SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN DLOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN

I HC THI NGUYấN TRNG I HC S PHM BI TH KIU VN I HC THI NGUYấN TRNG I HC S PHM BI TH KIU VN SO SNH C IM HểA SINH TRNG V TRèNH T VNG IU KHIN D-LOOP CA BA GING G RI, G MễNG V G SAO NUễI TI THI NGUYấN SO SNH C IM HểA SINH TRNG V TRèNH T VNG IU KHIN D-LOOP CA BA GING G RI, G MễNG V G SAO NUễI TI THI NGUYấN Chuyờn ngnh: DI TRUYN HC Mó s: 60.42.70 LUN VN THC S KHOA HC SINH HC LUN VN THC S KHOA HC SINH HC Ngi hng dn: PGS.TS Nguyn Trng Lng THI NGUYấN - 2008 THI NGUYấN - 2008 MC LC LI CM N Trc tiờn, tụi xin trõn trng by t lũng bit n sõu sc nht ti ti M U PGS.TS Nguyn Trng Lng, ging viờn khoa sinh - KTNN trng i hc Tớnh cp thit ca ti S phm Thỏi Nguyờn, PGS.TS Nụng Vn Hi, Phú Vin trng, Vin Cụng Mc tiờu ca ti ngh Sinh hc, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam, nhng ngi thy ó Ni dung nghiờn cu tn tỡnh dỡu dt v hng dn tụi sut quỏ trỡnh hon thnh lun Chng I TNG QUAN TI LIU Trong thi gian hoc v nghiờn cu va qua, tụi ún nhn c s 1.1 NGUN GC GIA CM giỳp ht lũng, ch bo tn tỡnh v sõu sc ca CN ch Th Kim Hng, 1.2 MT S C IM SINH HC CA CC GING G NGHIấN CU ThS.NCS Nguyn ng Tụn cựng th cỏc cụ, chỳ, anh, ch cỏn b 1.2.1 G Ri nghiờn cu Phũng Cụng ngh ADN ng dng, Vin Cụng ngh sinh hc, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam nhng ngi ó to nhiu iu kin thun li v nhit tỡnh hng dn tụi quỏ trỡnh nghiờn cu Tụi rt cm n s giỳp quý bỏu ú Tụi xin chõn thnh cm n Ban ch nhim khoa v cỏc thy, cụ giỏo, k thut viờn khoa Sinh - KTNN trng i hc S phm Thỏi Nguyờn ó ng h v giỳp tụi quỏ trỡnh hc v nghiờn cu Cho phộp tụi c t lũng bit n ti Ths Ngụn Th Hoỏn, ging viờn chớnh khoa Chn nuụi - Thỳ y trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn ó to iu kin giỳp tụi vic nghiờn cu thc hin ti Cui cựng, tụi xin by t tỡnh cm ca mỡnh bng li cm n chõn thnh 1.2.2 G Mụng 1.2.3 G Sao 1.3 C S KHOA HC CA TI 1.3.1 C s ca vic nghiờn cu cỏc tớnh trng trng .6 1.3.2 Phõn tớch trỡnh t vựng iu khin (D-loop) ty th 1.3.2.1 Ty th - c im cu to DNA ty th .8 1.3.2.2 c im cu to h gen ty th g .9 1.3.2.3 í ngha ca DNA ty th nghiờn cu phõn loi g 12 1.3.2.4 Tỡnh hỡnh nghiờn cu DNA ty th g trờn th gii 12 13.2.5 Tỡnh hỡnh nghiờn cu DNA ty th g Vit Nam 15 n gia ỡnh, ngi thõn v bn bố, nhng ngi luụn dnh cho tụi nhng Chng VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 17 tỡnh cm nng m, thõn thng nht sut thi gian hc v nghiờn 2.1 VT LIU 17 cu 2.2 HểA CHT V THIT B 17 Thỏi Nguyờn, thỏng nm 2008 2.2.1 Húa cht 17 BI TH KIU VN 2.1.2 Thit b 18 2.3 PHNG PHP NGHIấN CU 19 2.3.1 Cỏc phng phỏp húa sinh 19 2.3.1.1 Phng phỏp xỏc nh t l lũng trng, lũng , v 19 2.3.1.2 Phng phỏp xỏc nh hm lng vt cht khụ 19 2.3.1.3 nh lng lipid tng s 19 2.3.1.4 nh lng Protein 20 2.3.1.5 Phng phỏp x lý s liu 21 2.3.2 Cỏc phng phỏp sinh hc phõn t 22 2.3.2.1 Tỏch chit v tinh sch DNA tng s t mỏu ng vt 22 2.3.2.2 K thut in di DNA trờn gel agarose 23 2.3.2.3 Nhõn vựng iu khin D-loop bng k thut PCR 24 2.3.2.4 K thut tỏch dũng gen 26 BNG Kí HIU V CH VIT TT Amp Ampicilline bp Base pair (cp baz) ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate DNA Deoxyribo Nucleic Axit D-loop Displacement loop E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Epp Eppenorf EtBr Ethidium Bromide EtOH Ethanol (cn) IPTG Isopropyl thio--D- galactoside 3.1.4 Hm lng protein tng s 32 kb Kilo base 3.2 NH GI A DNG DI TRUYN CA BA MU GING G 34 LB Luria - Bertani 3.2.1 Tỏch chit v tinh sch DNA tng s t mỏu g 34 mtDNA DNA ty th (mitochondrial DNA) 3.2.2 Nhõn on trỡnh t ca vựng D-loop ca DNA ty th 36 NADH Nicotinamide adenine dinucleotide 3.2.3 Tỏch dũng v xỏc nh trỡnh t vựng D- loop ca DNA ty th 39 PBS Phosphate - buffer saline 3.2.3.1 Tỏch dũng vựng D-loop 39 PCR Polymerase Chain Reaction 3.3.2.2 Xỏc nh trỡnh t vựng D-loop ca DNA ty th 44 RNA Ribonucleaxit KT LUN V NGH 51 RNase Ribonuclease Kt lun 51 SDS Sodium Dodecyl Sulphate ngh 52 TAE Tris-Acetate-EDTA CễNG TRèNH CễNG B 52 TE Tris EDTA TI LIU THAM KHO 53 Tm Melting Temperature (nhit núng chy) PH LC 57 v/p vũng/phỳt 2.3.2.5 Phng phỏp xỏc nh trỡnh t DNA 28 Chng KT QU V THO LUN 29 3.1 SO SNH C IM HểA SINH TRNG CA GING G 29 3.1.1 T l lũng trng, lũng , v ti 29 3.1.2 Hm lng vt cht khụ 30 3.1.3 Hm lng lipit tng s 31 M U Danh mục bảng Bng 1.1 S khỏc gia mó di truyn nhõn v ngoi ty th 11 Tớnh cp thit ca ti Bng 2.1 Cỏc thit b s dng ti 18 Trong nhng nm gn õy ngnh chn nuụi gia cm nc ta phỏt trin Bng 2.2 Thnh phn phn ng khuch i gen 25 nhanh, t c nhng tin b rừ rt, s lng u gia cm cng nh sn lng Bng 3.1 T l lũng , lũng trng, v ti 29 tht, trng ca ngnh tng hng nm Theo Hong Kim Giao v Nguyn Thanh Bng 3.2 Hm lng vt cht khụ trng g 30 Sn (Cc chn nuụi - B nụng nghip: Thụng tin Hip hi chn nuụi gia cm Bng 3.3 Hm lng lipid tng s tht g thớ nghim 31 Vit Nam - 2005) nhng nm gn õy tc tng u ca n gia Bng 3.4 Hm lng protein thụ trng g thớ nghim 33 cm t nm 1990 n nm 2000 l 5%/nm, nm 2002 l 6,69%, nm 2003 l Bng 3.5 Thng kờ cỏc im a hỡnh mu nghiờn cu so vi trỡnh t tham kho mó s AB268515 49 Bng 3.6 So sỏnh t l sai khỏc trỡnh t nucleotide ca mt s ging g .50 Danh mục hình 8,9% Tng n gia cm c nc 254,057 triu nm 2003, sn lng trng 4,85 t qu nm 2003 Bờn cnh vic phỏt trin cỏc ging g nhp ni cú nng sut cao nh g Lergho, Lng Phng, Lng Phng Sasso, g Brow nick, Tam hong thỡ vic bo tn v phỏt trin cỏc ging g ni cú kh nng thớch ng tt vi iu Hỡnh 1.1 S t chc ca DNA ty th G 10 kin chn nuụi ca a phng, cht lng tht, trng tt nh g ụng To, g Hỡnh 2.1 S vector tỏch dũng pJET1/blunt 26 c, g Tố, g Ri, g Mụng, g Mớa, g Tre, g H, g Tu vng, g Múng, g Hỡnh 3.1 Biu biu din t l lũng , lũng trng ca trng g 29 Chi cng ang c quan tõm Gn õy vic nhp ni cỏc ging g cú nng Hỡnh 3.2 Biu biu din hm lng vt cht khụ ca trng g 30 sut cao, cht lng tht, trng tt, cú kh nng thớch ng cao vi iu kin Hỡnh 3.3 Biu biu din hm lng lipid tng s trng g thớ nghim 32 chn nuụi a phng nh g Sao, g Ai cp cng ó v ang thu hỳt s chỳ Hỡnh 3.4 Biu biu din hm lng protein thụ tht g thớ nghim .33 ý ca ngi nụng dõn Hỡnh 3.5 nh kt qu in di DNA tng s 36 Vic ỏnh giỏ cht lng trng, tht cng nh tỡm hiu s a dng di truyn Hỡnh 3.6 nh kt qu in di sn phm PCR .39 mc phõn t ca cỏc ging g trờn l cn thit cho ngnh chn ging gia cm Hỡnh 3.7 nh in di mt s DNA plasmid trờn gel agarose 0,8% .42 Hin ó cú cỏc cụng trỡnh nghiờn cu v thnh phn húa sinh trng g Hỡnh 3.8 nh kt qu kim tra plasmid tỏi t hp bng XhoI v XbaI .44 Hỡnh 3.9 So sỏnh trỡnh t D-loop ca hai mu nghiờn cu Ri (Rhy), Mụng Ri, g c, Lergho [5], [9], [10], [27], [32], [36] Xỏc nh s a dng di truyn mc phõn t ca cỏc ging g qua nghiờn (Mna) vi trỡnh t tham kho mó s AB268515 48 cu vựng iu khin D-loop ty th trờn th gii c chỳ ý t nhng nm Hỡnh 3.10 Quan h di truyn ca mt s ging g 50 1990 v ang phỏt trin rng rói Vit Nam cỏc xỏc nh a dng di truyn mc phõn t g qua cỏc nghiờn cu liờn quan n vựng iu khin D-loop S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn mi bt u t nhng nm 1999 trờn i tng g lụi [4] n vic gii Chng I TNG QUAN TI LIU trỡnh t nucleotide vựng D-loop ỏnh giỏ mc a dng di truyn ang c 1.1 NGUN GC GIA CM quan tõm Hin TS Lờ Th Thỳy - Vin Chn Nuụi ang lm ch nhim Nhiu nh khoa hc ó nghiờn cu v ngun gc gia cm v a kt ti cp nh nc "Nghiờn cu s a dng di truyn cỏc ging g ni" lun rng: G nh hin cú chung ngun gc t g rng Gallus gallus G ú cú ging g Mụng v g Ri rng cú thõn hỡnh nh bộ, dn theo mựa, trng bộ, cú kh nng bay xa C Trong phm vi nghiờn cu ca lun ny chỳng tụi la chn ti: " So s ca kt lun trờn l g nh cú nhiu c im ging g rng v mt hỡnh sỏnh thnh phn húa sinh trng v trỡnh t vựng iu khin D-Loop ca thỏi n cu to gii phu cỏc b phn bờn c th, ting gỏy, tớnh ba ging g Ri, g Mụng v g Sao nuụi ti Thỏi Nguyờn" hot ng Mc tiờu ca ti Theo loi hỡnh g cú th chia thnh kiu: Kiu Bakira (g nguyờn - So sỏnh cht lng trng ca ba ging g thu): nhiu lụng, c n, mo v dỏi tai ln, m hi cong v nhn Kiu - So sỏnh trỡnh t on iu khin DNA ty th gia cỏc ging g Malaysia (g chi): ớt lụng v cng, mo v dỏi tai nh, u nh, mt lừm vo - Xỏc nh mi quan h di truyn ca mt s ging g hc mt, m ngn kho Kiu Cochin: nhiu lụng bng, lụng t, mo v dỏi Ni dung nghiờn cu tai va, tai nh mu , m tng i ngn T loi hỡnh trờn, ngi ta chn - Xỏc nh cỏc ch tiờu húa sinh trng: Hm lng vt cht khụ; t l lũng lc, dn dn hỡnh thnh nờn cỏc ging g chuyờn tht, chuyờn trng hay kiờm trng; lũng ; hm lng lipit; protein dng ngy Theo Nguyn n (1983) [1] v nhiu tỏc gi ó sp xp v trớ ca g - Tỏch DNA tng s t mỏu ca cỏc ging g trờn - Nhõn ton b vựng D-loop bng k thut PCR nh h thng gii ng vt nh sau: Gii ng vt (Animal); Ngnh - To dũng phõn t vựng D-loop ng vt cú xng sng (Chordata); Lp chim (Aves); B g (Galliformes); - Phõn tớch, so sỏnh trỡnh t vựng D-loop gen ty th vi trỡnh t ó c cụng H Tr (Fasia nidea); Chng Gallus; Loi Gallus gallus G c thun hoỏ u tiờn n cỏch õy 5000 nm, sau ú l Ba b ngõn hng genbank - V cõy phỏt sinh v mi quan h di truyn ca mt s ging g T Nh s tin b cụng tỏc chn ging, t cỏc ging g a phng ca chõu , sau nhp vo chõu u th k XVIII v XIX, u tiờn l nc Anh, sau ú l nc M, cỏc ging g c lai to thnh nhiu ging g cú nng sut cao hn nc ta, g rng c thun hoỏ v nuụi sm nht vựng Vnh Phỳ, H Bc, H Tõy T ging g nuụi ban u l tin thõn ca g Ri hin nhõn dõn ta ó to c nhiu ging g: g Mớa, g c, g Ri, g Tre, g ụng To, g Vng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.2 MT S C IM SINH HC CA BA GING G NGHIấN CU g trng p mỏi lỳc 157,20 ngy tui; g mỏi trng lỳc 177,65 ngy tui 1.2.1 G Ri G mỏi ớt v tha, s trng/mỏi/la l 13,65 qu, khong cỏch gia la G Ri l ging g ni ph bin nht nc ta, chim 70% tng s g l 19,88 ngy Trng g Mụng cú lng mc trung bỡnh vi 44,04g, c nc, ngun gc t nhúm g rng Gallus bankiva hay Gallus gallus Ngoi ch s hỡnh thỏi l 76,23%, ch s Haugh 105,90 T l vt cht khụ lũng hỡnh thon, nh; m nh; mo c cú rng ca mo ti rt phỏt trin trng l 50,56%, lũng trng l 12,41 T l protein lũng 16,66%, lũng trng; tớch v dỏi tai cú xen ln ỏnh bc trng; c thanh, di va phi ngc lộp trng 11,01%, lũng trng cú t l lipit khỏ cao 26,94% ,[17] bng thon, mm; chõn cú hai hng vi mu vng, cú xen ln mu ti 1.2.3 G Sao Bn chõn cú bn ngún, ca phỏt trin sm g trng Mu lụng rt khỏc G Sao cú ngun gc t g rng, thuc lp: Aves, B: Galliformes, H: ph bin mỏi cú mu vng rm, vng t, nõu nht v m Con trng Phasianidae Thỏng nm 2002, trung tõm nghiờn cu gia cm Thy mu lụng sm, u lụng cỏnh v lụng uụi cú mu en ỏnh xanh, lụng Phng ó nhp dũng g Sao t Vin nghiờn cu tiu gia sỳc Godollo bng nht hoc vng t Ngoi cũn mu lụng khỏc nh trng, hoa m, (Hungari) Kt qu nghiờn cu khng nh g Sao hon ton cú kh nng m trng [1] G Ri mc lụng sm, tc mc lụng nhanh hn g Mớa, thớch ng tt vi iu kin sinh thỏi Vit Nam [14] ụng To nờn cú kh nng chu ng tt hn nuụi iu kin thi tit ngy tui, g Sao cú b lụng mu cỏnh s, cú nhng ng k sc lnh, g Ri trng sm, tui u lỳc 123 ngy tui v t t l 5% lỳc chy di t u n cui thõn M v chõn mu hng, chõn cú ngún v cú 127 ngy tui Sn lng trng 90 - 115 qu/nm, trng nng 1,5 n hng vy Giai on trng thnh g Sao cú b lụng mu xỏm en, trờn phin 2kg, mỏi nng 1,1 n 1,6 kg G Ri ham p búng c 10 - 15 qu li lụng im nhiu nhng nt chm trng trũn nh Thõn hỡnh thoi, lng hi gự, ũi p, lng trung bỡnh 36 45g/qu g cú cht lng trng, tht tt uụi cỳp u khụng cú mo m thay vo ú l mu song cao khong 1,5 - 1.2.2 G Mụng cm Mo tớch ca g Sao mu trng hng v cú loi: mt loi hỡnh lỏ dt ỏp Theo Nguyn Vn Tr, 2000 [12] cho bit g Mụng phõn b vựng nỳi sỏt vo c, cũn mt loi hỡnh lỏ hoa ỏ r xung Da mt v c ca g Sao phớa Bc vi s lng khụng nhiu v ang cú nguy c b lai tp, mt dn T khụng cú lụng, lp da trn ny cú mu xanh da tri, di c cú ym tht nm 1999 ỏn Bo tn qu gen Vit Nam 1999 - 2002 v d ỏn Bo tn mng Chõn khụ, c bit trng khụng cú ca cỏc ging vt nuụi cú gen quý him 2000 - 2001 ó a ging g ny vo G Sao thuc loi nhỳt nhỏt, cnh giỏc, bay gii nh chim, rt ớt m, bo tn ti Sn La v H Ni G Mụng trng thnh cú hỡnh dng cõn i, cn nhau, thớch m nhng vt l c bit l cú tớnh by n cao; khụng vng chc, nhanh nhn, chõn cao mu en Mu sc lụng a dng, mu da bc l tớnh sinh dc rừ rng, g Sao mỏi trng trung G bt u en, tht en chim 90%, sc khỏng bnh cao, kh nng sinh sn thp Nng vo tun tui th 27 v t t l 5% tun tui th 30 c th t sut trng thp, cht lng trng tt, thm ngon c nhiu ngi a thớch lng khong 2,2-2,3 kg Tui t nh cao l 34-40 tun tui Nng sut G Mụng nuụi ti huyn Trm Tu tnh Yờn Bỏi cú tui thnh thc mun, trng/mỏi/23 tun l 85-100 qu S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.3 C S KHOA HC CA TI Thnh phn húa hc ca trng 1.3.1 C s ca vic nghiờn cu cỏc tớnh trng trng Trng gia cm núi chung v trng g núi riờng l mt loi thc phm rt Theo H Brandsch v H Bichel mt s tớnh trng thuc v c im sinh giu dinh dng, c bit l lũng cung cp khong 50% protein Thnh hc nh mu lụng, mu sc v trng, hỡnh dỏng c th, thnh phn cỏc loi phn dinh dng ca trng cỏc loi gia cm khỏc thỡ khỏc Protein protein, lipit trng, tht thuc cỏc tớnh trng cht lng trng thng l nhng protein d tiờu húa Hm lng m trng Cht lng lũng trng dng nh húa v d tiờu húa v cú cha hm lng acid bộo khụng no rt cao, T l lũng trng chim 55 - 60% lng trng nu nhỡn bng mt hm lng khoỏng cao, c bit l hm lng st v phospho Thnh phn thng nhng trng ti s cú lũng trng mu hi vng, nhng trng lõu khoỏng trng cú th thay i thụng qua khu phn n ca gia cm mu lũng trng sỏng hn Rose [27] Theo Gilbert [16] mt lũng trng cú lng 19g cú Theo Rose [27]; Krax [34] v Pingel [35] cu trỳc lũng trng c chia cha: 10,5mg natrium; 17,9mg kalium; 25,7mg calcium; 2,6mg magecium; lm lp ú l: Lp lũng trng loóng bờn ngoi 23%, Lp lũng trng c 1,5mg st; 29,8mg lu hunh; 24,7mg clo; 98,4mg phospho Hm lng gia 57%, Lp lũng trng loóng cựng 20% vitamin trng cao: 200-800UI vitamin A; 20UI vitamin D; 49àg vitamin B1; quỏnh ca lũng trng c (ch yu l si mucin) gim i theo tui gia 84àg vitaminB2; 30àg acid nicotinic; 58 àg vitaminB6; 580àg acid pantothenic; cm T l lũng trng c v lũng trng loóng trng g ti l 2:1, t l ny 10àg biotin; 4,5àg acid folic; 0,3àg vitamin B12; 150àg vitamin E; 25àg vitamin gim dn theo thi gian bo qun cú xung ti t l 1: Lũng trng trng K1 cú tỏc dng hp th cng nh cung cp cỏc cht dinh dng cho phụi Chiu cao lũng trng c l mt ch tiờu ỏnh giỏ cht lng bờn ca trng * Thnh phn húa hc ca lũng trng Lũng trng l ni d tr khong 88% nc ca trng Rose [27]; Vogt [36] phn cũn li l protein nh globulin, ovomucin v albumin Ovomucin chim Cht lng lũng Lũng trng l mt t bo khng l c bao bc bi mt lp mng, õy 75% tng protein lũng trng Globulin chim khong 20% Thnh phn cng l ngun dinh dng d tr ca phụi T l lũng chim 30 n 33% húa hc lũng trng trng tt c cỏc loi trng gia cm u ging Lũng lng trng v cú ng kớnh khong 30 n 35mm Lũng trng cú cu trng c cú hm lng ovomucin gp ln lũng trng loóng, õy chớnh l to nh sau: Lp mng dy dy - 11 àm; a phụi mu trng sỏng cú ng nguyờn nhõn to nờn cu trỳc keo ca lũng trng pH ca lũng trng trng kớnh 3mm ỏnh giỏ cht lng lũng ngi ta dựng ch s lũng Ch s g ti l 7,6; sau 14 ngy bo qun chỳng cú th tng lờn 9,2 Rose [27] V ny c xỏc nh bng t l gia chiu cao lũng so vi ng kớnh lũng Hartfiel [33] Kt qu nghiờn cu trờn g Ri ca Nguyn Hoi Tao v cs [10], Nguyn Vn Thch [11] cho bit ch s lũng trng l 0,43 Ch s lũng g xng en m lũng l triglicerit; 30% phospholipit v 5% cholesteron Hm Thỏi Hũa Trung Quc l 0,46 V Quang Ninh [7] S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn *Thnh phn húa hc ca lũng Lũng trng g cú cha 49% nc, 16% protein v 33% m Hai phn ba http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn lng nc lũng cú th thay i t 46 -50% tựy thuc vo thi gian mó gi l vựng iu khin (Displacement loop hay D-loop), trờn ú cú cỏc v iu kin bo qun Hm lng m lũng trng cng cú th thay i promotor ca quỏ trỡnh chộp v phiờn mó ca mtDNA Phõn t mtDNA theo khu phn n, ch riờng thnh phn acid bộo khụng no nh palmitin v cú cỏc c im ỏng chỳ ý sau: acid stearic l khụng thay i Hm lng acid bộo ny trỡ mc 30-38% tng s cht bộo Nu khu phn n cha nhiu acid bộo khụng no mch a (PolyUnsaturated Fatty Acid - PUFA) hm lng acid bộo khụng no mch - Tc tin húa phõn t ca mtDNA nhanh gp 5-10 ln so vi cỏc gen nhõn - Phõn t mtDNA l n bi, khụng tỏi t hp a m trng cng tng lờn Rose [27] Theo Creger [32] mt trng Cỏc kiu n bi (halotype) khỏc ca mtDNA cú th c s dng g nng 54g cú cha cỏc acid bộo khụng no l: 2,1g acid bộo olờic; 1,2g lm cỏc du hiu ch th vic phỏt hin s khỏc bit di truyn theo dũng linoleic; 0,16g linolenic; 0,13g arachidonic v cỏc acid bộo no l: 1,3g m ca cỏc qun th nuụi nht v cỏc qun th hoang di palmitinic; 0,4g stearic; ngoi cũn cú khong 0,2g lipoid khỏc Do vy tng Vựng iu khin l vựng tin húa nhanh nht ca mtDNA, nú tớch ly cỏc acid bộo lờn ti 5,5g Thụng thng t l acid bộo khụng no v no l 2:1 t bin cựng vi s thờm on, mt on vi t l cao gp 5-10 ln so vi 1.3.2 Phõn tớch trỡnh t vựng iu khin (D-loop) ty th cỏc gen ca ty th Vỡ th, vic xỏc nh trỡnh t nucleotide on iu khin 1.3.2.1 Ty th - c im cu to DNA ty th mtDNA l cụng c hu hiu ỏnh giỏ tớnh a dng di truyn v s phõn Ty th l bo quan cú mt tt c cỏc t bo hụ hp hiu khớ Ty th l trm chuyn húa nng lng t cỏc phõn t hu c thnh dng nng lng tớch ly phõn t ATP Ty th cú cha DNA ty th nú l mt h di truyn c lp vi h di truyn ca nhõn t bo nhỏnh tin húa bờn v gia cỏc qun th cựng mt loi 1.3.2.2 c im cu to h gen ty th g Ton b 16.775 bp genome ty th ca g Leghorn ó c xỏc nh trỡnh t, chỳng mó húa cho 13 protein, rRNA v 22 tRNA Mt s gen mó DNA ty th (mtDNA) l si kộp vi cu trỳc vũng, cú chiu di khong hoỏ protein hoc tRNA l cỏc gen nm gi lờn (overlapping genes) [15] 5àm, chim t 1- 5% DNA ca t bo Phõn t mtDNA t tỏi bn theo kiu Cỏc protein to c s dng chuyn in t v phosphoryl hoỏ bỏn bo ton nh h enzyme DNA polymerase cú cht nn ca ty th ty th Cỏc gen mó húa cho cỏc protein ny u c dch mó bi cựng v xy gian k ca chu k phõn chia t bo Khỏc vi DNA ca nhõn, mt b mó di truyn Genome ty th g cú ba c im riờng, khỏc lp thỳ v mtDNA khụng liờn kt vi protein histon, iu ny lm cho mtDNA tng t lng c: vi DNA ca vi khun, mtDNA l mt cỏc nhõn t quyt nh tớnh di - Theo chiu 5- ca chui nh t gen ND5 n vựng D-loop l cỏc truyn t bo cht Cỏc gen nm trờn mtDNA mó húa cho nhiu gen cytochrome b, tRNA(Thr), tRNA (Pro), ND6 v tRNA (Glu); protein/enzyme v RNA ca ty th cỏc ng vt khỏc, gen cytochrome b li nm gn vựng iu khin hn Trt phn ln cỏc ng vt cú xng sng, mtDNA cú chiu di khong t ny c bo ton cỏc loi thuc b g (Galliformes) [24] 16,8 kb Trờn mtDNA, ngoi cỏc gen cu trỳc cũn cú mt vựng khụng mang S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 11 - Mt im u chộp ca chui nh tng ng vi trỡnh t DNA ty th khụng cú intron, phõn t khụng cú s tỏi t hp Tc nm gia hai gen tRNA(Cys) v tRNA (Asn) u cú tt c cỏc ng vt cú bin i ca DNA ty th nhanh hn nhiu so vi DNA nhõn, cú th xng sng ó c gii trỡnh t genome ty th, riờng g khụng cú c l ty th thiu ht cỏc c ch sa cha DNA Tc t bin cao dn n im ny [24] nhiu bin d ty th, khụng ch gia cỏc loi m cũn xy c - COI (cytochrome oxidase I) cú mó m u l GTG thay vỡ ATG Ton b genome ty th g (Gallus gallus) c t chc nh s hỡnh 1.1 cựng mt loi S lng ty th cú bin i v mt di truyn t bo tựy thuc khụng nhng vo s ty th nú c tha hng t m m cũn vo cỏc yu t gõy t bin mụi trng Nhng bin d genome ngoi nhõn khụng ging gia cỏc ty th cựng mt t bo v gia cỏc t bo khỏc õy l mt s cỏc vớ d cho thy rng cú rt nhiu bin d mó di truyn ca ty th nhng khụng cú hi i vi c th mang t bin Trong hu ht cỏc trng hp, mó di truyn l ph bin Tuy th, cú mt s ngoi l di truyn hc ty th Di õy l mt s trng hp m ngi ta ó bit Bng 1.1 S khỏc gia mó di truyn nhõn v ngoi ty th Hỡnh 1.1 S t chc ca DNA ty th G c im di truyn Di truyn ty th l di truyn theo dũng m Trong thc t, cú n 99% ty th ca t bo tha hng t m bo quan ny nm t bo cht ca t bo trng So vi trng, tinh trựng cú mt s lng cỏc ty th ch bng 0,1% - 1,5%, s lng ny m bo nng lng giỳp tinh trựng ng quỏ trỡnh th tinh Khi tham gia th tinh, ty th ca tinh trựng b loi b nh c ch phõn gii protein ph thuc ubiquitin ụi c ch ny din khụng hon ton dn n s cú mt ca hai dũng ty th ca c b ln m c th con, hin tng ny c gi l d t bo cht B ba Mó ca gen nhõn Mó ca gen ty th AUA, AUU Ile Met UGA Stop Trp AGA, AGG Arg Stop DNA ty th v vai trũ ca vựng D-loop nh loi g V mt cu trỳc, vựng D-loop ca gia cm cú th c chia lm on theo Baker v Marshall (1997), bao gm cỏc on I, II v III Trong ú on II l on bo th nht, cú cha mt s n v cu trỳc m trỡnh t sp xp ca chỳng khụng thay i c bc phõn loi h Thụng thng, vựng bin i nhiu nht D-loop l on III [20] on ny bt u vi cm trỡnh t bo th (Conserved Sequence Block 1- CSB-1) Yu t phiờn mó (heteroplasmy) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 12 13 ca ty th (mtTFA) cú th bỏm vo trỡnh t ny v chuyn DNA ty th t quỏ Nm 1990, Desjadins v Morais ó cụng b ton b trỡnh t mtDNA ca trỡnh phiờn mó sang quỏ trỡnh chộp mt yu t khỏc kt hp vo phc g nh (Gallus gallus) vi tng chiu di 16775bp Vi trỡnh t ny, cỏc nh h mtTFA - CSB - khoa hc ó cú c s tin hnh nghiờn cu mi quan h chng loi gia Vựng iu khin ca DNA ty th cú tc tin húa nhanh gp 5-10 ln cỏc i tng thuc b g [15] vi cỏc gen ty th khỏc Trỡnh t nuleotide ca vựng D-loop l mt cụng c Nm 1994 - 1995, Fuhimito v cng s [23] ó nghiờn cu mi quan h rt hu hiu ỏnh giỏ tớnh a dng di truyn v s phõn húa bờn loi chng loi gia cỏc loi g rng, cụng, tr, chim cun cỳt da trờn cỏc phõn v gia cỏc qun th cựng loi Chớnh vỡ th m cỏc gen genome ty th tớch on iu khin ty th Kt qu phõn tớch tớnh a hỡnh chiu di cỏc on v vựng D-loop úng mt vai trũ vụ cựng quan trng cỏc nghiờn cu gii hn (RFLP) trờn vựng iu khin mtDNA cho phộp cỏc tỏc gi ny a thuc lnh vc phõn loi hc phõn t Nh vy, DNA ty th cú th c coi l mt s phõn loi gia cỏc loi trờn ng thi h ó xỏc nh c trỡnh t mt cụng c khụng th b qua tỡm hiu v mi quan h phỏt sinh chng ca 400bp u tiờn trờn vựng iu khin mtDNA Kt qu nhn c ó ch loi hay s tin húa ca cỏc qun th s lp li ca mt on khong 60bp trờn vựng iu khin mtDNA l im 1.3.2.3 í ngha ca DNA ty th nghiờn cu phõn loi g c trng ca ging Gallus Phõn loi hc c in trờn cỏc i tng thuc b g ch yu da vo cỏc Randi v cng s [16]; Scott [20] phõn tớch trỡnh t ca mt phn on c im b lụng bờn ngoi ca trng, ú l nhng c im sinh dc th iu khin ty th (on D-loop) ca loi g Lụi c hu Vit Nam ó ch cp Nhng c im ny mang mt tim nng bin i nhanh chúng qua cỏc s khỏc bit rt ớt mc phõn t gia ging g ny th h nờn khụng c coi l c s chớnh xỏc xỏc nh quan h tin húa Nm 1999, Kimball v cng s [18] cng da trờn s phõn tớch trỡnh t gia cỏc loi Chớnh vỡ vy, cỏc nh nghiờn cu ó tỡm n nhng c im cú y ca gen cytochrom b (1143bp) v on siờu bin 1(350bp) ca vựng th bc l mc bin i phự hp hn cho vic phõn tớch quan h tin húa iu khin mtDNA xỏc nh mi quan h chng loi ca mt s loi tr v v phỏt sinh chng loi cỏc loi Khi ú, mtDNA vi nhng u im ni bt g gụ Hai cõy phõn loi c xõy dng t hai h thng s liu nhn c trờn ó c chn lm i tng nghiờn cu hai on gen cho thy s khỏc l rt ớt Nh vy ch vi vic phõn tớch 1.3.2.4 Tỡnh hỡnh nghiờn cu DNA ty th g trờn th gii Trong hn 30 nm qua, vic nghiờn cu DNA ty th ó v ang c phỏt trin tng i rng rói Ngi ta ó tin hnh nhiu cụng trỡnh nghiờn mt on trỡnh t ngn trờn mtDNA cng cho kt qu khỏ phự hp vi kt qu phõn tớch trờn ton b gen cytochromb, iu ny cho thy trỡnh t vựng iu khin cú c s phõn tớch quan h chng loi cu mc phõn t trờn cỏc i tng vi sinh vt, cụn trựng, cỏ, chim, thỳ, - Zhang v ng tỏc gi ó gii trỡnh t 539 nuleotide u tiờn cỏc loi thc vt v ngi vi nhiu mc ớch khỏc Di õy l vựng D-loop ca chng g nh (Gallus gallus domesticus) Trung Quc v mt vi nghiờn cu c th trờn mt s loi thuc b G (Galliformes): so sỏnh d liu ny vi trỡnh t DNA ca loi khỏc: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei ó c cụng b Ngõn hng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 30 31 cú cht lng trng cao c a chung trờn th trng Trm Tu Yờn Bỏi t l vt cht khụ lũng trng l 50,56%, lũng trng 3.1.2 Hm lng vt cht khụ l 12,41 trng g c hm lng nc lũng l 49,3% 1,9; hm lng T l gia hm lng nc v vt cht khụ trng g l mt ch tiờu nc lũng trng l 88,8% 0,4 [9]; Hm lng nc lũng trng núi quan trng, rt cú ý ngha vic ỏnh giỏ cht lng ca trng g Sau chung khong 49% , hm lng nc lũng cú th thay i t 46 -50% tin hnh cõn, sy mu trng g 60 C ngy cho n khi tựy thuc vo thi gian v iu kin bo qun Nh vy kt qu nghiờn cu lng khụng thay i, kt qu c trỡnh by bng 3.2 v hỡnh 3.2 phự hp vi kt qu ca cỏc nghiờn cu trc, hm lng nc v vt cht khụ l tớnh trng s lng, nú ph thuc vo ging, ngun thc n v c bit Bng 3.2 Hm lng vt cht khụ trng g (n = 30) Lũng Trng g X mX Lũng trng X mX V X mX C qu cũn ph thuc vo iu kin bo qun trng nh phn tng quan ó cp X 3.1.3 Hm lng lipit tng s mX Ri (Rhy) 47,28 0,96 13,52 0,41 9,022 0,09 50,34 1,1 Mụng (Mna) 50,76 1,03 14,64 0,39 9,105 0,11 52,15 1,4 lng trng Lipid l mt nhng cht d tr em li giỏ tr nng lng Sao (Sdt) 54,09 1,17 15,98 0,53 9,519 0,25 55,09 1,3 cao rt cn thit cho c th sinh vt núi chung v g núi riờng Hm lng Hm lng lipid tng s cng l mt ch tiờu quan trng ỏnh giỏ cht lipit trung ch yu lũng , lũng trng hm lng lipit khụng ỏng k 60 Do ú hm lng lipit liờn quan cht ch n t l lũng /lũng trng % 50 Kt qu o ch tiờu hm lng lipid tng s chit bng petroleum ether 40 c trỡnh by bng 3.3 v hỡnh 3.3 30 Bng 3.3 Hm lng lipid tng s trng g thớ nghim (n = 10) 20 10 Ri (Rhy) Trng g lũng Lũng trng Mụng ( Mna) Sao (Sdt) V C qu Ch tiờu so sỏnh Hỡnh 3.2 Biu biu din hm lng vt cht khụ trng g thớ nghim Hm lng nc lũng , lũng trng, v v c qu u cao nht trng g L.L (%) X mX L.Ltrng (%) X mX 11.33 0,3 L L/ L L tng s (%) X mX Ltrng 5.65 37.67 0,58 Ri (Rhy) 64 0,9 Mụng (Mna) 63.33 0,3 5.33 0,8 11.88 34.33 0,3 Sao (Sdt) 64.67 0,8 6.67 1.19 9.70 35.67 0,65 Ri (Rhy): 52,72% ; 86,48% ; 9,78; 49,66 v thp nht g Sao (Sdt): 45,91%; 84,02%; 4,81%; 44,91% T l vt cht khụ trng g Sao l cao nht v trng g Ri l thp nht T l nc lũng v lũng trng theo nghiờn cu ca Lờ Vit Ly (2001) [5] g Ri l 47,32%; 1,137; 87,925 0,109 v vt cht khụ lũng l 52,616 1,137 v lũng trng l 12,075 0,109 Cũn g Mụng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 32 33 Bng 3.4 Hm lng protein thụ trng g thớ nghim (n = 10) % 70 60 Trng g Pr-L (%) X mX Pr-Ltrng(%) X mX Pr-L/ PrLtrng Pr tng s %) X mX Ri (Rhy) 18.32 0,64 12.86 0,24 1.42 15.59 0,42 Mụng (Mna) 16.31 0,51 12.94 0,33 1.26 14.63 0,39 14.2 0,49 1.43 17.24 0,51 50 40 30 20 Sao (Sdt) 10 L.Lũng (%) Ri (Rhy) L.Lũng trng (%) Mụng (Mna) L L/ L Ltrng L tng s (%) % Sao (Sdt) Ch tiờu so sỏnh 20.27 0,82 25 20 Hỡnh 3.3 Biu biu din hm lng lipid tng s trng g thớ nghim 15 Qua bng 3.3 v hỡnh 3.3 ta thy hm lng lipid lũng cao nht g 10 Sao (Sdt) v thp nht g Mụng (Mna) Theo tỏc gi Rụse [27] thỡ hai phn ba lipit lũng l triglicerit; 30% phospholipit v 5% cholesteron Hm Pr-L lng m trng dng nh húa v d tiờu húa v cú cha hm lng Ri (Rhy) acid bộo khụng no rt cao, hm lng khoỏng cao, c bit l hm lng st v phospho.Vỡ vy lũng trng c nhiu ngi a chung, hm lng m lũng trng cng cú th thay i theo khu phn n Lipit lũng trng cao nht g Ri v thp nht g Mụng Nh vy, ta thy rng hm lng lipid tng s cao nht trng g Ri (37.76%) thp nht trng g Mụng Ngh An (34.33%) Nu so sỏnh vi kt qu nghiờn cu trờn trng g cụng nghip ca Rụse [27] thỡ hm lng lipit ca cỏc ging g trờn cao hn hn T l lipit lũng /lũng trng cao nht g Mụng, thp nht g Ri 3.1.4 Hm lng protein tng s Hm lng protein l mt ch tiờu rt quan trng vic ỏnh giỏ giỏ tr dinh dng ca trng g Bng phng phỏp Lowry vi mỏy o quang ph, chỳng tụi ó thu c kt qu hm lng protein thụ trng g ca cỏc ging nghiờn cu c trỡnh by bng 3.4 v hỡnh 3.4 Pr-Ltrng (%) Mụng (Mna) Pr-L/ PrLtrng Sao (Sdt) Pr tng s (%) Ch tiờu so sỏnh Hỡnh 3.4 Biu biu din hm lng protein thụ trng g thớ nghim Qua bng 3.4 v hỡnh 3.4 ta thy hm lng protein tng s cao nht trng g Sao (17,24%) v thp nht trng g Mụng (14,63%) c bit hm lng protein lũng rt cao 20,27% G l ging g trng trung thỏng lin t thỏng n thỏng (õm) sau ú ngi ta thu hoch tht g trng thnh v nuụi la khỏc nờn iu ny rt cú ý ngha kinh t Kt qu nghiờn cu trờn cú th a mt nh hng v chn nuụi g Sao, mt ging g rt cú giỏ tr kinh t, d nuụi Theo kt qu nghiờn cu trờn lũng ca trng g c [9] cú hm lng protein l 17,6% 0,5 thỡ hm lng protein lũng ca trng g ri cao hn Kt qu ny cng phự hp vi kt qu nghiờn cu ca cỏc tỏc gi khỏc [33] Kt qu nghiờn cu ca chỳng tụi phự hp vi kt qu nghiờn cu trờn g Mụng nuụi ti Trm Tu Yờn Bỏi t l protein lũng l 16.66%, lũng trng 11,01% S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 34 35 3.2 NH GI A DNG DI TRUYN CA BA MU GING G mụi trng Thnh phn EDTA s liờn kt vi cỏc ion Mg2+, nh vy m hot tỡm hiu s khỏc bit mc phõn t gia cỏc cỏ th thuc ba ging ng ca cỏc nuclease b c ch Nh vy, c SDS v EDTA u tham gia g Ri, Mụng, Sao chỳng tụi tin hnh tỏch chit DNA tng s ca chỳng, bo v DNA s phõn gii ca cỏc nuclease Ngoi ra, protease K cú dựng k thut PCR nhõn on iu khin ty th, tỏch dũng nhm xỏc m chit s phõn hy cỏc liờn kt peptit protein Hn th, pH nh trỡnh t ca vựng D-loop So sỏnh cỏc trỡnh t ny tỡm s khỏc bit kim ca dung dch m chit lm DNA tr nờn n nh cu trỳc hn bn gia chỳng cht tớch in õm ca nú; ng thi lm gim tng tỏc tnh in gia DNA 3.2.1 Tỏch chit v tinh sch DNA tng s t mỏu g vi protein histon Hu ht cỏc nghiờn cu v sinh hc phõn t u bt u t vic thu nhn loi b protein hn hp, mu c lc mnh vi hn hp v tinh sch mt lng axit nucleic ln v trng thỏi tng i nguyờn Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Chloroform lm tng cng hot ng cho cỏc thớ nghim tip theo Mt nhng mi quan tõm hng u ca phenol vic bin tớnh protein nhng khụng lm nh hng n cu ca cỏc k thut tỏch chit DNA l lm th no gim ti a s phõn hy trỳc ca DNA ng thi, nú cũn to iu kin thun li cho vic tỏch pha ca chỳng Cỏc phõn t DNA cú th b phõn hy hay t góy tỏc nhõn c nc vi pha hu c Isoamyl alcohol cú tỏc dng lm gim bt quỏ trỡnh hc (nghin, lc mnh) hoc húa hc (b thy phõn bi cỏc enzym phõn gii tỏch chit Sau lc mnh v em ly tõm, hn hp c phõn lm ba pha: thoỏt mụi trng cỏc mng t bo b phỏ v) t c hiu sut v pha trờn cựng l pha nc cú cha DNA, pha gia l protein ó b bin tớnh, v tinh sch cao nht thỡ vic la chn mt phng phỏp tỏch chit cú nhiu pha cui cựng l hn hp phenol, chloroform v isoamyl alcohol Pha nc u im v phự hp vi i tng nghiờn cu l rt quan trng Vỡ mu s c hỳt nh nhng sang ng mi Dch chit ny sau ú c x lý bng hn dng thớ nghim ny l mu mỏu, cho nờn chỳng tụi ó la chn hp Chloroform:Isoamyl alcohol nhm loi b hon ton phenol cú ln phng phỏp cú s dng protease K v SDS ca Sambrook v Russell dch chit v mt ln na lm sch DNA Bc ny cú th lp li 1-2 ln tỏch chit DNA [28] Thu ta bng cỏch b sung vo dch chit 50 l CH3COONa 3M, pH5,2 Mỏu ụng c lm tan b n nhit 39C gi Trong iu v 1ml EtOH 100% EtOH cú tỏc dng hỳt lp nc bao quanh phõn t kin v nhit v thi gian nh vy, plasminogen huyt tng s DNA, l cỏc gc phosphate tớch in õm Khi ú cỏc ion Na+ s kt hp c chuyn sang dng hot ng l plasmin, cht ny phõn hy cỏc protein vi cỏc gc phosphate ny khin cho lc y gia cỏc chui nuleotide gim, nh fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nh ú m cỏc t bo c gii phúng ú DNA b kt ta Trong iu kin - 20C 15 gi thỡ DNA kt ta Sau ró ụng, em ly tõm dung dch mỏu ó c hũa tan dung dch gn nh hon ton Ra ta bng EtOH 70%, lm khụ v hũa tan ta m PBS Dung dch mui ny cú tỏc dng trỡ pH ca mỏu Cỏc t bo nc Trong dung dch lỳc ny cú ln nhiu RNA, vỡ th chỳng tụi ó loi thu c em hũa tan dung dch m tỏch cú cha EDTA v SDS S RNA bng RNAse, 37C 2-3 gi Hũa tan DNA tinh sch cú mt ca SDS lm cho mng t bo b phỏ v v gii phúng DNA ngoi nc kh ion vụ trựng v in di kim tra trờn gel agarose 0,8% S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 36 37 Kt qu c th hin trờn hỡnh 3.5 S dng cp mi H1255 v L16725 [3] nhõn vựng D-Loop t mu DNA tng s ó thu c Cỏc thụng tin v cp mi ny nh sau: L16725 (Tm = 60C): 5-AGGACTACGGCTTGAAAGC-3(19 nuleotide) H1255 (Tm = 55C): 5-CATCTTGGCATCTTCAGTGCC-3(21 nuleotide) Cp mi H1255 - L16725 c la chn bi vỡ õy l cp mi bo th, nú cú th c dựng cho nhiu loi, ging khỏc b G (Galliformes) [3] Khi s dng cp mi ny, chỳng tụi d tớnh s nhõn c on iu khin cú kớch thc 1227 bp PCR l loi phn ng ũi hi s chớnh xỏc v chu trỡnh nhit ca phn ng Hỡnh 3.5 nh kt qu in di DNA tng s M: Marker DNA lamda; DNA tng s ca g Ri; DNA tng s ca g Mụng; DNA tng s ca g Sao Kt qu in di cho thy, c bng DNA tng s ca mu g Ri, Mụng, Sao u sỏng trung v tng i rừ nột, khụng cú nhng mnh to nờn vt sỏng kộo di phớa di Hai bng DNA thu c cú kớch thc tng ng vi vch 21kb ca marker DNA lamda Nh vy, cú th s b ỏnh giỏ DNA tng s thu c ó t yờu cu v nng v tinh sch dựng cho cỏc thớ nghim tip theo Chu trỡnh nhit ca PCR iu quan trng nht l s la chn v tỡm nhit gn mi thớch hp Nhit gn mi phi thp hn Tm ca cỏc cp mi c s dng t - 5C cho mi cú th bt cp tt vi DNA khuụn Tng s chu k chỳng tụi tin hnh l 30, mi chu k gm ba giai on chớnh nh sau: - Giai on bin tớnh (Denaturation): Nhit bin tớnh thng khong 94 - 95oC m bo sau khong 30 chu k PCR, Taq gi c hot tớnh Thi gian bin tớnh tu thuc vo hm lng G - C v chiu di ca phõn 3.2.2 Nhõn vựng iu khin D-Loop ca DNA ty th D-loop l vựng khụng mó húa nht trờn DNA ty th ng vt cú xng sng Vựng ny cú cha cỏc im u chộp v cỏc promoter phiờn mó ca DNA ty th Vi c trng tớch ly cỏc t bin cao gp 5-10 ln so vi cỏc gen khỏc ty th v so vi DNA nhõn, D-loop tr thnh vựng ý ngha quan trng nghiờn cu a dng sinh hc v s phỏt sinh chng loi ca sinh vt Vỡ th, ỏnh giỏ tớnh a dng di truyn ca cỏc cỏ th g thuc ging Ri, Mụng, Sao, chỳng tụi chn trỡnh t nuleotide ca vựng D-loop nh mt cụng c nghiờn cu S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn cng nh thnh phn v nng cỏc cht tham gia t DNA Chỳng tụi chn nhit bin tớnh l 94oC phỳt Trc bc vo chu k th nht, nhit c t 95 oC phỳt m bo phõn t DNA c bin tớnh hon ton - Giai on gn mi (Annealing): Vỡ Tm nh nht ca cp mi trờn l 55C nờn nhit gn mi cú th t 50 - 52C Chỳng tụi ó th chy phn ng mt s giỏ tr khỏc khong nhit ny v chn c nhit gn mi ti u thớ nghim l 50C - Giai on kộo di chui (Extension): Nhit tng n 72C cho enzym Taq polymerase hot ng tt nht Tc tng hp ca phn ng http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 38 39 khong 1000 nuleotide/phỳt Trỡnh t vựng D-loop quan tõm cú kớch thc b cụ lp, d dn n s nhõn lờn ca cỏc on khụng cn thit Qua th 1227 bp nờn thi gian giai on kộo di chui c la chn l phỳt 20 giõy nghim, chỳng tụi thy, nng ca cỏc dNTP 1mM l phự hp Sau kt thỳc 30 chu k, chỳng tụi t nhit lờn 72C 10 phỳt - Thnh phn cui cựng ca PCR l DNA khuụn c tinh sch v ớt b m bo s tng hp c kt thỳc hon ton Sn phm PCR c gi t góy cú cha trỡnh t ớch cn nhõn lờn Thụng thng, hm lng DNA nhit 4C khuụn mi hn hp phn ng l 10-100ng/phn ng Sn phm PCR c in di kim tra trờn gel agarose 0,8% v bo qun 4C Thnh phn v nng cỏc cht tham gia Tham gia vo phn ng ny l thnh phn thit yu, ú l: Taq DNA polymerase, dung dch m, mi, MgCl2, cỏc dNTP, DNA khuụn v nc Trong ú cú thnh phn thng thay i tng phn ng l: mi, MgCl2 v DNA khuụn - Dung dch m: PCR c thc hin mt mụi trng m phự hp vi hot ng ca enzym cú giỏ tr pH l 7,2 Trong thớ nghim ny, sau kho sỏt, chỳng tụi s dng loi m cú cha NH4+ ca hóng Fermentas, nú phự hp vi hot ng ca enzym Taq polymerase v khong bin thiờn rng v nng ca MgCl2 Hn na, loi m ny cho cht lng sn phm tt hn so vi loi m khụng cú cha NH4+ - Mi: l mt yu t rt quan trng PCR bi vic iu chnh nhit gn mi v nng ca mi cú nh hng ln n lng sn phm thu c Nng mi xuụi v ngc s dng thớ nghim ny l 10 pmol/ l - MgCl2: Vai trũ ca ion Mg2+ l to phc vi dNTP v gn chỳng vi enzym, kớch hot v tng cng s kt hp gia mi v khuụn Nng Mg 2+ quỏ thp s lm gim hot tớnh ca enzym Tuy nhiờn, nu nng ny quỏ cao s c ch hot ng ca enzym Sau kho sỏt, chỳng tụi thy nng Mg2+ l 10mM cho kt qu PCR tt nht M: Marker; 1: Mu g Ri; Mu g Mụng; Mu g Sao Theo nh chp kt qu in di, c mu u xut hin bng DNA nm v trớ gia vch 1,5 kb v kb trờn thang kớch thc chun (marker); kớch thc phõn t ca sn phm PCR vo khong 1,3 kb, phự hp vi tớnh toỏn theo lý thuyt Cỏc bng sỏng m, rừ nột, trung chng t sn phm PCR c hiu, chỳng tụi ó nhõn c vựng D-loop Sn phm PCR c hiu, chng trỡnh ó la chn v nng cỏc cht tham gia phn ng l phự hp Cỏc sn phm PCR c trc tip s dng cỏc thớ nghim tip theo 3.2.3 Tỏch dũng v xỏc nh trỡnh t vựng D-Loop ca DNA ty th - loi dNTP: Nng ca mi loi dNTP u phi bng v ph thuc nhiu vo kớch thc ca on DNA ớch, nng ca mi v MgCl2 Nng ca cỏc dNTP ln hn mM s c ch phn ng PCR ion Mg2+ S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn Hỡnh 3.6 nh chp kt qu in di sn phm PCR http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.3.1 Tỏch dũng vựng D-Loop to iu kin cho vic xỏc nh trỡnh t vựng D-loop, chỳng tụi tin hnh tỏch dũng phõn t on ny vi kớch thc 1,3 kb ó nhõn c bng S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 40 41 cp mi L16725- H1255 Chỳng tụi ó s dng vector pJET1/Blunt tỏch nh sau: 5àl m phn ng 2X; 3àl sn phm PCR; 0,5àl H2O; 0,5àl enzyme dũng vựng D-loop Vector pJET1/Blunt cú kớch thc khong 3,1kb (3128 lm bng húa DNA Sau thi gian phn ng, DNA blunting c bin tớnh nucleotide), õy l vector tỏch dũng th h mi ca hóng Fermentas, mi nhit 70oC Tip theo, chỳng tụi tin hnh phn ng ghộp ni sn c s dng ti cỏc phũng thớ nghim Nú cú cha im u chộp phm PCR ó c lm bng húa vo 0,5àl vector pJET1 (50ng/àl) bng nờn cú kh nng chộp c lp vi cỏc gen ca t bo ch E.coli Trờn 0,5àl enzyme T4 DNA ligase (5u/àl) vector cú gen khỏng cht khỏng sinh (bla), nờn ch cú nhng t bo no mang Ly 3àl sn phm ghộp ni ny bin np vo t bo kh bin E.coli vector ny mi cú th sng dc mụi trng cú Amp ng thi, trờn dũng DH5 Cỏc t bo kh bin c nuụi cy trờn mụi trng LB c cú b vector ny cũn cú cha gen gõy cht Eco47IR, mó húa cho enzyme nuclease sung Amp (50àg/ml) 37oC qua ờm Kt qu chỳng tụi thu c rt nhiu phõn hy DNA nhõn tn ti t bo vt ch Vỡ vy, vector c gn khun lc l cỏc dũng t bo vi khun cú mang plasmid xỏc nh xem cỏc thờm gen ngoi lai s lm lch khung c ca gen Eco47IR khin enzyme plasmid ny cú thc s ó mang on gen ó nhõn c bng k thut PCR, c tng hp khụng cũn hot tớnh nh trc na dn n s khụng phõn hy chỳng tụi tỏch chit DNA plasmid t mt s khun lc kim tra c DNA nhõn ca t bo ch Nh cú Eco47IR m quỏ trỡnh la chn Tỏch chit plasmid khun lc cú mang plasmid tỏi t hp s hiu qu hn Vựng P lacUV5 iu Cỏc t bo sau nuụi cy c thu nhn bng ly tõm 6000 v/p, khin s biu hin ca gen Eco47IR mt cỏch y m khụng cn n cht phỳt, 4C DNA tn ti t bo vi khun E coli gm hai dng: DNA cm ng IPTG nhim sc th cú dng mch thng v DNA plasmid dng mch vũng thu Thờm vo ú, vựng MCS (Muntiple Cloning Site) ca vector cú im nhn v tinh sch DNA plasmid, chỳng tụi tin hnh x lý t bo thu c nhn bit ca nhiu enzyme ct hn ch nh Kpn2I, XhoI, XbaI nhm phc sau nuụi cy bng cỏc dung dch I, II, III Dung dch I (sol I) cú tỏc dng v cho vic ct kim tra sau tỏch dũng Ngoi ra, vector mang trỡnh t sch t bo v hũa tan t bo SDS sol II cú tỏc dng phỏ mng v mi PJET1 xuụi v ngc nm v hai phớa ca im gn sn phm PCR cho cựng vi EDTA sol I s gn cht vi Mg 2+ lm c ch hot ng ca phộp nhõn on PCR c gn vo sau tỏch dũng vi s lng ln, phc v cỏc nuclease, nh ú DNA c bo v DNA nhim sc th cú kớch thc cho vic gii trỡnh t gen ln, liờn kt cht ch vi protein to phc h nucleoprotein nờn cu trỳc ca Nh ó bit vic s dng Taq polymerase PCR s to khong chỳng rt cng knh, ngc li vi DNA plasmid cú cu trỳc gn nh Chớnh 70% - 90% sn phm PCR cú thờm mt nucleotide A u Mt khỏc, vỡ th, DNA plasmid ó c gii phúng mụi trng thỡ DNA nhim sc pJET1/Blunt li l vector tỏch dũng u bng nờn ch cỏc sn phm PCR du th hu nh cha kp thoỏt ngoi CH3COOK v CH3COOH sol bng hoc ó c bng húa mi thc hin c phn ng ghộp ni vi III cú tỏc dng lm gim pH ca dung dch v gn vi im ng in ca vector ny Do ú, trc thc hin phn ng ghộp ni,chỳng tụi lm bng DNA v gõy bin tớnh protein; cựng vi s cú mt ca EtOH 100% nhit húa u ca sn phm PCR Thnh phn ca phn ng lm bng húa u S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 42 43 thp, DNA plasmid b kt ta v d dng c tỏch nh ly tõm Sn phm mu Sdt u cú cỏc dũng th 2, th 4, th v th (kớ hiu Rhy 2; Mna 4; c in di trờn gel agarose 0,8% Kt qu c trỡnh by hỡnh 3.7 Sdt 7; Sdt 9) cao hn dũng i chng T õy, cú th d oỏn cỏc dũng ny Hn hp DNA plasmid thu c sau tỏch chit thng tn ti dng cú th chốn thờm mt on DNA ngoi lai khng nh c cỏc dũng ó cu trỳc: Dng siờu xon, dng vũng m v dng mch thng Dng th nht chn cú mang on DNA c nhõn lờn bng PCR hay khụng, chỳng tụi tin cú cu trỳc khụng gian gn nh nht, c hỡnh thnh liờn kt hidro hoc hnh ct kim tra cỏc dũng Rhy 2; Mna 4; Sdt 7; Sdt bng enzyme hn ch liờn kt tnh in gia cỏc phn ca phõn t plasmid vi Dng vũng m Kim tra plasmid bng vic x lý enzyme hn ch cú mt mch n b t góy v dng cũn li cú c hai mch u b t góy kim tra kớch thc thc t ca on DNA c ni vo vector, Khi in di, dng no cng cú kớch thc gn nh thỡ s di chuyn ca chỳng chỳng tụi tin hnh phõn tớch cỏc mu DNA plasmid k trờn bng phng cng nhanh, cng xa so vi v trớ ca ging tra mu Theo ú, dng siờu xon phỏp ct enzyme hn ch Vector pJET1/Blunt cú cha im nhn bit ca chy nhanh nht, tip ú l dng vũng m v cui cựng l dng mch thng enzyme XhoI phớa bờn trỏi v cha im nhn bit ca enzyme XbaI phớa bờn phi ca v trớ ghộp ni gen Mt khỏc, trỡnh t vựng D-Loop ó cụng b khụng cha im nhn bit ca enzyme ny Do vy phõn tớch vector tỏi t hp bng XhoI v XbaI s thu c cỏc on gen cú kớch thc gn ỳng vi kớch thc ca vector nguyờn bn v ca on gen ó c ghộp ni vo vector Kt qu phõn tớch sn phm ct enzyme trờn hỡnh 3.8 cho thy cỏc DNA plasmid tỏi t hp c ct thnh bng: mt bng cú kớch thc 3,1 kb (tng ng vi kớch thc ca vector pJET1/Blunt); bng cú kớch thc Hỡnh 3.7 nh in di mt s DNA plasmid trờn gel agarose 0,8% C: DNA plasmid i chng (khụng c chốn thờm on DNA) khong 1,3 (tng ng vi kớch thc ca sn phm PCR) Kt qu ny chng t sn phm PCR ó c ghộp ni thnh cụng vo vector Nhng plasmid tỏi t hp ny c tinh sch phc v cho vic xỏc nh trỡnh t gen 1- 3: DNA plasmid mu Ri (Rhy) - 6: DNA plasmid mu Mụng (Mna) Kt qu ca phn ng ct trờn hỡnh 3.8 cho thy: trờn ng chy (4, v 6) xut hin hai bng: mt bng cú kớch thc 3,1 kb (bng kớch thc ca 7- 9: DNA plasmid mu Sao (Sdt) tin li cho vic la chn cỏc dũng plasmid c chốn thờm on vector pJET1/Blunt), bng khỏc cú kớch thc khong 1,3 kb (tng ng vi DNA, tin hnh in di kim tra, chỳng tụi ó s dng mt DNA plasmid kớch thc ca sn phm PCR) ng chy ch cú mt bng cú kớch thc i chng (khụng c chốn thờm on DNA) Do vy, da vo cao thp 3,1 kb Nh vy, ó chn c dũng (1 dũng thuc mu g Ri (Rhy), 1dũng ca cỏc bng so vi bng i chng m ta cú th d oỏn dũng no ó c thuc mu g Mụng (Mna), dũng thuc mu g Sao (Sdt)) cha plasmid tỏi chốn thờm on DNA Kt qu trờn hỡnh 3.7 cho thy: mu Rhy, mu Mna v t hp mang on DNA quan tõm S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 45 Nhng plasmid mang on chốn cha vựng D-loop ny c nhõn vi s vựng D-loop ca mu nghiờn cu Mna v Rhy vi kớch thc 1220 bp lng ln v tinh sch phc v cho vic gii trỡnh t nuleotide Do iu kin thi gian cú hn, mu g Sao (Std) trỡnh t cú nhiu C, vic c trỡnh t gp phi khú khn nờn trỡnh t D-loop ca g Sao cha y Vỡ vy chỳng tụi ch cụng b v so sỏnh kt qu hai mu Mna v Rhy So sỏnh cỏc trỡnh t Mna v Rhy vi v vi trỡnh t D-loop ca g gallus gallus gc Nht Bn (Mó s AB268515) c cụng b trờn Ngõn hng trỡnh t gen quc t EMBL (EBI)/GenBank/DDBJ [37], chỳng tụi thu c kt qu hỡnh 3.9 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | Hỡnh 3.8 Kt qu kim tra plasmid tỏi t hp bng XhoI v XbaI M: Thang DNA chun (DNA c ct bng EcoRI v Hind III) AB268515 acctaactcccctactaagtgtaccccccctttcccccccagggggggtatactatgcat Mna .- Rhy .- Plasmit khụng c ct DNA 70 Sn phm ct ca plasmid khụng cú on chốn DNA 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | Sn phm PCR AB268515 aatcgtgcatacatttatataccacatatattatggtaccggtaatatatactatatatg 4; 5; Sn phm ct ca dũng Ri (Rhy)2; Mụng (Mna) 4; Sao (Sdt) Mna Rhy 3.2.3.2 Xỏc nh trỡnh t vựng iu khin ca DNA ty th 130 Sau DNA plasmid c tinh sch, chỳng tụi tin hnh xỏc nh trỡnh t DNA trờn mỏy c trỡnh t t ng trờn c s phng phỏp ca Sanger Nguyờn tc v cỏch thc c ó c mụ t mc 2.3.2.5 150 160 170 180 AB268515 tactaaacccattatatgtatacgggcattaatctatattccacatttctcccaatgtcc Mna Rhy Xỏc nh trỡnh t nucleotide t chiu ca tt c cỏc on DNA cú 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | đ cỏc plasmid tỏi t hp ó c to, s lý bng phn mm ABI PRISM 3100- 140 | | | | | | | | | | | | AB268515 attctatgcatgatccaggacacactcattcaccctccccatagacagctccaaaccact Avant Data Collection v2.0 v DNA Sequencing Analysis 5.2 Vi mi chiu Mna A T .T T c tt c cỏc plasmid chỳng tụi thu c cỏc on di khong 800 Rhy A T .T T nucleotide Vỡ on gen cn xỏc nh trỡnh t di khong 1,3 kb, vi 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | iu kin thớ nghim tt nht, mỏy c ch xỏc nh c ti a khong 900AB268515 accaagtcacctaactatgaatggttacaggacataaatctcactctcatgttcttcccc Mna T C C kt hp s liu ca chiu c chỳng tụi thu c trỡnh t hon chnh ca Rhy T C C S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn 1000 nucleotide S dng phn mm Sequencing Analysis 5.2, Seqscape 2.5 http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 310 320 47 330 340 350 360 730 | | | | | | | | | | | | 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | AB268515 caacaagtcacctaattatgaatggttacaggacatacatttaactaccatgttctaacc AB268515 tacacctgcgttgcgtcctatcctagtcctctcgtgtccctcgatgagacggtttgcgtg Mna T C Mna .A Rhy T C Rhy 370 380 390 400 410 420 790 | | | | | | | | | | | | 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | AB268515 catttggttatgctcgccgtatcagatggatttattgatcgtccacctcacgagagatca AB268515 tatggggaatcatcttgacactgatgcactttggatcgcatttggttatggttcttccac Mna Mna Rhy Rhy 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | 850 860 870 880 890 900 AB268515 gcaacccctgcttgtaatgtacttcatgaccagtctcaggcccattctttccccctacac Mna .C AB268515 cccccccggtaaatggtgctatttagtgaatgcttgtcggacatatttttatcaattttc Rhy .C Mna Rhy 490 500 510 520 530 | | | | | | | | | | | | 540 | | | | | | | | | | | | 910 920 930 940 950 960 AB268515 ccctcgccctactt-gccttccaccgtacctctggttcctcggtcaggcacatcccatgc Mna - AB268515 acttcctctattttcttcacaaaactaggaaattcaccacaattttttctttgttatttt Rhy - Mna Rhy 550 560 570 580 590 | | | | | | | | | | | | 600 970 | | | | | | | | | | | | 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | AB268515 ataactcctgaactttctcactttt-cacgaagtcatctgtggattatcttcccctcttt AB268515 ttaattttttttttattttttaaaaacattttttaaaaaactaaattacatacaaactac Mna - Mna Rhy - Rhy 610 620 630 640 650 660 1030 | | | | | | | | | | | | 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | AB268515 agtccgtgatcgcggcatcttctctcttctattgctgttggttccttctctttttggggc AB268515 cgcataaaatccctcaaactatacaaacgtttatcgtataatatatatacattattgttt Mna Mna Rhy Rhy 670 680 690 700 710 720 1090 | | | | | | | | | | | | 1100 1110 1120 1130 1140 | | | | | | | | | | | | AB268515 ttcttcacaggttgcccttcacagtgcgggtgcggagtgctattcaagtgaagcctggac AB268515 attctatcattattagagaaactccactaccaaaaccatcattaaaacaaaaatttacat Mna Mna Rhy Rhy S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 49 Bng 3.5 Thng kờ cỏc im a hỡnh mu nghiờn cu so vi trỡnh t chun 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | AB268515 gccacttaactcccctcacaaacaatcgttatttatattgttaattagcaaacacaaaac Mna Rhy 1210 1220 | | | | AB268515 ctgccttctaccactataaa Mna CA Rhy SST Mu Mna, Rhy Thay i nucleotide del C Mna, Rhy G A Mna, Rhy C T 203 ng hoỏn Mna, Rhy C T 229 ng hoỏn Mna, Rhy C T 232 ng hoỏn V trớ trờn ty th Kiu bin d 30 Mt nucleotide 198 ng hoỏn Mna, Rhy C T 242 ng hoỏn Hỡnh 3.9 So sỏnh trỡnh t D-loop ca hai mu nghiờn cu Ri (Rhy) v Mụng (Mna) vi trỡnh t tham kho mó s AB268515 Mna, Rhy T C 246 ng hoỏn So sỏnh trỡnh t mu Mụng Ngh An (ký hiu Mna) v Ri Hng Yờn Mna, Rhy T C 296 ng hoỏn (Rhy) vi trỡnh t chun chỳng tụi thy cú 16 im a hỡnh/t bin (khỏc bit Mna, Rhy C T 301 ng hoỏn nucleotide) Mu g Mna cú 14 im (chim 1,15%) v mu g Rhy cú 13 10 Mna, Rhy T C 316 ng hoỏn im khỏc bit vi trỡnh t chun (chim 1,1%) Trong 16 im khỏc bit ny 11 Mna, Rhy T C 432 ng hoỏn c mu g Mna v Rhy u mt mt nucleotide C v trớ s 30 so vi trỡnh t 12 Mna G A 778 ng hoỏn 13 Rhy del A 1181 Mt nucleotide 14 Rhy del A 1182 Mt nucleotide 15 Mna C T 1201 ng hoỏn 16 Mna G A 1202 ng hoỏn chun C hai dũng thuc mu g Mụng ngh An v Ri Hng Yờn u cựng cú s khỏc bit nucleotide so vi trỡnh t chun AB268515 ú l cỏc t bin: Thay th C bng T (C bng C (T T) cỏc v trớ 203, 229, 232, 242, 301; Thay th T C) cỏc v trớ 246, 296, 316, 432; Thay th G thnh A (G A) v trớ 198 Ngoi gia hai dũng thuc mu g Mụng ngh An v Ri Hng Yờn cũn cú s khỏc bit vi im a hỡnh (chim 0,4%) cỏc v trớ: Mu Mna t bin thay G A v trớ 778; Mu Rhy t bin mt nucleotide A v trớ 1181, 1182; Mu Mna v trớ 1201 t bin thay T v v trớ 1202 t bin thay G C Chỳng tụi ó so sỏnh trỡnh t vựng D-loop ca mu nghiờn cu vi mt s trỡnh t ca cỏc chng g ó c cụng b WhiteLergo gc Anh ly trỡnh t ngõn hng gen mó s AB114078 [37], Lng Phng, c Tim gc Trung Quc [3] so sỏnh mc sai khỏc v trỡnh t nucleotide v xỏc nh mi quan h di truyn gia chỳng kt qu so sỏnh bng 3.6 A Cỏc sai khỏc gia cỏc mu ch yu l t bin kiu ng hoỏn (81,25%), c thng kờ bng 3.5 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 51 Bng 3.6 So sỏnh t l sai khỏc trỡnh t nucleotide ca mt s ging g Nhỏnh gm ging g Mụng, Ri, c Tim v White Lrgho ú g Ri v g Mụng cú quan h di truyn gn, mc ng nht v thnh phn nucleotide n 99,75% c Tim v White Lrgho cú quan h di truyn gn mc ng nht v thnh phn nucleotide n 99,34% Nhỡn chung s sai khỏc thnh phn nucleotide gia cỏc ging g ny khụng nhiu H s ging AB268515 Mna AB268515 0.0000 0.9892 0.9917 0.9892 0.9876 0.9967 Rhy Legho Ati LPh Mna 0.0108 0.0000 0.9975 0.9892 0.9917 0.9892 Rhy 0.0083 0.0025 0.0000 0.9926 0.9926 0.9901 Legho 0.0108 0.0083 0.0074 0.0000 0.9934 0.9892 KT LUN V NGH Trờn c s bc u nghiờn cu thnh phn húa sinh trng ca ging g Ati 0.0124 0.0083 0.0074 0.0066 0.0000 0.9876 Ri, g Mụng, g Sao v phõn tớch trỡnh t on D-Loop ca mu ging g LPh 0.0033 0.0108 0.0099 0.0108 0.0124 0.0000 gc Vit Nam g Ri, g Mụng Chỳng tụi rỳt mt s kt lun v ngh sau: Kt lun H s khỏc Qua bng 3.6 v so sỏnh sai khỏc trờn trỡnh t gen cho thy s sai khỏc trỡnh t nucleotide gia g Mụng vi g Lng Phng [3] l cao nht 1,08% (13 im a hỡnh), g Ri vi g Lng Phng l 12 im a hỡnh chim 0,99% v sai khỏc v trỡnh t nucleotide gia g Mụng vi g Ri l thp nht 0,25% (5im a hỡnh) Mi quan h di truyn gia cỏc ging g trờn c th hin trờn hỡnh 3.10 T l lũng cao nht trng g Mụng 34.82 % , thp nht g Sao 29.67% T l vt cht khụ: trng g Sao t cao nht 55,09%; trng g Ri thp nht 50,34% Hm lng L tng s v hm lng protein tng s trng ging g: Hm lng lipid tng s cao nht g Ri (37.76%); thp nht g Mụng Ngh An (34.33%) Hm lng protein tng s Cao nht trng g Sao v thp nht trng g Mụng (14,63%) c bit lũng trng g Sao hm lng protein v hm lng lipit rt cao (20,27%; 64,67%) cho nờn trng g Sao c ỏnh giỏ l cú cht lng tt nht trng ca ging nghiờn cu Tỏch chit v tinh sch c DNA tng s t mu g thuc ba mu ging g Ri, g Mụng v g Sao Nhõn bn thnh cụng vựng D-loop ty th ca Hỡnh 3.10 Quan h di truyn ca mt s ging g ba ging g ny vi kớch thc khong 1,3 kb ca mu ging g trờn bng Kt qu thu c hỡnh 3.10 cho thy cỏc ging g trờn c chia thnh nhỏnh: nhỏnh gm ging Lng Phng cú quan h gn nht vi ging g ca Nht Bn c ng ký vi mó s AB268515, mc ng nht v thnh phn nucleotide gia chỳng rt cao 99,67% k thut PCR nh cp mi H1255 - L16725; to dũng phõn t sn phm PCR S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn c mu http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 53 Xỏc nh trỡnh t ca vựng D-loop gm 1220 nucleotide ca hai mu g nghiờn cu v phỏt hin c 16 im a hỡnh/t bin v nucleotide gia cỏc i din ca hai mu ging g nghiờn cu vi trỡnh t chun Mi quan h di truyn: G Ri v Mụng cú quan h di truyn gn; g Lergho gc Anh v c tim gc Trung Quc cú quan h gn; g Lng Phng gc Trung Quc cú quan h di truyn gn vi ging g gc Nht Bn mó s AB268515 TI LIU THAM KHO TI LIU TING VIT Nguyn n, Nguyn Vit Ly, Nguyn Vn Thin, Nguyn Khỏnh Quc, Trn Xuõn Th, Hong Giỏn (1974), Di truyn ng vt, NXB Nụng nghip H Ni Nguyn Hi H (2000), To dũng phõn t on gen iu khin AND ty th ca hai loi g Lụi c hu Vit Nam, Khúa lun tt nghip ngnh cụng ngh Trong phm vi nghiờn cu ny, vi s lng ch ly t mt cỏ th thuc mi ging, chỳng tụi ch a c s liu ban u v c im a hỡnh vựng D-loop trờn ty th ca ging g Ri v Mụng thuc loi Gallus gallus domesticus cú th ỏnh giỏ c ton din hn v ý ngha ca cỏc v trớ a hỡnh/t bin trờn vựng D-loop hoc a c cỏc kt lun y hn v s a dng DNA gia hai chng g ny cn phi tin hnh nghiờn cu v phõn tớch trờn mt s lng mu ln hn Tip tc nghiờn cu trỡnh t D-loop ca g Sao, v cỏc ging g ni, nhp ni xỏc nh s a dng di truyn cng nh mi quan h di truyn gia cỏc ging g hin nay, nhm cung cp thụng tin cho ngnh chn ging CễNG TRèNH KHOA HC CễNG B Bựi Th Kiu Võn, Nguyn Trng Lng: Nghiờn cu tỏch vựng iu khin D-loop ty th g Ri, g Mụng v g Sao Tp Khoa hc v Cụng ngh i ngh sinh hc, HQG H Ni, trng HKHTN ch Th Kim Hng (2006), Phõn nh mt s chng g nh (gallus gallus domesticus)qua AND ty th, Khúa lun tt nghip, Trng HKH t nhiờn, H Ni Lờ c Long (2007), Nghiờn cu kh nng sinh trng, thnh phn húa sinh tht v ỏnh giỏ s sai khỏc di truyn ca g Mụng nuụi ti Thỏi Nguyờn, Lun thc s sinh hc, trng HSP Thỏi Nguyờn, Thỏi Nguyờn Lờ Vit Ly (2001), "G Ri" - Chuyờn kho Bo tn ngun gen vt nuụi Vit Nam, II Phn gia cm, NXB Nụng Nghip H Ni Tr 9-11 Chu Vn Mn (2003), ng dng tin hc sinh hc, NXB HQG H Ni V Quang Ninh (2002), Nghiờn cu mt s c im sinh vt hc v kh nng sn sut ca ging g xng en Thỏi Hũa Trung Quc, lun thc s khoa hc nụng nghip, trng H Nụng Nghip I, H Ni Kim Th Phng Oanh (1999), ng dng cỏc phng phỏp sinh hc phõn t hc Thỏi Nguyờn, 2008 2, s 46, trang 67 - 69 nghiờn cu s khỏc bit di truyn mt s loi g lụi Vit Nam, Lun Thc s khoa hc sinh hc, trng HSPI, HQG H Ni, H Ni Trn Th Mai Phng, (2004), Nghiờn cu kh nng sinh sn, sinh trng v phm cht tht ca ging g c Vit Nam, Lun ỏn tin s chuyờn ngnh chn nuụi, Vin Chn Nuụi, H Ni S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 55 10.Nguyn Hoi Tao, T An Bỡnh v ctv (1985), Mt s ch tiờu v tớnh nng 20.Krist L (2000), Phylogeny DNA phylogeography of European parids, sn xut v cht lng trng- tht g Ri, Tuyn cụng trỡnh nghiờn cu chn nuụi 1969- 1984, NXB Nụng nghp H Ni, tr100 - 107 11.Nguyn Vn Thch (1996), Nghiờn cu kh nng sinh trng, cho tht v sinh sn ca g Ri nuụi bỏn thõm canh, Lun Vn thc s khoa hc nụng nghip, Vin KHKT Nụng Nghip Vit Nam Oulu university, Oulu 21.McPherson M.J., Quirke P.(1991), Taylor G.R.PCR - A Practical Approach IRL Press at Oxford University Press 22.Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X P., Chen G., Zhang Y P (2002), The origin DNA genetic diversity of Chinese native chicken breeds, 12.Nguyn Vn Tr (2000) Nghiờn cu cỏc c tớnh sinh hc v tớnh nng sn xut ca ging g Mốo nuụi ti cỏc nụng h tnh Cao Bng, Lun thc s khoa hc nụng nghip, i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn 13.Lờ c Trỡnh, Nguyn Hng Qu, Hong Th Bớch Ngc (1995), Thc húa sinh, NXB Yhc Biochem Gene., 40(5), pp 163-174 23.Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S (1996), Monophyletic origin DNA unique dispersal patterns of domestic fowls, Pro Natl Acad Sci USA, 93(13), pp 67926795 14 Phựng c Tin, Nguyn Th Kim Anh (2007), c im sinh hc ca g Sao Tp khoa hc k thut nụng nghip NXB Nụng Nghip tr 4-23 TI LIU TING ANH 24.Pereira S L., Bakern A J (2004), Low number of mitochondrial pseudogenes in the chicken (GALLUS GALLUS) nuclear genome: implications for molecular inference of population history DNA 15.Desjadins P., Morais R (1990), Sequence DNA gene organisation of the chicken mitochondrial genome, A novel gene order in higher vertebrates, phylogenetics, BMC Evol Biol., 4(17) 25.Randy E., Lucchini V., Hennache A (1997), Searching for mtDNA genetic diversity in captive Edwardspheasant, The International J.Mol.Biol., 212, pp 599-635 16.Gilbert, A.B (1971), "The egg, ist physical and biochemical aspects", In:domestic fowl, Bd.3, Academic press, London/newyork,1971 17.Hillis D M., Moritz C., Mable B K.,1996 Molecular Systematics Sinauer Associates, Inc., Second edition Studbook For The Edwardspheasant (Lophura edwardsi) DNA Its conservation, Paris, pp 117-120 26.Rayes A., Yang M Y., Bowmaker M., Holt I.J (2005), Bidirectional replication initiates at sites throughout the mitochondrial genome of 18 Kimball R.T., Braun E.L., Zwarrtjes P W., Crowe T M (1999), and ligon J D A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggests that these lineages are not monophyletic Mol Phylogenet Evol., 11(1) tr.38-54 19.Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T (2004), The evolutionary origin of long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks birds, J Biol Chem., 280(5), pp 3242 3250 27.Rose, S.P (1997), Pinciples of poultry science - CaB International Wallingford Oxon OX 108 DE, U.K, pp 36 -37 28.Sambrook J., Russell D W, (2001), Molecular Cloning: A labroratory Manual, Cold Spring Harbor Labroatory Press, NewYork disclosed by the mtDNA sequence analysis., Gene, 333, pp 91 99 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 57 29.Scott E.A (1997), Systematic relationships of endemic Vietnamese pheasant The PH LC International Studbook For The Edwards's pheasant (Lophura edwardsi) And t Conservation: 26 - 30 30 Wang J., He X., Ruan J., Dai M., Chen J., Zhang Y., Hu C., Li S., Cong L., Fang L., Liu B., Li S., Wang L., Burt D W., Ka G., Wong S., Yu J.,Yang H.,Wang J (2005), Chick VD: A sequence variation database for the chicken genome, Nucle Acids Res., 33(5), pp 438-441 31 Van Tijen, W.F (1972), "The correlation between height of thick Albumen, yolk diameter, shape index and the position of the yol after storage", Brit Poult Sci (13), pp.1 nh Ri Hng Yờn (Rhy) nh Mụng Ngh An (Mna) TI LIU TING C 32.Creger, C.R., (1965), "Verhọltnis der gesọttigten und ungesọttigten Fettsọuren im Hỹhnerei, DGW.(17),pp.231 33 Hartfiel, W (1968), "Einfluss der Musketọgtickeit, des Alters und des ceschlechts auf die Fettsọuenusammensetzung", Archiv.f.Gelfk (32), pp45 -52 34 Krax Herber (1974), Geflỹgelproduktion,Verlag Paul Parey Hamburg und Berline, nh Sao dũng trung (Sdt) pp 166 -196 35.Pingel, H., H Jeroch (1980), Biologische Grundlagen der industriellen Geflỹgelproduktion, VEB Gỳtav Fis cher Vlag Jena, pp.119 - 150 nh Trng g Ri Trng g Mụng Trng g Sao 36.Vogt, H (1969), Merkblat Japanische Wachteln 37.http//www.ncbi.nlm.nih.gov/ S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... sao chộp v cỏc promoter phiờn mó ca DNA ty th Vi c trng tớch ly cỏc t bin cao gp 5-10 ln so vi cỏc gen khỏc trong ty th v so vi DNA trong nhõn, D-loop tr thnh vựng ý ngha quan trng trong nghiờn cu a dng sinh hc v s phỏt sinh chng loi ca sinh vt Vỡ th, ỏnh giỏ tớnh a dng di truyn ca cỏc cỏ th g thuc 3 ging Ri, Mụng, Sao, chỳng tụi chn trỡnh t nuleotide ca vựng D-loop nh mt cụng c nghiờn cu S húa bi Trung... iu khin D-loop ty th g Ri, g Mụng v g Sao Tp chớ Khoa hc v Cụng ngh i ngh sinh hc, HQG H Ni, trng HKHTN 3 ch Th Kim Hng (2006), Phõn nh mt s chng g nh (gallus gallus domesticus)qua AND ty th, Khúa lun tt nghip, Trng HKH t nhiờn, H Ni 4 Lờ c Long (2007), Nghiờn cu kh nng sinh trng, thnh phn húa sinh tht v ỏnh giỏ s sai khỏc di truyn ca g Mụng nuụi ti Thỏi Nguyờn, Lun vn thc s sinh hc, trng HSP Thỏi... ca cỏc dung dch tỏch chit plasmid: - Dung dch I (Sol I): Glucose, Tris- HCl (1M, pH8), EDTA (0,5M, pH 8) S húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 29 - Dung dch II (Sol II): SDS 10 %, NaOH 0,2M Pha mi trc khi s dng v bo qun nhit phũng Chng 3 KT QU V THO LUN 3.1 SO SNH THNH PHN HểA SINH TRNG CA 3 GING G - Dung dch III (Sol III): CH3COOK, CH3COOH (gi t 4C) Kim tra DNA... 14.2 0,49 1.43 17.24 0,51 50 40 30 20 Sao (Sdt) 10 0 L.Lũng (%) Ri (Rhy) L.Lũng trng (%) Mụng (Mna) L L/ L Ltrng L tng s (%) % Sao (Sdt) Ch tiờu so sỏnh 20.27 0,82 25 20 Hỡnh 3.3 Biu biu din hm lng lipid tng s trong trng g thớ nghim 15 Qua bng 3.3 v hỡnh 3.3 ta thy hm lng lipid lũng cao nht g 10 Sao (Sdt) v thp nht g Mụng (Mna) Theo tỏc gi Rụse [27] thỡ hai phn 5 ba lipit trong lũng l triglicerit;... mt s cụng trỡnh nghiờn cu c cụng b v nng sut phm cht, thnh phn húa sinh trng [5] Vit Nam cỏc cụng trỡnh nghiờn cu v g Sao mi ch tp vo cỏc lnh - Pereira v cng s ó tỡm c ớt nht 13 gen gi (pseudogene hay vc kh nng sinh trng, nng sut, phm cht tht, thnh phn húa sinh tht, Numt) trong genome ca G gallus vi kớch thc dao ng t 131 n 1733 kh nng sinh sn, nng sut trng Hin nay, cha cú cụng b no nghiờn nuleotide... trỡnh t nuleotide Do iu kin thi gian cú hn, mu g Sao (Std) trỡnh t cú nhiu C, vic c trỡnh t gp phi khú khn nờn trỡnh t D-loop ca g Sao cha y Vỡ vy chỳng tụi ch cụng b v so sỏnh kt qu hai mu Mna v Rhy So sỏnh cỏc trỡnh t Mna v Rhy vi nhau v vi trỡnh t D-loop ca g gallus gallus gc Nht Bn (Mó s AB268515) c cụng b trờn Ngõn hng trỡnh t gen quc t EMBL (EBI)/GenBank/DDBJ [37], chỳng tụi thu c kt qu hỡnh 3.9... 0.9934 0.9892 KT LUN V NGH Trờn c s bc u nghiờn cu thnh phn húa sinh trng ca 3 ging g Ati 0.0124 0.0083 0.0074 0.0066 0.0000 0.9876 Ri, g Mụng, g Sao v phõn tớch trỡnh t on D-Loop ca 2 mu ging g LPh 0.0033 0.0108 0.0099 0.0108 0.0124 0.0000 gc Vit Nam g Ri, g Mụng Chỳng tụi rỳt ra mt s kt lun v ngh sau: Kt lun H s khỏc nhau Qua bng 3.6 v so sỏnh sai khỏc trờn trỡnh t gen cho thy s sai khỏc trỡnh t nucleotide... , thp nht g Sao 29.67% T l vt cht khụ: trng g Sao t cao nht 55,09%; trng g Ri thp nht 50,34% 2 Hm lng L tng s v hm lng protein tng s trng 3 ging g: Hm lng lipid tng s cao nht g Ri (37.76%); thp nht g Mụng Ngh An (34.33%) Hm lng protein tng s Cao nht trng g Sao v thp nht trng g Mụng (14,63%) c bit lũng trng g Sao hm lng protein v hm lng lipit rt cao (20,27%; 64,67%) cho nờn trng g Sao c ỏnh giỏ... en - G Sao dũng trung (Sdt): Lụng xỏm en im cỏc m trng trũn nh Cỏc ging g trờn c nuụi th nghim trong tri ging g ca trng n nay, cha cú cụng b v trỡnh t vựng D-loop g Ri v g Sao Trong HNL Thỏi Nguyờn theo d ỏn g sch phm vi ti, chỳng tụi tip tc so sỏnh thnh phn húa sinh trng qua hm 2.2 HểA CHT V THIT B lng protein, lipit, vt cht khụ v xỏc nh trỡnh t vựng iu khin D-loop 2.2.1 Húa cht ty th ca ba mu ging... húa bi Trung tõm Hc liu i hc Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn 34 35 3.2 NH GI A DNG DI TRUYN CA BA MU GING G mụi trng Thnh phn EDTA s liờn kt vi cỏc ion Mg2+, nh vy m hot tỡm hiu s khỏc bit mc phõn t gia cỏc cỏ th thuc ba ging ng ca cỏc nuclease b c ch Nh vy, c SDS v EDTA u tham gia g Ri, Mụng, Sao chỳng tụi tin hnh tỏch chit DNA tng s ca chỳng, bo v DNA khi s phõn gii ca cỏc nuclease Ngoi ra,