Thông tin tài liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VŨ THỊ NHƢ TRANG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM VŨ THỊ NHƢ TRANG XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SO SÁNH TRÌ NH TƢ̣ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE Chuyên ngành : SINH HỌC THƢ̣C NGHIỆM Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : PGS TS Nguyễ n Trọng lạng THÁI NGUYÊN, 2009 THÁI NGUYÊN, 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lời cam đoan LỜI CẢM ƠN Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình PGS TS Nguyễn Tôi xin cam đoan là công trì nh nghiên cứu của Các kết quả, số liệu nêu luận văn là trung thực và chưa từng được công bố bất kỳ công trì nh nào khác Trọng Lạng suốt quá trình hoàn thành luận văn này Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ các thầy cô giáo Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Ngun , phịng thí nghiệm Khoa Hóa Tác giả luận văn an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phịng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học Vũ Thị Nhƣ Trang và Công nghệ Việt Nam và một số gia đì nh ở Cao Thượng - Tân Yên - Bắc Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tì nh việc nghiên cứu t hực nghiệm đề tài Cuối cùng tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban giám hiệu, Khoa Sau đại học , Ban chủ nhiệm Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bản luận văn này Tác giả Vũ Thị Nhƣ Trang Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nhƣ̃ng tƣ̀ viết tắt Danh mục các bảng Bảng Tên bảng DNA Deoxyribonucleotide acid RNA Ribonucleotide acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate bp Base pair EDTA Ethylene diamine tetra – acetic acid 3.2 Hàm lượng cholesterol trứng các mẫu nghiên cứu 33 EtBr Ethidium bromide 3.3 Các điểm nucleotide khác biệt mẫu gà Ác và Tre so 43 Kb Kilo base PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus SDS Sodium Dodecyl Sulphate gallus gốc Nhật mã số AB114078 TAE Tris- acetate-EDTA COI Cytochrome oxidase I PBS Phosphate Buffer Saline epp eppendorf Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1 Trang Kết quả c hiều cao và diện tí ch peak cholesterol chuẩn ở 20 các nồng độ khác 3.1 Kết quả chiều cao và diện tí ch peak cholesterol trứng 32 các mẫu nghiên cứu với gà Ri 3.4 3.5 http://www.lrc-tnu.edu.vn Thống kê các điểm đa hình mẫu gà nghiên cứu so với Hệ số tương đồng về tr ình tự nucleotide vùng D -loop ở 43 45 mẫu nghiên cứu với một sớ mẫu GenBank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Danh mục các hì nh MỤC LỤC Lời cam đoan Hình Tên hì nh Trang Lời cảm ơn 1.1 Cấu trúc hoá học cholesterol Danh mục các bảng 1.2 Bản đồ gen mtDNA gà nhà Gallus gallus 12 Danh mục các hì nh 2.1 Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak 20 Mở đầu chuẩn cholesterol 2.2 1.Đặt vấn đề Đường chuẩn cholesterol dựa theo chiều cao các peak 21 chuẩn cholesterol 3.1 Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Biểu đồ hàm lượng cholesterol trứng các mẫu 33 nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm 3.2 Kết quả điện di DNA tổng số 35 1.1.1 Gà Á 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 36 1.1.2 Gà Ri 3.4 So sánh trình tự đoạn D -loop mẫu gà Ri, Ác, Tre 41 1.1.3 Gà Tre với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà 1.2 Cholesterol Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 3.5 Quan hệ di trùn sớ giớng gà 1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol trứng gà 46 1.2.2 Nhu cầu cholesterol người 1.2.3 Vai trò cholesterol thể 1.2.4 Tác hại cholesterol thể vượt quá mức bình thường 1.3 Đặc điểm DNA ty thể 10 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự DNA ty thể 10 1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá DNA ty thể 11 1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà 12 1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà thế giới và Việt Nam 14 1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà thế giới 14 1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà Việt Nam 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mở đầu Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đặt vấn đề 2.1 Vật liệu 18 Hiện nay, ngành chăn ni có bước phát triển mạnh mẽ với xu 2.1.1 Nguồn gốc mẫu 18 hướng chăn nuôi theo đường công nghiệp hoá Đặc biệt, ngành chăn nuôi 2.1.2 Đị a điểm thí nghiệm 18 gia cầm được quan tâm hàng đầu vì có khả cung cấp lượng 2.2 Hoá chất và thiết bị 18 lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với 2.2.1 Hóa chất 18 2.2.2 Thiết bị sử dụng 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol 19 2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 22 2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật 22 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA gel agarose 25 nhu cầu tuyệt đại đa số người dân Sự phát triển nhanh chóng ngành chăn nuôi gia cầm thế giới đã tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm nước ta về cấu, quy mô, loại hình chăn ni Sớ đàn gia cầm có sớ lượng lớn và sở chăn nuôi tập trung với quy mô lớn tăng lên Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm phẩm chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả thích nghi cao 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop kỹ thuật PCR 26 với nhiều điều kiện sống địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu 2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 29 khắc nghiệt 2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA 31 Trong năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 31 và tinh thần người được nâng cao Chất lượng bữa ăn gia đình Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN đã được cải thiện nhiều Cũng vì lí đó, người đã 3.1 Hàm lượng cholesterol trứng các mẫu nghiên cứu 33 mắc nhiều bệnh khác Trong đó, bệnh điển hình 3.2 Xác định trình tự nucleotide vùng D-loop và đánh giá đa dạng chất lượng bữa ăn nâng cao là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết di truyền mẫu gà nghiên cứu 35 áp cao, thiểu mạch vành, nhồi máu tim, tai biến mạch máu não 3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 35 Những bệnh chiếm khoảng 25% tổng sớ nguyên nhân tử vong các nước 3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop DNA ty thể 36 3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 48 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC 54 phát triển thuộc thế giới tây phương Có nhiều nguyên nhân k hác dẫn tới bệnh , nguyên nhân quan trọng là hàm lượng cholesterol thể cao Khi chế độ ăn uống thay đổi thì hàm lượng cholesterol thay đổi theo Những nguồn thực phẩm giàu cholesterol là loại thức ăn có ng̀n gớc động vật là bầu dục, não, tim, lịng đỏ trứng Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn thích ăn trứng gà và coi là ng̀n thực phẩm gia đình Trong trứng, đặc biệt là lịng đỏ có hàm lượng cholesterol cao Có nhiều loại Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm trứng khác trứng gà, trứng chim, trứng vịt Mỗi giống gà khác Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa kết thì trứng có hàm lượng cholesterol khác Như vậy việc lựa ḷn rằng: gà nhà có chung ng̀n gớc từ gà rừng Gallus gallus Gà chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dờn theo mùa, trứng bé, có khả bay xa Cơ cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là quan trọng sở kết luận là gà nhà có nhiều đặc điểm giớng gà rừng về đặc điểm Đồng thời cùng với sự phát triển kĩ thuật sinh học phân tử, chúng muốn xác định sự đa dạng di truyền mức phân tử các giống gà qua nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể các giớng gà hình thái đến cấu tạo giải phẫu các phận bên thể, tiếng gáy, tập tính hoạt động Theo loại hình gà có thể chia thành kiểu: Xuất phát từ lý chúng đã tiến hành đề tài : “ Xác định hàm lượng cholesterol trứng so sánh trình tự vùng điều khiển D- Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ cong và nhọn Kiểu Malaysia (gà chọi): lơng và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, loop DNA ty thể gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi Bắc Giang” mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ Mục tiêu nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trứng giống gà Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể giống gà đỏ, mỏ tương đối ngắn Từ loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các - Đánh giá quan hệ di truyền các giống gà giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày Theo Nguyễn Ân (1983) [1], vị trí gà nhà được xếp hệ Nội dung nghiên cứu - Xác định hàm lượng cholesterol trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre thống giới động vật sau: - Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể gà Ri, gà Ác, Giới động vật (Animal) gà Tre Ngành động vật có xương sớng (Chordata) + Tách DNA tổng số từ máu các giống gà Lớp chim (Aves) + Nhân vùng D-loop kĩ thuật PCR Bộ gà (Galliformes) + Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự giống gà Họ Trĩ (Fasianidea) Chủng Gallus (giống gà Bankip ) - Xác định mối quan hệ di truyền các giống gà nghiên cứu với sớ Lồi Gallus gallus giớng gà đã được cơng bớ trình tự vùng D-loop Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Gà được thuần hoá đầu tiên Ấn Độ cách 5000 năm, sau là Ba Tư Nhờ sự tiến công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương lưng, mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, tốt cho người ốm dậy và sau sinh châu Á, sau nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là nước Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công gà Ác để tạo giớng gà Anh, sau là Mỹ, các giớng gà này được lai tạo thành nhiều giớng gà có cho nhiều trứng thời gian sớm Theo PGS.TS Trịnh Công Thành, suất cao Đại học Nông Lâm Thành phớ Hờ Chí Minh, là lần đầu tiên người ta áp Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm vùng Vĩnh Phú, dụng biện pháp thụ tinh nhân tạo giống gà Ác dịng gà Ác có lơng Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân gà Ri chân dịng gà Ác khơng có lơng chân Kết quả, qua thế hệ chọn lọc và tạo nhân dân ta đã tạo được nhiều giớng gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà dịng, nhóm nghiên cứu đã tạo dịng gà Ác mới gà Ác có lơng chân Đơng Tảo, gà Vàng … gà Ác khơng có lơng chân cho sản lượng trứng cao (38/100 cho trứng) mà 1.1.1 Gà Ác trước là 29/100 cho trứng) Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson Đây là loại gà cỡ nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng các giống gà khác, lông trắng mượt, toàn da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có ngón 1.1.2 Gà Ri Gà Ri là giống gà nội phổ biến nước ta chiếm 70% tổng số gà nước, có ng̀n gớc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu đờng sơng Cửu Long gallus Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có cưa, mào đỏ tươi miền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữa phát triển trớng; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng Cổ dài vừa nhiều bệnh, không dám nuôi tràn lan vì khả cho thịt thấp mà phải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có xen giá thành lại cao Nhưng sớng ngày càng lên, đặc sản quý mới lẫn màu đỏ tươi Bàn chân có ngón, cựa phát triển sớm gà trống Màu được biết hết giá trị Gà Ác đã được ni nhiều miền Trung và miền lông khác mái và trớng Con mái có màu lơng màu vàng rơm, Bắc Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng vàng đất, nâu nhạt và đốm Con trớng có màu lơng đỏ sẫm, đầu lơng cánh Yên Lúc này thì người nuôi mới thấy là giống gà nhanh nhẹn, chăm và lông đuôi, lơng bụng đỏ nhạt vàng đất Ngoài cịn có màu lơng chịu khó nhặt nhạnh kiếm mời, chịu lạnh tớt và có sức sớng cao Như thế khác lơng trắng, hoa mơ, đớm trắng có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh (nuôi Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh gà Mía, Đơng Tảo nên có ch̀ng) đều được cả Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác giàu axit khả chịu đựng tốt nuôi điều kiện thời tiết lạnh Gà Ri đẻ trứng amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit Trứng chúng nhỏ (chỉ sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi Sản lượng trứng gà mái khoảng 29-30 g) tỉ lệ lòng đỏ lại cao, đến 34,2% [12] năm từ 80-120 quả Khối lượng trứng bình quân 38 – 42 g Gà Ri có khới Theo y học cổ trùn, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, không lượng thể tuổi trưởng thành sau: trống từ 1,800 g đến 2,500 g, độc, có tác dụng bổ dưỡng cao Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau mái từ 1,300 g đến 1,800 g Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn Đây là giớng gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn ni quảng khác nội tạng động vật: tim, gan và đặc biệt trứng gà là loại thực canh nước ta Gà chịu khó kiếm ăn ni điều kiện chăn thả phẩm có chứa nhiều cholesterol, đó chủ yếu là lòng đỏ trứng gà vườn hay ngoài đồng Hàng ngày người nuôi phải cho ăn ít, vài lịng trắng thì khơng có [15], [18], [28] nắm thóc vãi cho cả đàn gọi chúng về chuồng, ngoài chúng tự kiếm đủ 1.2.2 Nhu cầu cholesterol ngƣời được thả ngoài vườn [4], [7], [8] Cholesterol là chất béo steroid cần thiết cho thể, có màng tế bào tất cả các mô thể và được vận chuyển huyết tương mọi 1.1.3 Gà Tre Là giống gà địa phương được nuôi số tỉnh Nam Bộ Việt Nam Kích thước gà nhỏ con, gà trớng có lơng màu trắng, đuôi và cổ đen Gà mái màu vàng, thấp chân Gà trống và gà mái nhỏ gà Ri Gà Tre có tập tính là hay bay và đậu hàng rào Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh Trong năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồn quỹ gen các loại gia cầm nước ta động vật thể người Cholesterol thể người có ng̀n gớc: - Cholesterol hấp thụ qua đường tiêu hoá (cholesterol từ thức ăn) hay gọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol) - Cholesterol hình thành tế bào hay cholesterol nội sinh (endogenous cholesterol) và chủ yếu được hình thành từ gan [15], [28] Tuy vậy, tất cả các tế bào thể có khả tổng hợp lượng 1.2 Cholesterol nhỏ cholesterol Chất này tham gia hình thành cấu trúc tế bào Khi lượng 1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol trứng gà Cholesterol là chất béo steroid, kém tan nước tan nhiều cholesterol hấp thu qua đường tiêu hoá tăng dẫn đến tăng nhẹ nồng độ mỡ và có thể tạo este với axit béo, không thể tan và không di chuyển cholesterol huyết tương Tuy nhiên, lượng cholesterol hấp thụ tăng ức dạng tự máu Cholesterol có cơng thức cấu tạo sau: chế enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp cholesterol nội sinh Đây là yếu tố chế điều hoà ngược để điều chỉnh nờng độ cholesterol máu Chính vì vậy nồng độ cholesterol máu dao động khoảng 15% ảnh hưởng cholesterol thức ăn Sự thay đổi lớn hàm lượng cholesterol phần có thể dẫn đến làm thay đổi nờng độ cholesterol máu tới 30% Đồng thời các chất béo bão hoà phần ăn làm tăng cholesterol từ 15 - 25% Hình 1.1 Cấu trúc hố học cholesterol 1.2.3 Vai trò cholesterol thể Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc bản cholesterol là Khoảng 80% lượng cholesterol thể được chuyển thành cholic nhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA phần phân tử axit tại gan Cholic axit kết hợp với các thành phần khác hình thành muối cholesterol là rượi cờn (alcohol) Cholesterol có nhiều loại thực phẩm mật có tác dụng xúc tác quá trình tiêu hoá và hấp thụ các chất béo Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn - Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các đường: Xơ vữa thành mạch (xơ vữa động mạch) là tượng bệnh lý lớp + Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormon vỏ tuyến nội mạc động mạch, đặc biệt là các động mạch lớn dẫn đến sự hình thành các thượng thận mảnh có ng̀n gớc chất béo, phá vỡ cấu trúc thành mạch, làm hẹp mạch máu + Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng và ngăn cản sự lưu thơng dịng máu Các biểu bệnh lý + Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone đoạn đầu là tổn thương các tế bào nội mạc và lớp tế bào dưới nội mạc Sự tổn + Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào thương thành mạch cịn có thể tác động học dòng máu và áp lực + Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì da Cùng với các động mạch nên vùng tổn thương chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng: giai Khi có tượng tổn thương, các tế bào nội mạc giãn, sưng, phân +) Kháng lại việc hấp thu các chất hoà tan nước chia Các tế bào trơn thành mạch có thể có phản ứng tương tự Tại +) Kháng tác động nhiều hoá chất thành mạch máu có tượng tập trung nhiều tế bào sự di chuyển các +) Ngăn cản quá trình bốc nước da [15],[19], [28] tế bào bình thường đến vùng tổn thương Ngay sau đó, các thành phần lipit Như vậy cholesterol có vai trị quan trọng thể hàm lượng máu, đặc biệt là cholesterol tích tụ lại các tế bào phân thể mức phù hợp Ở người trưởng thành, cholesterol toàn chia, hình thành các mảnh xơ Vì các mảnh này chứa lượng lớn phần mức bình thường vào khoảng 4-5,6 mmol/lít Những người có mức cholesterol nên chúng thường được gọi là chất cholesterol lắng đọng cholesterol cao mức này dẫn đến nhiều bệnh khác Tiếp theo sau quá trình bệnh lý , các tế bào xơ xâm nhập vùng tổn thương và hình thành các mảnh xơ mạch máu 1.2.4 Tác hại cholesterol thể vƣợt quá mức bình thƣờng Người ta thấy rằng, cholesterol là nguyên nhân gây nên các bệnh tim Tiếp theo là quá trình lắng đọng canxi làm canxi hoá các mảnh xơ Đến mạch, xơ động mạch, huyết áp cao, thiểu mạch vành, nhồi máu tim, giai đoạn này, các tổ chức mạch vùng tổn thương trở nên cứng nên được mô tai biến mạch máu não Trên thế giới nước ta, các bệnh về tim tả từ “xơ cứng động mạch” gọi đơn giản là “hiện tượng cứng mạch ngày càng tăng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu nhiều nước mạch máu” Đàn ơng có nguy bị bệnh tim cao đàn bà Ở Mỹ, hàng năm có khoảng Các động mạch bị xơ cứng gần hoàn toàn khả tăng kích triệu người bị bệnh tim và số này có khoảng 1,5 triệu bị đau tim và thước (mất khả căng phồng) và dễ bị làm rách , làm thủng Các phần tử sớ này có khoảng 1/3 bị chết Khoảng 1/5 số các trường hợp đau mảnh xơ (có bề mặt thơ nhám) có thể di chuyển theo dòng máu dẫn đến nguy tim khơng hề có triệu trứng hay cảnh báo trước Tần suất đàn ông Mỹ bị chết hình thành các cục máu và hút khới Khi các hút khới có mặt vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số Ở Anh, tỉ suất này là khoảng động mạch vành tim hay các động mạch não dẫn đến tắc động 250/100.000 dân số [16], [21] mạch, rối loạn hoạt động tim, não và gây tổn thương nặng nề cho thể *Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch cholesterol thậm chí gây tử vong Các ảnh hưởng tương tự có thể xảy huyết Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn khối hình thành động mạch gan, động mạch thận, động mạch các chi, vùng DNA được tăng thêm này chưa được xác định rõ ràng, động mạch dạ dày, ruột [16], [21] dường chúng là vùng khơng mã hố Kích thước mtDNA động vật nhỏ tổ chức lại chặt *Biện pháp điều chỉnh cholesterol máu Để giảm hàm lượng cholesterol máu có nhiều biện pháp khác chẽ mtDNA động vật khơng có vùng intron, có sớ gen gới lên sử dụng các loại th́c có chứa chất Simvastatine và chất Ezetimibe hay hầu hết cặp bazơ đều có thể nằm gen nào ngoại trừ vùng D- các loại th́c có chứa Statin Nhưng biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh loop D-loop là vùng điều khiển mtDNA có các promotor cholesterol máu là chế độ ăn uống hợp lý trình chép và phiên mã mtDNA [25] Do sở thích và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng các loại 1.3.2 Ý nghĩa mặt tiến hoá DNA ty thể thực phẩm, số người thường xuyên sử dụng số lượng lớn các thực DNA ty thể là vật chất di truyền nằm ngoài nhân di truyền theo dòng phẩm có chứa nhiều cholesterol óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất mẹ Ở hầu hết động vật có xương sớng gen này có chiều dài khoảng 16800 béo (thịt heo, gà, vịt, cá) và đặc biệt là trứng Có người ăn thường nucleotid, bao gồm gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNA xuyên lượng lớn trứng thời gian dài mà không biết tới hậu quả và vùng điều khiển – vùng không mã hoá với các promoter để tái mà gây Trứng là thức ăn bổ dưỡng cho thể Tuy nhiên, chúng bản và phiên mã mtDNA DNA ty thể có đặc tính đáng quan tâm ta nên ăn với lượng hợp lý sau: để góp phần đề phòng và giảm lượng cholesterol máu để tránh các bệnh về tim mạch (1) Tỷ lệ tiến hoá phân tử chúng nhanh khoảng lần so với gen nhân nào 1.3 Đặc điểm DNA ty thể (2) mtDNA là phân tử đơn bội mà không tái tổ hợp 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc trình tự DNA ty thể DNA ty thể (mtDNA) dạng chuỗi kép, trần, mạch vịng Kích thước gen ty thể thay đổi khác mức phân loại Bộ trở lên Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao gấp – 10 lần so với các gen Ở tế bào động vật kích thước mtDNA nhỏ, cho tới đã xác định khác mtDNA Trình tự nucleotide vùng điều khiển mtDNA là được trình tự đầy đủ gen ty thể người, chuột, bị, tất cả đều có kích cơng cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến thước khoảng 16,5 kb Mỗi tế bào có vào khoảng vài trăm ty thể Mỗi ty thể hoá bên và các quần thể cùng loài [29] có nhiều bản DNA Nấm men có kích thước gen ty thể khoảng 84 1.4 Đặc điểm cấu trúc di truyền hệ gen ty thể gà kb (ở S.cerevisiae), nhiều vùng không mang intron dài xen kẽ * Đặc điểm cấu trúc ty thể gà các vùng exon Ở thực vật thì có sự biến động lớn về kích thước Năm 1990, Desjadins Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ gen ty thể, mtDNA thực vật có kích thước tới thiểu khoảng 100 kb Chức mtDNA gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp, chúng mã hóa cho 13 protein, rRNA 22 tRNA (trình tự này đã được lưu trữ GenBank) Các Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 (8): Bổ sung 1/10 thể tích CH3COONa3M, pH 5,2 và 1ml cồn 100%, ủ qua đêm - 20oC - Tra mẫu và điện di: mẫu DNA với lượng thích hợp (3 - l) được trộn với 2,5 l đệm màu và được tra vào các giếng nhỏ gel Chạy điện di (9): Thu tủa cách li tâm 12000 vòng/phút 15-20 phút, 4oC Bổ sung 500 l cồn 70% để rửa vào epp với dịng điện chiều có cường độ dịng điện 60 – 80 mA, hiệu điện thế 100-120 V Quan sát sự di chuyển băng màu bromophenol blue để biết lúc (10): Li tâm 12000 vòng/phút 15 phút, 4oC Bỏ dịch và thu cặn (11): Làm khô tủa máy sấy và hòa tủa vào 50 l nước khử ion vô nào cần ngừng điện di Sau kết thúc điện di, lấy bản gel khỏi khuôn và ngâm bản gel dung dịch EtBr (ethidium bromide) với nồng độ 0,5 l/ml Sau trùng, búng nhẹ Kiểm tra sản phẩm tinh sạch DNA gel agarose 0,8% ngâm 10-15 phút, lấy bản gel ra, rửa nước sạch và chụp ảnh dưới ánh 2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA gel agarose sáng tử ngoại 254 nm (trên máy Bio-Rad) * Nguyên tắc chung 2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop kỹ thuật PCR Điện di là kỹ thuật để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước Vào năm 1985, K.Mullis đã phát minh phương pháp đơn giản khuếch và hàm lượng khác Kỹ thuật này dựa đặc tính bản axit đại nhanh nhiều bản (amplification) các đoạn DNA mà không qua tạo nucleic là các đại phân tử tích điện âm có sự có mặt gớc PO43- bề dịng Kỹ tḥt này được gọi là Polymerase Chain Reaction, viết tắt là PCR, mặt Do đó, đặt axit nucleic điện trường với cường độ dòng điện và được hiểu là phản ứng polymerase dây chuyền Kỹ thuật này được ứng dụng hiệu điện thế thích hợp, chúng di chuyển dần về phía cực dương Gel được nhanh và có ý nghĩa cách mạng đối với sự phát triển sinh học phân tử và sử dụng kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử DNA có kích kỹ tḥt di trùn [26] thước lớn) polyacryamid (với các phân tử DNA có kích thước nhỏ) * Ngun tắc chung Trong thí nghiệm này chúng tơi sử dụng gel agarose với nồng độ 0,8% gel PCR là quá trình khuếch đại đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro agarose với nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình các đoạn sự xúc tác enzyme DNA taq polymerase Enzyme này được chiết từ vi DNA cần phân tích (1- 20kb) [2] khuẩn Thermus aquaticus Sự khuếch đại này được thực nhờ các chu * Quy trình kỹ thuật trình nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gờm đun nóng (950C), làm nguội (37- - Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8 gam agarose vào 100 ml dung dịch TAE o 650C) và ủ lâu 720C Trong dung dịch có chứa loại deoxynucleotide 1X Đun lị vi sóng đến tan hoàn toàn Để nguội x́ng khoảng 50 – 60 C, (dNTPs) và các cặp mồi chuyên biệt Mồi được sử dụng là các đổ dung dịch agarose vào khay điện di có cài sẵn lược Sau 30 phút, gel oligonucleotide, mồi bắt cặp bổ sung với đầu mạch đơn DNA đông cứng thì rút lược và đặt vào bể điện di có chứa sẵn dung dịch TAE khn tương ứng, từ mạch được tổng hợp kéo dài 1X cho dung dịch TAE 1X ngập mặt gel từ – mm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn * Nguyên liệu 24 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 25 - DNA khuôn phải được tinh sạch và bị đứt gãy , có chứa trì nh tự đí ch cần nhân lên Nồng độ DNA khuôn mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100 ng/phản ứng dễ dẫn đến sự nhân lên các đoạn không cần thiết Qua thử nghiệm, chúng thấy, nồng độ các dNTPs là 1mM là phù hợp - Taq DNA polymeaza hãng Fermentas - Mồi: là yếu tố quan trọng phản ứng PCR việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mời và nờng độ mời có ảnh hưởng lớn đến lượng sản phẩm và chất lượng sản phẩm PCR Nồng độ mời xi và mời ngược sử dụng thí - Nước khử ion vô trùng Thông thường phản ứng PCR cho mẫu với tổng thể tích là 25 l, gồm các thành phần sau: nghiệm này là 10 pmol/l (pM/l) Cặp mồi được sử dụng đó là : Nước 14,8 l + Mồi xuôi H1255: 5’- CATCTTGGCATCTTCACTGCC - 3’ Buffer dream taq 2,5 l + Mồi ngược L16725: 5’- AGGACTACGGCTTGAAAGC - 3’ dNTPs 2,5 l H, L là chữ viết tắt cho chuỗi nặng (Heavy) và chuỗi nhẹ (Light), chữ H1255 (mồi xuôi ) l L16725 (mồi ngược) l Taq DNA polymeraza 0,2 l DNA khuôn l Tổng thể tích 25 l sớ là vị trí nucleotide mtDNA trình tự đầy đủ gà mà đầu 3’ mồi tiếp hợp vào (Desjadins Morais, 1990) [17] Cặp mồi H1255- L16725 được lựa chọn vì là cặp mời “bảo thủ”, có thể được dùng cho nhiều loài, giống khác gà - Dung dịch đệm: PCR được thực môi trường đệm phù hợp với hoạt động enzyme và có giá trị pH là 7,2 Trong thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng đệm là buffer dream taq Nó phù hợp với hoạt động emzyme taq polymerase và dung dịch đệm này có chứa Mg2+ Vai trò ion PCR là quá trình lặp lại gồm nhiều chu kỳ (tổng số chu kỳ chúng tiến hành là 35 chu kì), chu kỳ gờm giai đoạn: - Giai đoạn biến tính: DNA khn bị biến tính nhiệt độ 94-950C Mg2+ là tạo phức với các dNTPs và gắn chúng với enzyme, kích hoạt và tăng khoảng phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn Mỗi sợi đơn trở cường sự kết hợp mồi và khuôn Nồng độ Mg2+ quá thấp làm giảm thành sợi khuôn cho mồi bám vào Thời gian biến tính tùy thuộc vào hoạt tính enzyme Tuy nhiên, nếu nồng độ quá cao ức chế hoạt động enzyme Sau khảo sát chúng sử dụng nồng độ Mg 2+ 10 mM cho hàm lượng G-C và chiều dài phân tử DNA Chúng chọn nhiệt độ biến tính 940C phút Trước bước vào chu kì thứ nhất, nhiệt độ biến tính được đặt 940C phút để đảm bảo phân tử DNA được biến kết quả PCR tốt - loại dNTPs: nồng độ loại dNTPs phải và phụ thuộc nhiều vào kích thước đoạn DNA đích, nờng độ mời và MgCl2 Nồng độ các dNTPs lớn 4mM ức chế phản ứng PCR ion Mg2+ bị cô lập, tính hồn tồn - Giai đoạn gắn mời: giai đoạn này, nhiệt độ phản ứng được hạ xuống khoảng 37- 650C để cho mồi kết hợp vào sợi khuôn Nhiệt độ và thời gian bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự mồi Chúng tơi đã thử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 26 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 27 chạy phản ứng số giá trị nhiệt độ khác khoảng nhiệt độ này và chọn được nhiệt độ gắn mồi là 55 C tiến hành gel theo protocol của hãng Promega để thu sản phẩm PCR tinh sạch Quy trình được tiến hành sau: - Giai đoạn kéo dài mạch: nhiệt độ tăng lên 72 C để cho enzyme Taq - Đổ gel và chạy điện di sản phẩm PCR polymerase hoạt động tốt Bước này cần 1-5 phút tùy thuộc chiều dài - Cân ống eppendorf (epp) loại 1,5 ml đoạn DNA cần khuếch đại Tốc độ tổng hợp phản ứng khoảng 1000 - Cắt băng chứa sản phẩm PCR cho vào epp đã cân nuleotide/ phút Trình tự vùng D-loop quan tâm có kích thước khoảng 1,3 kb nên thời gian giai đoạn kéo dài chuỗi là phút 20 giây - Cân lại epp có chứa gel (mang sản phẩm PCR để biết được trọng lượng băng gel ta vừa cắt) Sản phẩm cuối cùng chu kỳ trước là khuôn mẫu cho chu kỳ tiếp theo Sau chu kỳ, số lượng DNA được tăng lên gấp đôi Sau thời - Bổ sung dung dịch mambrane binding (dung dịch 1) với tỷ lệ mg gel: l dung dịch gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân nhờ mà có đủ lượng - Ngâm nước nóng (nhiệt độ khoảng 50-650C) để gel tan hết DNA phục vụ cho thí nghiệm tiếp theo Sau kết thúc 35 chu kì, chúng tơi - Chủn sang cột và để nhiệt độ phòng khoảng phút đặt nhiệt độ ở 72 C mười phút để đảm bảo sự tổng hợp được kết thúc hoàn toàn Sản phẩm PCR được giữ C - Ly tâm 12000 vịng/phút, 40C, phút, sau loại bỏ dịch phí a dưới * Quy trình nhiệt phản ứng PCR có thể được tóm tắt sau: - Bổ sung 700 l manbrane wash (dung dịch 2) và ly tâm 12000 vòng/ o Bước 1: 94 C - phút phút, 40C, phút, sau loại bỏ dịch phía dưới o Bước 2: 94 C - phút - Bổ sung thêm 500 l dung dịch và ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, o Bước 3: 55 C - phút phút, sau loại bỏ dịch phía dưới Bước 4: 72oC - phút 20 giây - Ly tâm lại phút, 12000 vòng/ phút, 40C Từ bước đến bước lặp lại 34 lần - Cho vào máy sấy phút Bước 5: 72oC - 10 phút - Bổ sung thêm khoảng 30-50 l nước cất lần, để nhiệt độ phòng Sản phẩm PCR được giữ 4oC khoảng phút Sau phản ứng kết thúc, lấy l sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 0,8% để kiểm tra sản phẩm PCR - Ly tâm 12000 vòng/phút, 40C, phút Sau đã gel tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tiến hành điện di 2.3.2.4 Tinh sản phẩm PCR để kiểm tra sản phẩm gel gel agarose 0,8% Nếu điện di xuất Sau điện di kiểm tra phản ứng PCR đã thành công, chúng tiến băng sáng rõ, tập trung, không bị smear, có kích thước trùng với kích thước hành tinh sạch sản phẩm PCR Để tinh sạch sản phẩm PCR, chúng tiến đoạn DNA cần nhân phản ứng PCR thì sản phẩm gel đủ chất lượng hành điện di toàn sản phẩm PCR thu được mẫu Sau chúng tơi để tiến hành đọc trình tự Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 http://www.lrc-tnu.edu.vn 29 Giá trị trung bình mẫu 2.3.2.5 Phƣơng pháp xác định trình tự DNA *Nguyên tắc chung X Trình tự vùng D-loop được xác định dựa nguyên tắc chung phương pháp Sanger [2], [10] tạo các đoạn oligonucleotide kém n Xi n i 1 Độ lệch chuẩn: nucleotide, kết thúc các ddNTP được đánh dấu huỳnh quang Để tạo SX n ( Xi X )2 với n 30 n i 1 SX n ( Xi X )2 với n < 30 n i 1 các đoạn kết thúc các loại ddNTP khác nhau, chúng tiến hành phản ứng PCR sử dụng BigDye Terminaor v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết phản ứng nhân gen để đọc trình tự như: dNTPs, mX = ddNTPs, DNA polymerase Do cần bổ sung thêm DNA khuôn (sử dụng sản phẩm gel phản ứng PCR) và mồi phù hợp (cặp mồi H1255- m L16725) Phản ứng được thực ống vì loại ddNTP đã được đánh dấu các màu khác Thành phần phản ứng khuyếch đại gene để đọc trình tự bao gồm: mồi 3.2 pM, DNA sản phẩm PCR và nước X = SX n ( với n 30) SX n 1 ( với n < 30) Trong đó: S X : Độ lệch chuẩn với tổng thể tích 15l Vì đoạn gen cần xác định có chiều dài khoảng 1,3 kb X : Là giá trị trung bình mẫu nên chúng đã xác định trình tự nucleotide từ hai chiều tất cả các đoạn Xi: Là giá trị mẫu DNA có sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 nhờ máy xác n: Là sớ lần lặp lại thí nghiệm định trình tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau sử dụng các phần m X : Sai số trung bình mềm Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu hai chiều đọc, thu được trình tự hoàn chỉnh vùng D-loop giống gà Ri, Ác, Tre * Chu trình nhiệt Chu trình nhiệt cho máy PCR máy luân nhiệt Genamp PCR System 9700 sau: 940C- phút; (960C- 10 giây, 500C- giây, 600C- phút) x 25 chu kỳ Sau sản phẩm được giữ 0C 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu Những số liệu thu được, được xử lý theo phương pháp thớng kê sinh học máy vi tính chương trình Excel theo hướng dẫn Chu Văn Mẫn [9] với các thơng sớ: Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 31 nghiên cứu càng cao Chúng đã xác định được hàm lượng cholesterol Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN các mẫu thí nghiệm và được thể qua bảng 3.2 hình 3.1 3.1 Hàm lƣợng cholesterol trứng các mẫu nghiên cứu Chúng thu thập mẫu trứng các giống gà nghiên cứu đồng thời Bảng 3.2 Hàm lượng cholesterol trứng mẫu nghiên cứu thu thập thêm trứng vịt Bầu và trứng gà Tam Hoàng mà Các mẫu nghiên cứu chúng ta hay sử dụng hàng ngày Mục đích là để có thể so sánh hàm lượng Hàm lượng cholesterol (mg/100 g) X mX cholesterol các mẫu gà nghiên cứu với hàm lượng cholesterol các loại trứng mà chúng ta hay sử dụng các bữa ăn hàng ngày để có thể rút kết luận về việc sử dụng loại trứng mà khơng lo hàm lượng cholesterol cao Sau đó, chúng tơi tiến hành phân tích theo các bước trình bày chương và cuối cùng dung dịch chứa cholesterol được định lượng sắc ký lỏng (HPLC) cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) peak cholesterol mẫu Trứng gà Ri 438,1 0,09 Trứng gà Ác 340,6 0,11 Trứng gà Tre 465,9 0,15 Trứng gà Tam Hoàng 318,8 0,1 Trứng vịt Bầu 477,7 0,13 và diện tích các peak cholesterol trứng của các mẫu gà nghiên cứu được thể qua bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trứng của các mẫu nghiên cứu Mẫu nghiên cứu Thời gian chạy máy gà Ri Diện tí ch Chiều cao 31,508 1017035 25295 gà Ác 32,233 845304 20628 gà Tam Hoàng 31,836 819183 20477 gà Tre 32,418 1105818 26763 vịt Bầu 31,632 1195163 29586 (phút) Trung ga Ri Trung ga Ac Trung Ga Tre Trung ga Tam Hoang Trung vit Bau Hình 3.1 Biểu đồ hàm lượng cholesterol trứng mẫu nghiên lượng cholesterol đã trình bày chương thì hàm lượng cholesterol tỷ lệ thuận với diện tích (hoặc chiều cao) peak mẫu nghiên cứu Nếu diện tích (chiều cao) peak mẫu nghiên cứu càng lớn thì hàm lượng cholesterol mẫu http://www.lrc-tnu.edu.vn 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 Mẫu nghiên cƣ́u Chúng tơi đã lặp lại thí nghiệm lần Dựa vào cơng thức xác định hàm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hàm lƣợng cholesterol (mg/100g) với diện tích (hoặc chiều cao) peak cholesterol chuẩn Kết quả c hiều c ao 32 cứu Qua bảng 3.2 hình 3.1, chúng tơi nhận thấy hàm lượng cholesterol trứng vịt Bầu là lớn 477,7 mg/100 g, sau là trứng gà Tre 465,9 mg/100 g, trứng gà Ri 438 mg/100 g, trứng gà Ác 340 mg/100 g Hàm lượng cholesterol thấp là trứng gà Tam Hoàng 318,8 mg/100 g Tuy nhiên, hàm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 33 lượng cholesterol quả trứng thì chủ yếu tập trung lòng đỏ, sử dụng thí nghiệm là mẫu máu, nên chúng tơi đã lựa chọn phương pháp lịng trằng khơng đáng kể Nhu cầu cholesterol tối đa người bình tách chiết DNA tổng số Sambrook và Russell [30] Kiểm tra sản phẩm thường/một ngày là 300 mg/một ngày Như vậy, chúng ta thấy hàm tinh sạch gel agarose 0,8% Kết quả được thể hình 3.2 lượng cholesterol trứng gà là khá cao Chính vì vậy, người sử dụng cần phải c ăn cứ vào tì nh hì nh sức khỏe của bản thân bệnh về tim mạ ch liên quan đến cholesterol M (có hay khơng có ) và dựa vào hàm lượng 21kb cholesterol của các loại trứng mà chúng đã xác định để ch ọn loại trứng và 5,1kb số lượng trứ ng phù hợp để đảm bảo ngày cung cấp cho thể tối đa 300 mg cholesterol/một ngày Đồng thời người mà có hàm lượng cholesterol máu cao 5,6 mmol/lít thì t̀n nên ăn tới đa quả trứng/một tuần và nên lựa chọn trứng gà Tam Hoàng để ăn, hạn chế ăn các loại trứng vịt Bầu, trứng gà Tre và gà Ri để đảm bảo sức khỏe , ngăn ngừa và hạn chế các bệnh về tim mạch Hình 3.2 Kết điện di DNA tổng số M: marker; Gà Ri; Gà Ác; Gà Tre 3.2 Xác định trình tự nucleotide vùng D-loop đánh giá đa dạng di Kết quả cho thấy, cả băng DNA tổng số mẫu gà Ri, Ác, Tre đều sáng tập trung và tương đối rõ nét Ba băng DNA thu được có kích thước truyền mẫu gà nghiên cứu Để xác định trình tự nucleotide vùng D-loop và đánh giá đa dạng di khoảng 21kb Như vậy, có thể đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu truyền mẫu gà nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, chúng tiến hành tách về nồng độ và độ tinh sạch để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo chiết DNA tổng sớ, dùng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển ty thể 3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop DNA ty thể nhằm xác định trình tự vùng D-loop So sánh các trình tự này với mộ t số Bằng kỹ thuật PCR, chúng đã khuyếch đại được vùng điều khiển D- trình tự công bố GenBank để tìm sự đa dạng di truyền của chúng loop Sản phẩm PCR được kiểm tra gel agarose 0,8% với thể tích là l 3.2.1 Tách chiết tinh DNA tổng số từ máu gà Kết quả PCR được thể hình 3.3 Hầu hết các nghiên cứu về sinh học phân tử đều bắt đầu từ việc thu nhận và tinh sạch DNA đủ lớn và trạng thái tương đối nguyên vẹn cho các thí nghiệm tiếp theo Một các mới quan tâm hàng đầu các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy chúng Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch thì việc lựa chọn phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đới tượng nghiên cứu là quan trọng Vì mẫu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 35 M trình tự D-loop gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật mã số AB114078 [24] và gà Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC007236 [27], thu được kết quả hình 3.4 10 1.5kb 1.0 kb 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | 1.3kb AB114078 aattttattt tttaacctaa ctcccctact aagtgtaccc cccctttccc ccccaggggg AC - RI C TRE C NC007236 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR 70 M:Marker; Gà Ri; Gà Ác; 3.Gà Tre 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | Kết quả cho thấy, cả mẫu đều xuất băng DNA có kí ch thước khoảng 1,3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung, chứng tỏ sản phẩm PCR đặc hiệu, chúng đã nhân được vùng D-loop Sản AB114078 ggtatactat gcataatcgt gcatacattt atataccaca tatattatgg taccggtaat AC RI TRE NC007236 phẩm PCR được sử dụng các thí nghiệm tiếp theo 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | 3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể AB114078 atatactata tatgtactaa acccattata tgtatacggg cattaaccta tattccacat Sau tinh sạch sản phẩm PCR (thôi gel sản phẩm PCR), chúng AC t tiến hành xác định trình tự đoạn D-loop máy đọc trình tự tự động RI TRE t NC007236 t sở phương pháp Sanger Nguyên tắc và cách thức đọc đã được mô tả 190 mục 2.3.2.5 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | Xác định trình tự nucleotide từ hai chiều tất cả các đoạn DNA có AB114078 ttctcccaat gtccattcta tgcatgatcc aggacatact catttaccct ccccatagac AC .a c RI tự ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer, sau sử dụng các phần mềm TRE .a T c Seqscape và Bio Edit để kết hợp số liệu hai chiều đọc, chúng thu được NC007236 c sản phẩm PCR nhờ cặp mồi H1255- L16725 nhờ máy xác định trình 250 trình tự hoàn chỉnh vùng D-loop giống gà Ri, Ác, Tre Sau đã xác định được trình tự vùng D-loop mẫu gà nghiên cứu là gà Ri, Ác ,Tre, chúng tiến hành so sánh trình tự vùng D -loop chúng với và với hai trì nh tự D-loop đã được cơng bớ GenBank là Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | 36 AB114078 agttccaaac cactatcaag ccacctaact atgaatggtt acaggacata aatctcactc AC .t RI TRE .t NC007236 c c t g t Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 37 310 320 330 340 350 360 610 | | | | | | | | | | | | 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | AB114078 tcatgttctc cccccaacaa gtcacctaac tatgaatggt tacaggacat acatctaact AB114078 cttcccctct ttagtccgtg atcgcggcat cttctctctt ctattgctgt tggttccttc AC t T AC RI T RI TRE t T TRE NC007236 .c t T NC007236 370 380 390 400 410 420 670 | | | | | | | | | | | | 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | AB114078 accatgttct aacccatttg gttatgctcg ccgtatcaga tggatttatt gatcgtccac AB114078 tctttttggg gcttcttcac aggttgccct tcacagtgcg ggtgcggagt gctattcaag AC AC RI RI TRE TRE NC007236 NC007236 .a 730 430 440 450 460 470 480 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AB114078 tgaagcctgg actacacctg cgttgcgtcc tatcctagtc ctctcgtgtc cctcgatgag AB114078 ctcacgagag atcagcaacc cctgcctgta atgtacttca tgaccagtct caggcccatt AC AC RI RI TRE TRE NC007236 NC007236 490 500 510 520 530 790 540 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AB114078 acggtttgcg tgtatgggga atcatcttga cactgatgca ctttggatcg catttggtta AB114078 ctttccccct acacccctcg cccaacttgc cttccaccgt acctctggtt cctcggtcag AC .a AC .t RI RI .t TRE TRE .t NC007236 NC007236 .t 550 560 570 580 590 850 600 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AB114078 tggttcttcc accccccc-g gtaaatggtg ctatttagtg aatgcttgtc ggacatattt AB114078 gcacatccca tgcataactc ctgaactttc tcacttttca cgaagtcatc tgtggattat AC - AC RI - RI TRE c TRE NC007236 c NC007236 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 39 910 920 930 940 950 960 1210 | | | | | | | | | | | | 1220 | | | | AB114078 ttatcaattt tcacttcctc tattttcttc acaaaactag gaaattcacc acaatttttt AB114078 gcaaacacaa aacccgcctt cta AC AC A RI RI TRE TRE A NC007236 NC007236 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | AB114078 c-tttgttat tttttaattt tttttttatt tattaaaaac attttttaaa aaactaaatt AC - T RI - T Hình 3.4 So sánh trình tự đoạn D-loop mẫu gà Ri, Ác, Tre với gà Gallus gallus gallus mã số NC007236 gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 TRE - T * So sánh trình tự gà Ri, gà Ác, gà Tre nuôi tại Bắc Giang với trình NC007236 t T tự tham khảo mã sớ NC007236, chúng tơi nhận thấy có 21 điểm đa hình/đột 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | biến (tức là khác biệt nucleotide) Mẫu gà Ác có 17 điểm (chiếm 1,39%), mẫu AB114078 acatacaaac taccgcataa aatccctcaa actatacaaa cgtttatcgt ataatatata gà Ri có 13 điểm (chiếm 1,06 %) và mẫu gà Tre có 15 điểm khác biệt so với AC .g RI NC007236 (chiếm 1,23 %) Trong 21 điểm khác biệt này, phần lớn là đột biến TRE thay thế Ngoài cịn có đột biến nucleotid e tại vị trí là : tại vị trí sớ NC007236 1090 1100 1110 1120 1130 1140 | | | | | | | | | | | | AB114078 tacattattg tttattctat cattattaga gaaactccac taccaaaacc atcattaaaa AC RI TRE NC007236 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | bị nucleotide A ở gà Ác , tại vị trí 859 mất nucleotid e C ở gà Ác và gà Ri, tại vị trí 962 mất nucleotid e T ở gà Ri, Ác, Tre Những đột biến thay thế làm cho trình tự nucleotide các mẫu gà nghiên cứu khác với NC007236 sau: thay thế A C (AC) tại vị trí nucleotide số mẫu gà Ri và gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 167 gà Ri, vị trí 261, 296, 310 gà Ri, Ác, Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí 212, 1216 gà Ác AB114078 caaaaattta catgccactt aactcccctc acaaacaatc gttatttata ttgttaatta gà Tre, tại vị trí 281 gà Ri , Ác, Tre, tại vị trí 792 mẫu gà Ác 1193 AC RI mẫu gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí 219 gà Tre , tại vị trí TRE A NC007236 225 gà Ri, tại vị trí 246, tại vị trí 315 gà Ác và Tre, tại vị trí 243, tại vị trí 306 gà Ri, Ác, Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 686 gà Ác, Ri, Tre, tại vị trí 1032 gà Ác * So sánh trình tự gà Ri, gà Ác, gà Tre với trình tự tham khảo mã số AB114078 chúng tơi nhận thấy có 15 điểm đa hình/đột biến Mẫu gà Ác có 11 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 41 điểm (chiếm 0,9%), mẫu gà Ri có điểm (chiếm 0,33%) và mẫu gà Tre có 13 Bảng 3.3 Các điểm nucleotide khác biệt mẫu gà Ác Tre so với gà điểm khác biệt so với trình tự tham khảo (chiếm 0,98%) Trong 15 điểm khác Ri biệt này, phần lớn là đột biến thay thế Riêng mẫu gà Ác, tại vị trí Vị trí nucleotide ty thể gà Ri nucleotide sớ bị nucleotide A so với trình tự tham khảo, đồng thời 167 C T mẫu gà Tre tại vị trí nucleotide sớ 859 có thêm nucleotide C trình 212 G A tự tham khảo, mẫu gà Ri và mẫu gà Ác khơng có nucleotide này Còn lại là 225 T C 246 C T 315 C T 1216 G A các đột biến thay thế làm cho trình tự nucleotide các mẫu gà nghiên cứu khác với trình tự tham khảo sau: thay thế A C (AC) tại vị trí nucleotide số mẫu gà Ri và gà Tre; thay thế C thành T (CT) tại vị trí 167, 246, 315 mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 355 cả mẫu gà Ri, Ác và Tre, tại vị trí 219 mẫu gà Tre; thay thế G thành A (GA) tại vị trí 212, 1216 mẫu gà Ác và gà Tre, tại vị trí 792 mẫu gà Ác 1193 Sự sai khác nucleotid e giữa mẫu gà Ri , Ác, Tre với trình tự tham khảo là NC007236 và AB114078 được thống kê ở bảng 3.4 Bảng 3.4 Thống kê điểm đa hình mẫu gà nghiên cứu so với gà Gallus gallus gallus mã số NC007236 gà Gallus gallus gốc Nhật mã số mẫu gà Tre; thay thế T thành C (TC) tại vị trí 225 mẫu gà Ác AB114078 Tre; thay thế A thành T (AT) tại vị trí 504, 992 cả mẫu gà Ri, Ác So với gà Gallus gallus gallus mã số NC007236 Vị Tre; thay thế A thành G (AG) tại vị trí 1032 mẫu gà Ác Ngoài mẫu gà Ri, Ác, Tre khác biệt 11 điểm đa hình (chiếm 0,9%) Cụ thể : giữa gà Ác và gà Tre khác điểm, giữa gà Ác và gà Ri khác điểm và giữa gà Tre và gà Ri khác STT điểm đa Mẫu Thay đổi gà nucleotide hình Như vậy , trình tự nucleotide mẫu gà Ác và Tre tương đối giớng lại có nhiều điểm khác biệt so với mẫu gà Ri trí ty Ác del A 1 3.3 Kiểu biến Mẫu Thay đổi dị gà nucleotide Mất Ác del A 42 ty thể Kiểu biến dị Mất nucleotide Tre, Ri AC Dị hoán Tre, Ri TC 167 Đồng Ác, hốn Tre Ác, GA 212 Đờng Ác, hốn Tre AC Dị hoán CT 167 Đồng GA 212 Đồng Ri http://www.lrc-tnu.edu.vn Vị trí nucleotide Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên So với gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078 thể Sự khác biệt nucleotide giữa mẫu gà Ác và gà Tre so với gà Ri được thể hiện bảng gà Ác Tre Tre Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên hoán hoán http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 Tre CT 219 CT 225 Ác, 243 CT 246 Tre Ác, CT Tre, Ri Ác, Tre CT 219 hốn Ri Đờng CT 256 Tre, Ri Đờng Đờng hốn Ác, hốn Tre Đờng Ác, hốn Tre Đờng Ác, hốn Tre Đờng Ác, hốn Tre, TC 225 246 CT 315 355 Ri Ác, 10 TC 261 Dị hoán Tre, Ri Ác, AT 504 Dị hoán Tre, 11 Đồng Tre TC 296 Đồng 859 GA 792 hốn CT 306 Tre, Ri Thêm Đờng hốn Đờng Ác, hốn Tre, TC 992 Ác, TC 310 Đờng CT 315 Đờng Tre, Ri Ác,Tre hốn hốn Ác, 16 AG 686 Tre, Ri Ác 17 Ác TC 1032 Đồng Tre GA 1193 Đờng hốn 15 GA 792 103 Đờng hốn 119 Đờng hốn nucleotide 20 Tre GA 21 Để đánh giá sự đa dạng di truyền của vùng D -loop nhằm xác đị nh mối quan hệ di truyền giữa các mẫu gà nghi ên cứu , chúng đã sử dụng phần cứu với trình tự các chủng gà đã được cơng bớ là: gà Gallus gallus gallus sánh mức sai khác về trình tự nucleotide và đánh giá mối quan hệ di truyền chúng, kết quả được thể hiện qua bảng 3.5 và hình 3.5 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng về trì nh tự nucleotide vùng D-loop ở mẫu nghiên cứu với một số mẫu GenBank Đồng Ri 14 AG Mất (gà rừng đỏ) gốc Nhật lấy trình tự GenBank mang mã số AB114078 [24] để so Thêm C nucleotide Ác 962 (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC 007236 [27] và Gallus gallus hoán Tre, Ri Ác, 13 281 Tre, Ri Ác, 12 GA del T mềm Mega để so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop mẫu gà nghiên Ri Ác, Ác, Ác Đờng hốn 859 Tre, Ri Đờng hốn CT 19 Đờng hốn del C nucleotide Đờng hốn CT Mất Ác, Ri 18 hốn hốn 1 99,67 99,1 99,26 99,02 99,26 99,51 98,77 98,94 98,61 98,77 AB114078 0,33 Ri 0,9 0,74 Ác 0,98 0,74 0,49 Tre 1,23 1,06 1,39 1,23 NC007236 Qua bảng 3.5 thấy rằng, các mẫu nghiên cứu có độ tương đờng cao so Đờng với các mẫu Ngân hàng gen NCBI hốn tương đồng cao nhất với mẫu có mã số AB Đờng gà Ác và mẫu gà Tre có độ tương đờng hốn tương đờng thấp nhất là mẫu gà Ác so với NC007236 (98,61 %) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 (98,61 - 99,67 %), mẫu gà Ri có độ 114078 (99,67%), sau đó là mẫu với là 99,51%, cặp có hệ sớ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 Từ các kết quả so sánh trì nh tự nucleotid e vùng D -loop của các mẫu gà trên, chúng thể hiện kết quả biểu đồ hì nh (hình 3.5) KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Hàm lượng cholesterol trứng vịt Bầu là lớn 477,7 mg/100g, sau là trứng gà Tre 465,9 mg/100g, trứng gà Ri 438 mg/100g, trứng gà Ác 340 mg/100g Hàm lượng cholesterol thấp là trứng gà Tam Hoàng 318,8 mg/100g 1.2 Tách chiết và tinh sạch được DNA tổng số từ máu gà thuộc mẫu nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre Nhân bản thành công vùng D-loop mẫu gà với kích thước khoảng 1,3 kb kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi chuyên biệt là Hình 3.5 Quan hệ di truyền mợt số giống gà Kết quả thu được hình 3.5 cho thấy các giống gà được chia thành H1255-L16725 nhánh lớn: nhánh I gồm AB 114078, gà Ri, gà Ác, và gà Tre ; nhánh II chỉ có 1.3 Xác định được trình tự vùng điều khiển D-loop gồm 1223 nucleotide gà NC 007236 Trong nhánh I lại chia thành mẫu gà nghiên cứu Ri, Ác, Tre và phát được 15 điểm đa hình về nhánh: nhánh I gờm gà AB114078 và gà Ri có mức độ đồng về mặt di truyền cao là 99,67% nucleotide mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham khảo mang mã số Nhánh I2 gồm giống gà Ác và gà Tre, mức độ đồng về mặt di truyền AB114078 và 21 điểm đa hì nh mẫu gà nghiên cứu với trình tự tham chúng là 99,51 % Nhìn chung, sự sai khác các giống gà này không khảo mang mã số NC007236 nhiều 1.4 Đánh giá mối quan hệ di truyền mẫu gà nghiên cứu với sớ chủng gà đã được cơng bớ là gà Gallus gallus (gà rừng đỏ ) gốc Nhật Bản (mã số AB114078) lấy trình tự GenBank quốc tế, Gallus gallus gallus (Cochin-Chinese Red Jungle Fowl) mã số NC007236 lấy trình tự GenBank thấy gà Gallus gallus (gà rừng đỏ) gốc Nhật Bản mã số AB114078 và gà Ri có mức độ đờng về mặt di trùn cao là 99,67% Hai mẫu gà Ác và gà Tre có mức độ đờng về mặt di trùn là 99,51% Nhìn chung, sự sai khác các giống gà này không nhiều Đề nghị 2.1 Chúng mới xác định hàm lượng cholesterol trứng mẫu nghiên cứu là gà Ri, Ác, Tre, vịt Bầu, Tam Hoàng cùng điều kiện nuôi dưỡng Vậy để đánh giá cách toàn diện về hàm lượng cholesterol Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 các mẫu nghiên cứu trên, chúng đề nghị xác định hàm lượng cholesterol TÀI LIỆU THAM KHẢO các mẫu nghiên cứu các điều kiện nuôi dưỡng khác Nguyễn Ân (1983), Di truyền học động vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 2.2 Trong phạm vi nghiên cứu đề tài, chúng mới lấy mẫu máu từ Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục cá thể thuộc giớng, chúng tơi đưa được sớ liệu ban đầu Nguyễn Hải Hà (2000), Tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể về các điểm đa hình vùng D-loop ty thể mẫu nghiên cứu là gà hai loài gà Lơi đặc hữu Việt Nam, Khóa ḷn tớt nghiệp nghành công Ri, Ác, Tre thuộc loài Gallus gallus domesticus Để có thể đánh giá được toàn diện về các điểm đa hình vùng D-loop có thể đưa các kết nghệ sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội Nguyễn Duy Hoan (1999), Chăn nuôi gia cầm (giáo trình dùng cho cao luận đầy đủ về mối quan hệ di truyền các mẫu nghiên cứu, cần phải tiến hành nghiên cứu và phân tích số lượng mẫu lớn học và nghiên cứu sinh), NXB Nông nghiệp Hà Nội Địch Thị Kim Hương (2006), Phân định số chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) qua DNA ty thể, Khóa ḷn tớt nghiệp, Trường ĐHKHTN Hà Nội CÔNG TRÌ NH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ Vũ Thị Như Trang , Nguyễn Trọng lạng : Xác định trình tự vùng điều khiển Lê Đức Long (2007), Nghiên cứu khả sinh trưởng, thành phần hóa D-loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác đƣợc nuôi Bắc Giang Tạp sinh thịt và đánh giá sai khác di truyền gà Mơng ni Thái chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên , 2009 tập 58, số 10, trang Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái 86-89 Nguyên Lê Viết Ly (2001), gà Ri-chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi Việt Nam, tập II phần gia cầm, NXB Nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Thị Mai (2007), Giáo trình chăn ni gia cầm dùng trường THCN, NXB Hà Nội Chu Văn Mẫn (2003), Ứng dụng tin học sinh học, NXB ĐHQG Hà Nội 10 Chu Hoàng Mậu (2005), Cơ sở và phương pháp sinh học phân tử, NXB ĐHSP 11 Kim Thị Phương Oanh (1999), Ứng dụng phương pháp sinh học phân tử nghiên cứu khác biệt di truyền số loài gà Lôi Việt Nam, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường ĐHSP Hà Nội Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 12 Trần Thị Mai Phương (2004), Nghiên cứu khả sinh sản, sinh trưởng phẩm chất thịt giống gà Ác Việt Nam, luận án tiến sĩ chuyên nghành chăn nuôi, Viện Chăn nuôi, Hà Nội 22 John Wiley and Sons, Inc (2005), Ref Current proticol in food analytical chemistry, D1.3 23 Kimball R.T., Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M (1999), Ligon 13 Tôn Thất Sơn, Đặng Vũ Bình, Nguyễn Quang Mai (2001), Chăn nuôi- tập I, NXB Giáo dục J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggest that these lineages are not monophyletic, Mol Phylogenet Evol., 11(1) tr.38- 14 Bùi Thị Kiều Vân (2008), So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự 54 vùng điều khiển D-loop giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi 24 Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T (2004), “The evolutionary origin of Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thái long- crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks Nguyên disclosed by the mtDNA sequence analysis”, Gene 333, pp 91-99, TÀI LIỆU TIẾNG ANH GenBank, Accession AB114078 15 Anderson RG., Joe Goldstein and Mike Brown (2003), “from cholesterol homeostasis to new paradigms in membrane biology”, Trends cell Biol, 13: 534-539, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE): 14507481 25 Lewin B (1997), Gene VI, Oxford University Press, 713-723& 1222 26 McPherson M.J., Quirke P., Taylor G.R (1991), PCR – A Pratical Approach, IRL Press at Oxford University Press 16 Ascherio A, Willett WC (1995), “New directions in dietary studies or coronary heart disease”, Journal of Nutrition 17 Desjardins P., Morais R., (1990), “Sequence and gene ogranization of the chicken mitochondrial genome”, J Mol Biol, 212: 599-635 27 Nishibori M., Shimogiri T., HayashiT and Yasue H (2005), “Molecular evidence for hybridization of species in the genus Gallus except for Gallus varius”, Anim Genet 36 (5), 367-375, GenBank, Accession NC007236, D-loop region: 1232 28 Ockene IS, Chiriboga DE, Stanek EJ 3rd, Harmatz MG, Nicolosi R, Saperia G, Well AD, Freedson P, Merriam PA, Reed G, Ma Y, Matthews 18 E Moyer (1998), Cholesterol, London: Thorston CE, Hebert JR., (2004), “Seasonal variation in serum cholesterol levels: 19 E.M.Roth (1995), Good cholesterol, bad cholesterol, New York: Prima treatment implications and possible mechanisms”, Arch Intern Med Arch Publications 20 Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S (1996), Monophylectic origin DNA unique dispersal patterns of domestic fowls, Pro Natl Acad Sci.USA, 93 (13), pp.6792- Intern Med, 164: 863-870, PMID (PubMed - indexed for MEDLINE): 15111372 29 Randi E., Lucchini V., Hennache A (1997), Searching for mtDNA genetic diversity in captive Edwards’ pheasants, The Internation 6795 21 Hu FB, Manson JE, Willett WC (2001), “Types of dietary fat anh risk of Studybook For The Edwards’ Pheasant (Lophura edwardsi) And Its Conservation, Paris: 117-120 coronary heart: acritical review”, Journal of the American College of Nutrition Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 PHỤ LỤC 30 Sambrook J., Russell D W (2001), Molecular Cloning: A labroratory manual, Cold Spring Harbor labroratory press, New York 31 Zhang Y., Wang J., He z., Ruan J., Dai M., Chen J., Hu C., Li S., Cong L., Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D.W., Ka G., Wong S., Yu J., Yang H., Wang J (2005), “Chick VD: A sequence variation database for the chicken genome”, Nucleic Acids Res., 33 (5), pp 438-441 Ảnh 1: Gà Ri Ảnh 2: Gà Ác Ảnh 3: Gà Tre Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Ảnh 4: Trứng gà Ác Trứng gà Tre Trứng gà Ri Trứng gà Tam Hoàng Trứng vị t Bầu http://www.lrc-tnu.edu.vn 53
Ngày đăng: 15/10/2016, 21:46
Xem thêm: XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁ NH TRÌNH TƢ̣ VÙ NG ĐIỀU KHIỂN DLOOP DNA TY THỂ CỦ A GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE, XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁ NH TRÌNH TƢ̣ VÙ NG ĐIỀU KHIỂN DLOOP DNA TY THỂ CỦ A GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE
