Luận văn: NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA pdf

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––––– HỨA THỊ NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––––– HỨA THỊ NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:PGS.TS NGUYỄN TRỌNG LẠNG THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng - Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên đã hƣớng dẫn tôi tận tình, chu đáo trong quá trình tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản khóa luận này. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tôi đã đƣợc các anh chị NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hƣơng, CN Vũ Hải Chi - cán bộ nghiên cứu trong phòng quan tâm, hƣớng dẫn và cho tôi những lời khuyên quý báu. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào Tạo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Hứa Thị Nga Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Hứa Thị Nga Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT A bp cs C ddNTP dNTP DNA D-Loop EDTA EtBr EtOH Epp G Kb kDa mtDNA NXB NADH PBS PCR RNA RNase SDS T TAE Tm Adenin Base pair (cặp bazơ) Cộng sự Cytozin Dideoxynucleside triphosphate Deoxynucleside triphosphate Deoxyribonucleic acid Displacement loop - đoạn điều khiển ty thể Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Ethidium brommide Ethanol Eppendorf Guamin kilo base kilo Dalton DNA ty thể (mitochondrial DNA) Nhà xuất bản Nicotinamide adenine dinucleotide Phosphate - buffer saline Polymerase Chain Reaction Ribonucleic Acid Ribonuclease Sodium Doecyl Sulphate Timin Tris - Acetate - EDTA Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen 28 Bảng 2.2. Chu trình nhiệt 29 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 30 Bảng 3.1. Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn 41 Bảng 3.2. So sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide 42 Bảng 3.3. Thống kê sự xuất hiện các băng điện di protein huyết thanh gà thí nghiệm 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà 16 Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số 33 Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR 36 Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 40 Hình 3.4. Quan hệ di truyền của một số giống gà 42 Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh. 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 4 1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà 4 1.1.2. Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu 5 1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ 7 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 8 1.3.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máu của gia cầm 8 1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết thanh máu 10 1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật 11 1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ 12 1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể 12 1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể 13 1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty thể 14 1.4.4. MtDNA của động vật có xƣơng sống và mtDNA gà 14 1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới 17 1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam 20 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. VẬT LIỆU 22 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.1. Hóa chất 22 2.2.2. Thiết bị 23 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật 23 2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose 24 2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 25 2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR 27 2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA 29 2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ 31 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 31 3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể 33 3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể 37 3.2. THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Gần một thế kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm đƣợc cả thế giới quan tâm và phát triển mạnh cả về số lƣợng và chất lƣợng. Chăn nuôi gia cầm chiếm một vị trí quan trọng trong chƣơng trình cung cấp protein động vật cho con ngƣời. Gia cầm chiếm 20-25% trong tổng sản phẩm thịt, ở các nƣớc phát triển thịt gà chiếm tới 30% hoặc hơn thế nữa. Ở nƣớc ta ngành chăn nuôi gia cầm là một nghề sản xuất truyền thống, giữ vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất. Đàn gia cầm ở nƣớc ta phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (66%), ở các tỉnh phía Nam chiếm 34%. Đàn vịt thì ngƣợc lại phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Nam (60%) và ở miền Bắc đàn vịt chỉ chiếm khoảng 40%. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, số lƣợng đàn gia cầm của nƣớc ta đến ngày 1/8/2004 là 218,15 triệu con, tƣơng đƣơng với số đầu con năm 2001 (218,1 triệu con) thấp hơn năm 2002 ( 233,3 triệu con) và năm 2003 (254,06 triệu). Sản lƣợng thịt là 316,41 ngàn tấn, thấp hơn năm 2001 (322,6 ngàn tấn), năm 2002 (338,4 ngàn tấn) và 2003 (372,72 ngàn tấn). Sản lƣợng trứng là 3,94 tỷ quả, thấp hơn năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) và 2003 (4,85 tỷ). Nguyên nhân là do ảnh hƣởng của dịch cúm gia cầm [10].Năm 2005, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã hoàn thành việc xây dựng đề án đổi mới hệ thống chăn nuôi gia cầm ở nƣớc ta. Theo đề án, ngành chăn nuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sang sản xuất hàng hóa lớn theo hƣớng công nghiệp hóa và bán công nghiệp trên cơ sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung tại từng địa phƣơng; mục tiêu là đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khối lƣợng thịt 1000 nghìn tấn , sản lƣợng trứng 11,0 tỷ quả và tổng giá trị sản xuất chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10]. [...]... chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa" 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà - Xác định mối quan hệ di truyền của ba đại diện của ba giống gà - Phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà Số hóa bởi Trung... dung nghiên cứu - Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mô máu của gà Ri, gà Mông, và gà Đa cựa - Phân lập vùng D-Loop của hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR - Xác định trình tự vùng D-Loop và so sánh với trình tự tham khảo đã đƣợc công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế Trên cơ sở đó, đánh giá sơ bộ về sự khác biệt di truyền giữa ba đại diện của ba giống gà nói trên Từ đó cung cấp dữ liệu ban đầu... này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và đánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của trung Quốc Họ giải trình tự 539 nucleotide vùng trình tự D-Loop của 6 giống gà, so sánh với trình tự nucleotide của các giống gà G gallus, G.sonneratii, G.varius, G lafayettei lƣu giữ trong GenBank và thiết lập... đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định đƣợc 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này Năm 2008 Nguyễn Trƣờng Huy và cộng sự [5] đã xác định đƣợc trình tự 300 nucleotide đầu tiên trong đoạn D-Loop của 4 mẫu thuộc 4 giống gà: Gà Ác, gà Mía, gà Hồ và gà Mông và so sánh với trình tự tƣơng ứng trên đoạn D-Loop 2 giống gà Leghorn và gà... nhận giả thuyết cộng sinh về nguồn gốc chủng loại của ty thể Sự xuất hiện ty thể trong tế bào Eukaryota là kết quả cộng sinh của một dạng vi khuẩn hiếu khí với tế bào Dẫn chứng thuyết phục nhất là trong ty thể có chứa DNA giống DNA của vi khuẩn, riboxom của ty thể về kích thƣớc và rARN giống với riboxm vi khuẩn, và đặc biệt là cơ chế và hoạt động tổng hợp protein trong ty thể có nhiều đặc điểm giống với... định đƣợc trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA Kết quả nhận đƣợc đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm đặc trƣng của giống Gallus Randi và cộng sự (1997) [19]; Scott(1997) [24] phân tích trình tự của một phân đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-Loop) của 2 loài gà lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà... giữa ba đại diện của ba giống gà nói trên Từ đó cung cấp dữ liệu ban đầu cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền và cải tạo giống gà bằng Công nghệ gen và Công nghệ tế bào - Dùng phƣơng pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà nói trên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... sắc thể của nhân, sau đó đƣợc vận chuyển vào ty thể Ty thể tự tổng hợp một số protein không hòa tan cần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 14 cho màng trong và một số protein có chức năng điều chỉnh quá trình hoạt hóa các gen ty thể của nhân tế bào 1.4.3 Chủng loại phát sinh của ty thể Trƣớc đây có giả thuyết cho rằng trong quá trình tiến hóa của tế bào thì ty. .. gen với môi trƣờng phân tích đa hình protein huyết thanh của các giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng của các giống gà thí nghiệm, so sánh trình tự đoạn D-loop của các giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà, đó là một việc làm cần thiết nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo cơ sở cho việc lai tạo các giống mới đáp ứng đƣợc các nhu... chuyển vào chuỗi hô hấp và cuối cùng chuyển hydro cho oxy Trong chuỗi hô hấp, năng lƣợng giải phóng đƣợc tích lại dƣới dạng ATP Ty thể còn có đặc điểm là trong dịch nền của nó có những hạt DNA và ARN Ty thể đã sử dụng DNA làm khuôn mẫu để sản sinh ra ty thể mới 1.4.2 Sự tổng hợp protein trong ty thể Nhờ có đủ các nhân tố riêng của mình (mtDNA, mARN, tARN và riboxom) nên ty thể có thể tự tổng hợp các protein . ––––––––––––––––––––––––– HỨA THỊ NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC . NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC. các giống mới đáp ứng đƣợc các nhu cầu thị trƣờng hiện nay. Vì vậy chúng tôi lựa chọn đề tài: " ;Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba giống