Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM 

VŨ THỊ NHƯ TRANG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY

THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, 2009

Trang 2

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM 

VŨ THỊ NHƯ TRANG

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHOLESTEROL TRONG TRỨNG VÀ SO SÁNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP DNA TY THỂ CỦA

GÀ RI, GÀ ÁC, GÀ TRE

Chuyên ngành : SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học : PGS TS Nguyễn Trọng lạng

THÁI NGUYÊN, 2009

Trang 3

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các kết quả, số liệu nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả luận văn

Vũ Thị Nhƣ Trang

Trang 4

LỜI CẢM ƠN

Tác giả chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của PGS TS Nguyễn Trọng Lạng trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này

Tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , phòng thí nghiệm của Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam, phòng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và một số gia đình ở Cao Thượng - Tân Yên - Bắc Giang đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tình trong việc nghiên cứu t hực nghiệm của đề tài

Cuối cùng tác giả xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban giám hiệu, Khoa Sau đại học , Ban chủ nhiệm Khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành bản luận văn này

Tác giả

Vũ Thị Nhƣ Trang

Trang 5

Nhƣ̃ng tƣ̀ viết tắt

EDTA Ethylene diamine tetra – acetic acid

Trang 6

Danh mục các bảng

2.1 Kết quả c hiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau

20

3.1 Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu

32

3.2 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33

3.3 Các điểm nucleotide khác biệt giữa 2 mẫu gà Ác và Tre so với gà Ri

43

3.4 Thống kê các điểm đa hình ở 3 mẫu gà nghiên cứu so với

gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078

43

3.5 Hệ số tương đồng về tr ình tự nucleotide vùng D -loop ở mẫu nghiên cứu với một số mẫu trên GenBank

45

Trang 7

Danh mục các hình

1.2 Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus 12 2.1 Đường chuẩn cholesterol dựa theo diện tích các peak

3.4 So sánh trình tự đoạn D -loop của 3 mẫu gà Ri, Ác, Tre

với gà Gallus gallus gallus mã số NC 007236 và gà Gallus gallus gốc Nhật mã số AB114078

41

3.5 Quan hệ di truyền của một số giống gà 46

Trang 8

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm 3

1.1.1 Gà Á 4

1.1.2 Gà Ri 5

1.1.3 Gà Tre 6

1.2 Cholesterol 6

1.2.1 Tính trạng chất lượng cholesterol của trứng gà 6

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người 7

1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể 7

1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường 8

1.3 Đặc điểm DNA ty thể 10

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể 10

1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể 11

1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà 12

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam 14

1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới 14

1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam 16

Trang 9

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu 18

2.1.1 Nguồn gốc mẫu 18

2.1.2 Địa điểm thí nghiệm 18

2.2 Hoá chất và thiết bị 18

2.2.1 Hóa chất 18

2.2.2 Thiết bị sử dụng 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol 19

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử 22

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật 22

2.3.2.2 Kỹ thuật điện di DNA trên gel agarose 25

2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D- loop bằng kỹ thuật PCR 26

2.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR 29

2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA 31

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 31

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN3.1 Hàm lượng cholesterol trong trứng của các mẫu nghiên cứu 33

3.2 Xác định trình tự nucleotide của vùng D-loop và đánh giá đa dạng di truyền của 3 mẫu gà nghiên cứu 35

3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 35

3.2.2 Nhân vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể 36

3.2.3 Xác định trình tự vùng điều khiển D-loop của DNA ty thể 37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1 Kết luận 48

2 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 54

Trang 10

Mở đầu 1 Đặt vấn đề

Hiện nay, ngành chăn nuôi có những bước phát triển mạnh mẽ với xu hướng chăn nuôi theo con đường công nghiệp hoá Đặc biệt, ngành chăn nuôi gia cầm đang được quan tâm hàng đầu vì nó có khả năng cung cấp một lượng lớn sản phẩm trứng, thịt giàu chất dinh dưỡng, dễ chế biến và phù hợp với nhu cầu của tuyệt đại đa số người dân

Sự phát triển nhanh chóng của ngành chăn nuôi gia cầm trên thế giới đã tác động đến ngành chăn nuôi gia cầm ở nước ta về cơ cấu, quy mô, loại hình chăn nuôi Số đàn gia cầm có số lượng lớn và cơ sở chăn nuôi tập trung với quy mô lớn tăng lên Một số giống gà nước ta có nhiều ưu điểm như phẩm chất thịt, trứng thơm ngon, giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng thích nghi cao với nhiều điều kiện sống của địa phương, chống chịu tốt với điều kiện khí hậu khắc nghiệt

Trong những năm gần đây, xã hội ngày càng phát triển, đời sống vật chất và tinh thần của con người được nâng cao Chất lượng bữa ăn trong gia đình đã được cải thiện rất nhiều Cũng chính vì lí do đó, hiện nay con người đã mắc rất nhiều bệnh khác nhau Trong đó, một trong những bệnh điển hình khi chất lượng bữa ăn nâng cao đó là bệnh về tim mạch, xơ vỡ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não Những bệnh đó chiếm khoảng 25% tổng số nguyên nhân tử vong ở các nước phát triển thuộc thế giới tây phương Có nhiều nguyên nhân k hác nhau dẫn tới nhưng căn bệnh như trên , nhưng một nguyên nhân rất quan trọng đó là do hàm lượng cholesterol trong cơ thể cao Khi chế độ ăn uống thay đổi thì hàm lượng cholesterol cũng thay đổi theo Những nguồn thực phẩm giàu cholesterol đó là những loại thức ăn có nguồn gốc động vật nhất là bầu dục, não, tim, lòng đỏ trứng Do sở thích và tình hình kinh tế, nhiều người rất

Trang 11

thích ăn trứng gà và coi đó là nguồn thực phẩm chính trong gia đình Trong trứng, đặc biệt là lòng đỏ có hàm lượng cholesterol rất cao Có nhiều loại trứng khác nhau như trứng gà, trứng chim, trứng vịt Mỗi giống gà khác nhau thì trứng có hàm lượng cholesterol cũng khác nhau Như vậy việc lựa chọn loại trứng vừa đảm bảo dinh dưỡng vừa đáp ứng nhu cầu, sở thích của mỗi cá nhân mà vẫn bảo vệ sức khoẻ là rất quan trọng

Đồng thời cùng với sự phát triển của kĩ thuật sinh học phân tử, chúng tôi muốn xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên cứu trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của các giống gà đó

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài : “ Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của gà Ri, gà Tre, gà Ác nuôi tại Bắc Giang”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng của 3 giống gà

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop DNA ty thể của 3 giống gà

- Đánh giá quan hệ di truyền giữa các giống gà

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định hàm lượng cholesterol trong trứng gà Ri, gà Ác, gà Tre

- Xác định và so sánh trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của gà Ri, gà Ác, gà Tre

+ Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên + Nhân vùng D-loop bằng kĩ thuật PCR

+ Xác định trình tự vùng D-loop và so sánh trình tự đó giữa 3 giống gà trên

- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu với một số giống gà đã được công bố trình tự vùng D-loop

Trang 12

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc gia cầm

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết

luận rằng: gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus Gà

rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa Cơ sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về đặc điểm hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập tính hoạt động

Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu:

Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn

Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ

Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu đỏ, mỏ tương đối ngắn

Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay

Theo Nguyễn Ân (1983) [1], vị trí của gà nhà được sắp xếp trong hệ thống giới động vật như sau:

Giới động vật (Animal)

Ngành động vật có xương sống (Chordata) Lớp chim (Aves)

Bộ gà (Galliformes) Họ Trĩ (Fasianidea)

Chủng Gallus (giống gà Bankip )

Loài Gallus gallus

Trang 13

Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba Tư Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước Anh, sau đó là Mỹ, các giống gà này được lai tạo thành nhiều giống gà có năng suất cao hơn

Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo, gà Vàng …

1.1.1 Gà Ác

Gà Ác có tên khoa học là Gallus domestices brisson Đây là loại gà cỡ

nhỏ đặc biệt được thuần hoá và nuôi dưỡng như các giống gà khác, lông trắng mượt, toàn bộ da, mắt, thịt và xương, nội tạng đều đen, chân đen có 5 ngón

Trước đây, gà Ác được nuôi chủ yếu ở đồng bằng sông Cửu Long và miền tây Nam Bộ vì mặc dù là giống gà được coi là vị thuốc quý có thể chữa nhiều bệnh, nhưng không ai dám nuôi tràn lan vì khả năng cho thịt thấp mà giá thành lại cao Nhưng cuộc sống ngày càng đi lên, những đặc sản quý mới được biết hết giá trị của nó Gà Ác đã được nuôi nhiều ở miền Trung và miền Bắc như Nghệ An, Hải Phòng, Bắc Ninh, Bắc Giang, Đông Anh, Hưng Yên Lúc này thì người nuôi mới thấy rằng đây là giống gà nhanh nhẹn, chăm chỉ chịu khó nhặt nhạnh kiếm mồi, chịu lạnh tốt và có sức sống cao Như thế có thể nuôi được cả quảng canh (nuôi chăn thả) hay nuôi thâm canh (nuôi chuồng) đều được cả Phân tích dưới góc độ khoa học, thịt gà Ác rất giàu axit amin, nhiều canxi, photpho, sắt, protit, lipit Trứng của chúng tuy nhỏ (chỉ khoảng 29-30 g) nhưng tỉ lệ lòng đỏ lại rất cao, đến 34,2% [12]

Theo y học cổ truyền, thịt và xương gà Ác có vị ngọt, tính ấm, không độc, có tác dụng bổ dưỡng cao Thịt gà Ác đặc trị các bệnh về phổi, thận, đau

Trang 14

lưng, ra mồ hôi trộm, chân tay yếu mỏi, tạng yếu, rất tốt cho người ốm dậy và sau khi sinh

Người ta đã thụ tinh nhân tạo thành công trên gà Ác để tạo ra giống gà cho nhiều trứng trong thời gian sớm nhất Theo PGS.TS Trịnh Công Thành, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, đây là lần đầu tiên người ta áp dụng biện pháp thụ tinh nhân tạo trên giống gà Ác giữa dòng gà Ác có lông chân và dòng gà Ác không có lông chân Kết quả, qua 5 thế hệ chọn lọc và tạo dòng, nhóm nghiên cứu đã tạo ra 2 dòng gà Ác mới là gà Ác có lông chân và gà Ác không có lông chân cho sản lượng trứng cao (38/100 con cho trứng) mà trước kia là 29/100 con cho trứng)

1.1.2 Gà Ri

Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta chiếm 70% tổng số gà

trong nước, có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus Bankiva hay Gallus gallus Gà có ngoại hình thon, nhỏ, mỏ nhỏ, mào cờ có răng cưa, mào đỏ tươi

rất phát triển ở con trống; dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng Cổ thanh dài vừa phải, ngực lép, bụng thon, mềm, chân có hai hàng vải màu vàng có khi xen lẫn màu đỏ tươi Bàn chân có 4 ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống Màu lông khác nhau ở con mái và con trống Con mái có màu lông màu vàng rơm, vàng đất, nâu nhạt và đốm Con trống có màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh và lông đuôi, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất Ngoài ra còn có màu lông khác như lông trắng, hoa mơ, đốm trắng

Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh Gà Ri đẻ trứng sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi Sản lượng trứng của gà mái trong một năm từ 80-120 quả Khối lượng trứng bình quân là 38 – 42 g Gà Ri có khối lượng cơ thể ở tuổi trưởng thành như sau: con trống từ 1,800 g đến 2,500 g, con mái từ 1,300 g đến 1,800 g

Trang 15

Đây là giống gà thích hợp với khí hậu và điều kiện chăn nuôi quảng canh ở nước ta Gà chịu khó kiếm ăn khi nuôi trong điều kiện chăn thả trong vườn hay ngoài đồng Hàng ngày người nuôi chỉ phải cho ăn rất ít, một vài nắm thóc vãi cho cả đàn khi gọi chúng về chuồng, ngoài ra chúng tự kiếm đủ khi được thả ngoài vườn [4], [7], [8]

1.1.3 Gà Tre

Là giống gà địa phương được nuôi ở một số tỉnh Nam Bộ ở Việt Nam Kích thước của gà nhỏ con, gà trống có lông màu trắng, đuôi và cổ đen Gà mái màu vàng, thấp chân Gà trống và gà mái nhỏ hơn gà Ri Gà Tre có tập tính là hay bay và đậu trên hàng rào Người nuôi chủ yếu là nuôi làm cảnh Trong những năm gần đây, nhà nước có nhiều dự án nhằm gìn giữ và bảo tồn quỹ gen của các loại gia cầm của nước ta

1.2 Cholesterol

1.2.1 Tính trạng chất lƣợng cholesterol của trứng gà

Cholesterol là chất béo steroid, nó kém tan trong nước nhưng tan nhiều trong mỡ và có thể tạo este với axit béo, nó không thể tan và không di chuyển ở dạng tự do ở trong máu Cholesterol có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.1 Cấu trúc hoá học của cholesterol

Nhìn vào công thức cấu tạo ta thấy, cấu trúc cơ bản của cholesterol là nhân sterol được tổng hợp từ các phân tử axetyl - CoA và một phần phân tử của cholesterol là rượi cồn (alcohol) Cholesterol có ở nhiều loại thực phẩm

Trang 16

khác nhau như nội tạng động vật: tim, gan và đặc biệt trứng gà là loại thực phẩm có chứa nhiều cholesterol, trong đó chủ yếu là lòng đỏ trứng gà còn lòng trắng thì tuyệt nhiên không có hoặc rất ít [15], [18], [28].

1.2.2 Nhu cầu cholesterol ở người

Cholesterol là chất béo steroid rất cần thiết cho cơ thể, có ở màng tế bào của tất cả các mô trong cơ thể và được vận chuyển trong huyết tương của mọi động vật cũng như cơ thể người Cholesterol trong cơ thể người có 2 nguồn gốc:

- Cholesterol hấp thụ qua đường tiêu hoá (cholesterol từ thức ăn) hay còn gọi là cholesterol ngoại sinh (exogenous cholesterol)

- Cholesterol hình thành trong tế bào hay cholesterol nội sinh (endogenous cholesterol) và chủ yếu được hình thành từ gan [15], [28]

Tuy vậy, tất cả các tế bào trong cơ thể có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ cholesterol Chất này tham gia hình thành cấu trúc tế bào Khi lượng cholesterol hấp thu qua đường tiêu hoá tăng sẽ dẫn đến tăng nhẹ nồng độ cholesterol huyết tương Tuy nhiên, khi lượng cholesterol hấp thụ tăng sẽ ức chế một trong những enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp cholesterol nội sinh Đây là một yếu tố trong cơ chế điều hoà ngược để điều chỉnh nồng độ cholesterol trong máu Chính vì vậy nồng độ cholesterol trong máu dao động khoảng 15% do ảnh hưởng của cholesterol trong thức ăn Sự thay đổi lớn của hàm lượng cholesterol trong khẩu phần có thể dẫn đến làm thay đổi nồng độ cholesterol trong máu tới 30% Đồng thời các chất béo bão hoà trong khẩu phần ăn cũng làm tăng cholesterol từ 15 - 25%

1.2.3 Vai trò cholesterol trong cơ thể

Khoảng 80% lượng cholesterol trong cơ thể được chuyển thành cholic axit tại gan Cholic axit sẽ kết hợp với các thành phần khác hình thành muối mật có tác dụng xúc tác trong quá trình tiêu hoá và hấp thụ các chất béo

Trang 17

- Một tỷ lệ nhỏ cholesterol được sử dụng theo các con đường:

+ Được tuyến thượng thận sử dụng để tổng hợp hormon vỏ tuyến thượng thận

+ Hình thành estrogen và progesterol tại buồng trứng + Được dịch hoàn sử dụng để tổng hợp testostereone + Cholesterol tham gia cấu trúc màng tế bào

+ Một lượng nhỏ cholesterol có mặt tại biểu bì của da Cùng với các chất béo khác, cholesterol tạo cho da các chức năng:

+) Kháng lại việc hấp thu các chất hoà tan trong nước +) Kháng tác động của nhiều hoá chất

+) Ngăn cản quá trình bốc hơi nước của da [15],[19], [28]

Như vậy cholesterol có vai trò rất quan trọng trong cơ thể khi hàm lượng của nó trong cơ thể ở mức phù hợp Ở người trưởng thành, cholesterol toàn phần ở mức bình thường vào khoảng 4-5,6 mmol/lít Những người có mức cholesterol cao hơn mức này sẽ dẫn đến nhiều bệnh khác nhau

1.2.4 Tác hại cholesterol trong cơ thể khi vượt quá mức bình thường

Người ta thấy rằng, cholesterol là nguyên nhân gây nên các bệnh tim mạch, xơ động mạch, huyết áp cao, thiểu năng mạch vành, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não Trên thế giới cũng như ở nước ta, các bệnh về tim mạch ngày càng tăng và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở nhiều nước Đàn ông có nguy cơ bị bệnh tim cao hơn đàn bà Ở Mỹ, hàng năm có khoảng 6 triệu người bị bệnh tim và trong số này có khoảng 1,5 triệu bị đau tim và trong số này có khoảng 1/3 bị chết Khoảng 1/5 trong số các trường hợp đau tim không hề có triệu trứng hay cảnh báo trước Tần suất đàn ông Mỹ bị chết vì bệnh tim là khoảng 200/100.000 dân số Ở Anh, tỉ suất này là khoảng 250/100.000 dân số [16], [21]

*Cơ chế gây bệnh xơ vữa động mạch của cholesterol

Trang 18

Xơ vữa thành mạch (xơ vữa động mạch) là hiện tượng bệnh lý của lớp nội mạc động mạch, đặc biệt là các động mạch lớn dẫn đến sự hình thành các mảnh có nguồn gốc chất béo, phá vỡ cấu trúc thành mạch, làm hẹp mạch máu và ngăn cản sự lưu thông của dòng máu Các biểu hiện bệnh lý trong giai đoạn đầu là tổn thương các tế bào nội mạc và lớp tế bào dưới nội mạc Sự tổn thương thành mạch còn có thể do tác động cơ học của dòng máu và áp lực của động mạch nên vùng tổn thương

Khi có hiện tượng tổn thương, các tế bào nội mạc sẽ giãn, sưng, phân chia Các tế bào cơ trơn thành mạch cũng có thể có phản ứng tương tự Tại thành mạch máu có hiện tượng tập trung nhiều tế bào do sự di chuyển của các tế bào bình thường đến vùng tổn thương Ngay sau đó, các thành phần lipit trong máu, đặc biệt là cholesterol sẽ tích tụ lại trong các tế bào đang phân chia, hình thành các mảnh xơ Vì các mảnh này chứa một lượng lớn cholesterol nên chúng thường được gọi là chất cholesterol lắng đọng

Tiếp theo sau của quá trình bệnh lý , các tế bào xơ xâm nhập vùng tổn thương và hình thành các mảnh xơ trong mạch máu

Tiếp theo là quá trình lắng đọng canxi làm canxi hoá các mảnh xơ Đến giai đoạn này, các tổ chức mạch vùng tổn thương trở nên cứng nên được mô tả bởi từ “xơ cứng động mạch” hoặc gọi đơn giản hơn là “hiện tượng cứng mạch máu”

Các động mạch bị xơ cứng gần như mất hoàn toàn khả năng tăng kích thước (mất khả năng căng phồng) và dễ bị làm rách, làm thủng Các phần tử mảnh xơ (có bề mặt thô nhám) có thể di chuyển theo dòng máu dẫn đến nguy cơ hình thành các cục máu và huyết khối Khi các huyết khối có mặt trong động mạch vành của tim hay các động mạch của não sẽ dẫn đến tắc động mạch, rối loạn hoạt động của tim, não và gây tổn thương nặng nề cho cơ thể thậm chí gây tử vong Các ảnh hưởng tương tự cũng có thể xảy ra khi huyết

Trang 19

khối hình thành trong động mạch gan, động mạch thận, động mạch các chi, động mạch dạ dày, ruột [16], [21]

*Biện pháp điều chỉnh cholesterol trong máu

Để giảm hàm lượng cholesterol trong máu có nhiều biện pháp khác nhau như sử dụng các loại thuốc có chứa chất Simvastatine và chất Ezetimibe hay các loại thuốc có chứa Statin Nhưng một biện pháp hữu hiệu để điều chỉnh cholesterol trong máu là bằng chế độ ăn uống hợp lý

Do sở thích và sự thiếu hiểu biết về thành phần dinh dưỡng của các loại thực phẩm, một số người thường xuyên sử dụng một số lượng lớn các thực phẩm có chứa nhiều cholesterol như óc, gan, các loại thịt có chứa nhiều chất béo (thịt heo, gà, vịt, cá) và đặc biệt là trứng Có những người ăn thường xuyên một lượng lớn trứng trong một thời gian dài mà không biết tới hậu quả mà nó sẽ gây ra Trứng là thức ăn rất bổ dưỡng cho cơ thể Tuy nhiên, chúng ta chỉ nên ăn với một lượng hợp lý để góp phần đề phòng và giảm lượng cholesterol trong máu để tránh các bệnh về tim mạch

1.3 Đặc điểm DNA ty thể

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc và trình tự của DNA ty thể

DNA ty thể (mtDNA) ở dạng chuỗi kép, trần, mạch vòng Kích thước của bộ gen ty thể thay đổi khác nhau ở mức phân loại Bộ trở lên

Ở tế bào động vật kích thước của mtDNA nhỏ, cho tới nay đã xác định được trình tự đầy đủ của bộ gen ty thể người, chuột, bò, tất cả đều có kích thước khoảng 16,5 kb Mỗi tế bào có vào khoảng vài trăm ty thể Mỗi ty thể có nhiều bản sao của DNA Nấm men có kích thước bộ gen ty thể khoảng 84 kb (ở S.cerevisiae), trong đó rất nhiều vùng không mang intron dài xen kẽ giữa các vùng exon Ở thực vật thì có sự biến động rất lớn về kích thước bộ gen ty thể, mtDNA của thực vật có kích thước tối thiểu khoảng 100 kb Chức

Trang 20

năng của những vùng DNA được tăng thêm này chưa được xác định rõ ràng, nhưng dường như chúng chỉ là những vùng không mã hoá

Kích thước của mtDNA ở động vật rất nhỏ nhưng tổ chức lại rất chặt chẽ mtDNA ở động vật không có vùng intron, có một số gen gối lên nhau và hầu hết mỗi cặp bazơ đều có thể nằm trong một gen nào đó ngoại trừ vùng D-loop D-loop là vùng điều khiển của mtDNA trên đó có các promotor của quá trình sao chép và phiên mã của mtDNA [25]

1.3.2 Ý nghĩa về mặt tiến hoá của DNA ty thể

DNA ty thể là vật chất di truyền nằm ngoài nhân di truyền theo dòng mẹ Ở hầu hết động vật có xương sống bộ gen này có chiều dài khoảng 16800 nucleotid, trong đó bao gồm những gen mã hoá protein, gen tRNA, gen rRNA và vùng điều khiển – vùng không mã hoá duy nhất với các promoter để tái bản và phiên mã mtDNA DNA ty thể có những đặc tính đáng quan tâm như sau:

(1) Tỷ lệ tiến hoá phân tử của chúng nhanh hơn khoảng 5 lần so với bất kỳ một gen nhân nào

(2) mtDNA là một phân tử đơn bội mà không tái tổ hợp

Vùng điều khiển mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5 – 10 lần so với các gen khác của mtDNA Trình tự nucleotide của vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29]

1.4 Đặc điểm cấu trúc và di truyền hệ gen ty thể gà

* Đặc điểm cấu trúc ty thể gà

Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp, chúng mã hóa cho 13

protein, 2 rRNA và 22 tRNA (trình tự này đã được lưu trữ GenBank) Các

Trang 21

protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoril hóa trong ty thể Gen ty thể gà có các đặc điểm riêng, khác với lớp thú và lưỡng cư đó là: một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa hai gen tRNA (Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả động vật có xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà lại không có đặc điểm này Đồng thời gen COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì ATG

Trình tự đầy đủ này của hệ gene ty thể gà nhà là cơ sở cho nhiều công trình nghiên cứu về DNA ty thể của các giống, các loài thuộc bộ gà (Galliormes) Toàn bộ DNA ty thể gà nhà được lập thành sơ đồ như sau:

Hình 1.2 Bản đồ gen mtDNA của gà nhà Gallus gallus

(Desjadins và Morais, 1990) ND: NADH đehidrogenaza

CO: cytocrom oxidaza

H (Heavy strand): chuỗi nặng L (Light strand): chuỗi nhẹ

Trang 22

* Đặc điểm di truyền của ty thể: Di truyền ty thể là di truyền theo

dòng mẹ Trong thực tế có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ tế bào mẹ Đó là do bào quan này nằm trong tế bào chất, khi có sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng tạo thành hợp tử (tế bào con) thì tế bào con nhận chủ yếu tế bào chất từ trứng của mẹ, trong đó có chứa ty thể, còn ty thể của tinh trùng khi tham gia thụ tinh được loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc vào ubiquitin Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt hai dòng ty thể của cả bố và mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này gọi là dị tế bào chất DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp Tốc độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể là do ty thể thiếu hụt cơ chế sửa chữa DNA Tốc độ đột biến cao dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể Đặc biệt là vùng điều khiển D-loop của mtDNA là vùng tiến hoá nhanh nhất của mtDNA: chúng tích luỹ các đột biến với tỷ lệ cao hơn gấp 5–10 lần so với các gen khác của mtDNA Trình tự nucleotit của vùng điều khiển mtDNA là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hướng tiến hoá bên trong và giữa các quần thể cùng loài [29]

* Vai trò vùng D-loop trong phân loại gà

Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn: đoạn I, II và III Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III Chính điều này đã làm cho vùng điều khiển của mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần so với các gen khác của ty thể Vì vậy mà trình tự nucleotid của vùng D-loop là công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể cùng loài

1.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới và ở Việt Nam

Trang 23

1.5.1 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới ngành chăn nuôi gia cầm phát triển nhanh cả về số lượng và chất lượng Mỹ là nước đi đầu thế giới về ngành chăn nuôi gia cầm, đặc biệt trong lĩnh vực tạo ra những giống gà cơ bản Sau Mỹ là Pháp, Trung Quốc, Anh, Đức, Hà Lan… Ở các nước Đông Âu, chăn nuôi gia cầm cũng phát triển, điển hình là Hungari và Bungari

Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà: Năm 1990, Desjadins và Morais [17] đã công bố trình tự đầy đủ của

mtDNA của gà nhà (Gallus gallus) gồm 16775 bp Với trình tự này, các nhà

khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các đối tượng thuộc bộ gà

Năm 1994-1995, Fumihito và cộng sự [20] đã nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, dựa trên phân tích đoạn điều khiển ty thể Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400 nucleotid đầu tiên trên vùng điều khiển của mtDNA Kết quả nhận được đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60 nucleotide trên vùng điều khiển của

mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus

Randi và cộng sự (1997) [29] đã phân tích trình tự của một phần đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam và đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa hai giống này

Năm 1999, Kimball và cộng sự [23] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ của gen cytocrom b (1143bp) và đoạn siêu biến (350bp) của vùng điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô Hai cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạn gen cho thấy sự khác nhau là rất ít

Trang 24

Zhang và đồng tác giả (2002) [31] đã giải trình tự 539 nucleotid đầu

tiên trong vùng D-loop của sáu chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố

trên ngân hàng gen quốc tế Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa trên trình tự vùng D-loop

Komiyama T và đồng tác giả (2004) [24] đã tiến hành phân tích trình tự vùng D-loop ty thể từ máu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa phương của Nhật Bản, đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ (Jungle Fowl) đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế làm nhóm ngoại Trên cơ sở đó họ đã lập được cây phát sinh và kết quả cho thấy 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á Như vậy có thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài cũng như giữa các quần thể địa lý

1.5.2 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

Cho đến nay, ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng sự [11] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà Lôi Việt Nam gồm: gà Lôi lam đuôi

trắng (L hatinhensis), Trĩ bạc (L nycthemera) và gà Lôi hông tía (L diardi)

Trang 25

Từ đó xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển D-loop của mtDNA của 3 loài gà Lôi Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà Lôi nói trên

Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà Lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS(-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop

Năm 2006, Địch Thị Kim Hương và cộng sự [5] đã xác định được trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 2 mẫu gà Ác Tiềm và Lương Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucleotide giữa 2 đại diện trên

Năm 2007, Lê Đức Long và cộng sự [6] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này

Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và cộng sự [14] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-loop của 3 giống gà Ri, gà Mông, gà Sao nuôi tại Thái Nguyên Kết quả nghiên cứu đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 16 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này

Trang 26

Chương 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Nguồn gốc mẫu

Các mẫu trứng, máu được lấy từ các giống gà Ri, gà Ác, gà Tre được nuôi tại gia đình ông Nguyễn Văn Vân , thôn Đình Giã , Cao Thượng , Tân Yên, Bắc Giang

2.1.2 Địa điểm thí nghiệm

Các nghiên cứu về cholesterol được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Khoa Hóa an toàn vệ sinh thực phẩm- Viện dinh dưỡng Việt Nam

Các thí nghiệm sinh học phân tử tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ DNA ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2 Hoá chất và thiết bị 2.2.1 Hóa chất

Các hoá chất tinh khiết sử dụng có nguồn gốc từ các nước Anh , Mỹ, Trung Quốc , Thụy Điển, Nga… như Phosphate buffer saline (PBS), protein K (20mg/ml), SDS, Tris HCl, EDTA, NaCl, CH3COONa, phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1), chloroform: isoamyl alcohol (24:1), agarose 0,8%

2.2.2 Thiết bị sử dụng

Máy li tâm lạnh của hãng Hettich (Đức), tủ sấy của hãng Carbolite (Anh), cân điện tử (Thuỵ Sỹ, Anh), máy Gerhardht, tủ lạnh sâu – 20o

C Sanyo (Nhật), lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc), máy PCR MJ Reseach, Inc (Mỹ), máy xác định trình tự tự động ABI PRISM®

3100 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Mỹ), bể ổn nhiệt (Tempette Junior Tech), hệ thống

Trang 27

sắc ký Alliance (hãng Waters, Mỹ), máy hút chân không Speed Vac Sc 110A- Savant (Mỹ), pipetman và một số máy móc thiết bị khác

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp hoá sinh xác định hàm lượng cholesterol

* Cơ sở của phương pháp: chất béo trong thực phẩm (gồm cả cholesterol)

được chiết bằng chloroform Sau khi thủy phân lipit bằng KOH trong cồn, cholesterol được chiết lại bằng petroleum ether Dịch chiết được cô cạn bằng máy cất quay chân không, sau đó được hòa tan lại bằng methanol Cholesterol trong dịch chiết methanol được định lượng trên sắc ký lỏng (HPLC) bằng cách so sánh diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol trong mẫu với diện tích (hoặc chiều cao) của pic cholesterol chuẩn (John Wiley and Sons, 2005) [22]

* Xác định hàm lượng cholesterol theo quy trình sau: Lấy ngẫu nhiên trứng

ở các giống gà thí nghiệm ở các lứa đẻ khác nhau và ở các con gà mái khác nhau trong cùng một giống Sau khi lấy được mẫu, ở mỗi mẫu: đập 5 quả

trứng vào cốc thủy tinh Sau đó đồng nhất lòng đỏ và lòng trắng Tiếp theo là

các bước:

+ Cân 0,5 g mẫu vào ống ly tâm 25 ml + Thêm 5 ml methanol, vortex 5 phút + Thêm 10 ml chloroform, vortex 3 phút + Ly tâm, gạn lấy dịch trong bình gạn 250 ml

+ Chiết lại mẫu bằng 5 ml methanol và 10 ml chloroform trong 3 phút + Gộp dịch chiết vào bình gạn

+ Thêm 7 ml KCl 0,88%, lắc nhẹ và để tách lớp

+ Lọc lớp chloroform qua phễu chứa Na2SO4 khan vào bình cô quay + Cô quay đến khô ở 300

C

+ Thêm 20 ml KOH 0,5M trong ethanol

Trang 28

+ Đun hồi lưu 30 phút trong cách thủy ở 600C

+ Thêm 10ml n- heptane, đun hồi lưu thêm 2-3 phút, để nguội đến nhiệt độ phòng

+ Chuyển toàn bộ dịch chiết sang một bình gạn, thêm 5 ml NaCL bão hòa, 10 ml nước

+ Chiết 2 lần cùng với 10 ml petroleum ether + Gộp dịch chiết và rửa 2 lần với 20 ml nước cất

+ Loại nước bằng Na2SO4 khan, cô quay ở 300C đến khô + Hòa tan và định mức 10 ml bằng methanol

+ Lọc qua màng lọc 0,45 m và bơm vào sắc kí lỏng

Cột sắc ký LunaC18 với nhiệt độ cột là 300C, tốc độ dòng là 1 ml/ phút, lượng mẫu bơm 10 l Bộ phận phát hiện (detector) đo độ hấp thụ tia UV ở bước sóng 208 nm của cholesterol chuyển thành tín hiệu ra máy tính đó là các peak, mỗi peak có độ cao và diện tích khác nhau, từ đó tính được hàm lượng cholesterol của mỗi mẫu [22]

Công thức tính hàm lượng cholesterol của mẫu nghiên cứu như sau : X =

m: khối lượng mẫu cân (g)

100: Tính hàm lượng cholesterol trong 100 g mẫu [22]

Trang 29

Như vậy, để xác định được hàm lượng cholesterol ở các mẫu thí nghiệm thì trước hết ta phải xây dựng đường chuẩn cholesterol ở các nồng độ khác nhau: 2,04 ppm, 20,4 ppm, 204 ppm, 1 mg/ml, 2,04 mg/ml Để xây dựng được đường chuẩn cholesterol thì ta phải xác định chiều cao và diện tích của các peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau đó

Kết quả về chiều cao và diện tích của peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau được thể hiện qua bảng 2.1

Bảng 2.1 Kết quả chiều cao và diện tích peak cholesterol chuẩn ở các nồng độ khác nhau

Nồng độ cholesterol (ppm)

Thời gian chạy máy (phút)

Diện tích Chiều cao

10000002000000300000040000005000000600000070000008000000

Trang 30

2.3.2 Phương pháp sinh học phân tử

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật * Nguyên tắc chung

Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh kết hợp với biện

pháp cơ học, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalcohol với tỷ lệ thích hợp Cuối cùng DNA được kết tủa bằng cồn tuyệt đối 100% và để lạnh sau đó thu lại bằng ly tâm

* Quy trình tách chiết

Một trong các mối quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết DNA là làm thế nào để giảm tối đa sự phân hủy của chúng Các phân tử DNA có thể bị phân hủy hay đứt gãy do tác nhân cơ học (nghiền, lắc mạnh) hoặc hóa học (bị thủy phân bởi các enzyme phân giải thoát ra môi trường khi màng tế bào bị phá vỡ) Để đạt hiệu suất và độ tinh sạch nhất thì việc lựa chọn một phương pháp tách chiết có nhiều ưu điểm và phù hợp với đối tượng nghiên cứu là rất quan trọng Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm là mẫu máu, nên

Trang 31

chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tách chiết DNA tổng số của Sambrook và Russell [30]

Máu đông được làm tan trong bể ổn nhiệt ở 370C trong một giờ Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian như vậy, plasminogen trong huyết tương sẽ được chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein như fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào được giải phóng Sau đó hút máu ra các eppendorf 1,5 ml rồi bổ sung đệm phosphate buffer saline (PBS) và ly tâm Dung dịch muối này có tác dụng duy trì pH của máu Các tế bào thu được đem hòa tan trong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra ngoài môi trường Thành phần EDTA sẽ liên kết với ion Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nulease bị ức chế để bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ cắt đứt các liên kết peptid trong phân tử protein làm cho protein bị phân hủy Hơn nữa pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở lên ổn định cấu trúc hơn do bản chất tích điện âm của nó, đồng thời làm giảm tương tác tĩnh điện giữa DNA với protein histon

Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được lắc mạnh với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của DNA Đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein bị biến tính và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, choloroform, isoamyl alcohol Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới Dịch chiết này sau đó được xử lý bằng hỗn

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	596,23 KB