of ribosomes”, Nature Reviews Molecular Cell Biology, Vol.2, No.7, 514-520 36 Si Ming Man, et al, 2010, “The Internal Transcribed Spacer Region, a New Tool for Use Species Differentiationn and Delineation of Systematic Relationships within the Campylobacter Genus”, Appl Environ Microbiol, Vol.76, No.10, 3071-3081 37 Campbell, et al, 2008, Sinh học tái lần (Biology 4th Fourth Edition) Trang Web 38 https://www.nhandan.com.vn/kinhte/item/8045602-.html 39 Pountryhub: Necrotic Enteritis http://www.poultryhub.org/health/disease/ types-of-disease/necrotic-enteritis/ 40 Billy M Hargis, et al, “Overview of Necrotic Enteritis in Poultry”, MSD Veterinary Manual https://www.msdvetmanual.com/poultry/necroticenteritis/ overview-of-necrotic-enteritis-in-poultry 41 Farm Health Online – Animal Health and Welface Knowledge Hub, https://www.farmhealthonline.com/disease-management/poultrydiseases/coccidiosis-in-poultry/ 42 http://geneticeducation.co.in/different-types-of-dna-extraction-methods/