Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa

Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học:PGS.TS NGUYỄN TRỌNG LẠNG

THÁI NGUYÊN - 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyênt nu e d u v n

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng

-Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại họcThái Nguyên đã hướng dẫn tôi tận tình, chu đáo trong quá trình tôi học tập vànghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng

dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải đã tận

tình giúp đỡ, hướng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản khóaluận này Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tôi đã được các anh chịNCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hương, CN Vũ Hải Chi - cán bộnghiên cứu trong phòng quan tâm, hướng dẫn và cho tôi những lời khuyênquý báu Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó.

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở ĐàoTạo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm, Đại học TháiNguyên.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúpđỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Tác giả luận văn

Hứa Thị Nga

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyênt nu e d u v n

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi Các sốliệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bốtrong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả luận văn

Hứa Thị Nga

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyênt nu e d u v n

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bpcsCddNTPdNTP DNAD-LoopEDTA EtBr EtOH EppG Kb kDamtDNANXB NADH PBS PCR RNA RNase SDST TAETm

Base pair (cặp bazơ)Cộng sự

Dideoxynucleside triphosphateDeoxynucleside triphosphate Deoxyribonucleic acid

Displacement loop - đoạn điều khiển ty thểEthylene Diamine Tetraacetic Acid

Ethidium brommideEthanol

Eppendorf Guamin kilo base kilo Dalton

DNA ty thể (mitochondrial DNA)Nhà xuất bản

Nicotinamide adenine dinucleotidePhosphate - buffer saline

Polymerase Chain Reaction Ribonucleic Acid

Sodium Doecyl SulphateTimin

Tris - Acetate - EDTA

Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen 28Bảng 2.2 Chu trình nhiệt 29Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCRSystem 9700 30Bảng 3.1 Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu so với trình tựchuẩn 41Bảng 3.2 So sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide 42Bảng 3.3 Thống kê sự xuất hiện các băng điện di protein huyết thanh gà thí nghiệm 45

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà 16Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số 33Hình 3.2 Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR 36Hình 3.3 So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 40Hình 3.4 Quan hệ di truyền của một số giống gà 42Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh 43

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂMCỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 4

1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà 4

1.1.2 Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu 5

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ

71.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

81.3.1 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máucủa gia cầm 8

1.3.2 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyếtthanh máu 10

1.3.3 Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật 11

1.4 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ

121.4.1 Cấu trúc và chức năng của ty thể 12

1.4.2 Sự tổng hợp protein trong ty thể 13

1.4.3 Chủng loại phát sinh của ty thể 14

1.4.4 MtDNA của động vật có xương sống và mtDNA gà 14

1.4.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới 17

1.4.6 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam 20

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 VẬT LIỆU 222.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

2.3.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật 23

2.3.2 Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose 24

2.3.3 Phương pháp điện di SDS-PAGE 25

2.3.4 Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR 27

2.3.5 Tinh sạch sản phẩm DNA 29

2.3.6 Phương pháp xác định trình tự 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ

313.1.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 31

3.1.2 Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể 33

3.1.3 Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể 37

3.2 THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Nguyênt nu e d u v n

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái

Ở nước ta ngành chăn nuôi gia cầm là một nghề sản xuất truyền thống,giữ vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất Đàn gia cầm ở nước taphân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (66%), ở cáctỉnh phía Nam chiếm 34% Đàn vịt thì ngược lại phân bố chủ yếu ở các tỉnhphía Nam (60%) và ở miền Bắc đàn vịt chỉ chiếm khoảng 40%.

Theo số liệu của Tổng cục thống kê, số lượng đàn gia cầm của nước tađến ngày 1/8/2004 là 218,15 triệu con, tương đương với số đầu con năm 2001(218,1 triệu con) thấp hơn năm 2002 ( 233,3 triệu con) và năm 2003 (254,06triệu) Sản lượng thịt là 316,41 ngàn tấn, thấp hơn năm 2001 (322,6 ngàn tấn),năm 2002 (338,4 ngàn tấn) và 2003 (372,72 ngàn tấn) Sản lượng trứng là3,94 tỷ quả, thấp hơn năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) và 2003(4,85 tỷ) Nguyên nhân là do ảnh hưởng của dịch cúm gia cầm [10].Năm2005, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã hoàn thành việc xây dựng đềán đổi mới hệ thống chăn nuôi gia cầm ở nước ta Theo đề án, ngành chănnuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sangsản xuất hàng hóa lớn theo hướng công nghiệp hóa và bán công nghiệp trêncơ sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung tại từng địa phương;mục tiêu là đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khốilượng thịt 1000 nghìn tấn , sản lượng trứng 11,0 tỷ quả và tổng giá trị sản xuấtchăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10].

Hiện nay 75-80% chăn nuôi gà ở nước ta là sử dụng các giống địaphương, nuôi gà chăn thả với các giống truyền thống địa phương cũng khôngngừng phát triển và hiệu quả ngày càng tăng bởi các giống địa phương đãđược đầu tư để bảo tồn quỹ gen nhằm chọn lọc nâng cao năng suất Các giốnggà nội của ta mặc dù có hạn chế về năng suất, nhưng khả năng thích ứng vớiđiều kiện chăn nuôi Việt Nam cao, phẩm chất trứng thịt tốt đặc biệt là một sốgiống gà còn có giá trị dược liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe của conngười Gà Ri của ta, gà của người H'Mông là một trong những giống gà cóphẩm chất quý đó.Và một giống gà hiện được rất nhiều người quan tâm vềphẩm chất, tác dụng của nó đó là gà Đa cựa.

Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi dựa vào những đặc điểmhình thái còn dựa vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh hóa Các đặc tính nàychịu sự kiểm soát bởi các gen, thuộc hệ gen của cơ thể sinh vật và sự tươngtác giữa các gen với môi trường phân tích đa hình protein huyết thanh củacác giống gà để thấy được chất lượng của các giống gà thí nghiệm, so sánhtrình tự đoạn D-loop của các giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác địnhmối quan hệ di truyền giữa các giống gà, đó là một việc làm cần thiết nhằmcung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo cơ sở cho việclai tạo các giống mới đáp ứng được các nhu cầu thị trường hiện nay Vì vậychúng tôi lựa chọn đề tài:

"Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều

khiển D-loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa"

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà.- Xác định mối quan hệ di truyền của ba đại diện của ba giống gà.- Phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà.

3 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mô máu của gà Ri, gà Mông,và gà Đa cựa.

- Phân lập vùng D-Loop của hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR.

- Xác định trình tự vùng D-Loop và so sánh với trình tự tham khảo đãđược công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế.

Trên cơ sở đó, đánh giá sơ bộ về sự khác biệt di truyền giữa ba đạidiện của ba giống gà nói trên Từ đó cung cấp dữ liệu ban đầu cho cácnghiên cứu về đa dạng di truyền và cải tạo giống gà bằng Công nghệ genvà Công nghệ tế bào.

- Dùng phương pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện củaba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của bagiống gà nói trên.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU

1.1.1 Sơ lược về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà

Các giống gà hiện nay được hình thành từ quá trình lai tạo, tiến hóa lâudài và phức tạp của 4 loại hình sau của gà rừng.

- Gallus Bankiva: Phân bố ở Miến Điện, Đông Dương vàPhilippin.

- Gallus Soneratii: Phân bố ở Tây và Nam Ấn Độ.- Gallus Lafazetti: Phân bố ở Sri Lanca.

- Gallus Varius: Phân bố ở Inđônêxia.

Ở các vùng thung lũng sông Ấn, sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà diễnra ở thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm trước Công nguyên (CN) Vàokhoảng 2000 năm trước CN gà được đưa sang Trung Quốc Sau đó gà phânbố ở Hy Lạp, ở đây gà vừa là con vật để làm cảnh, tế lễ, và giải trí (chọi gà).Thông qua người Hy Lạp có mối quan hệ buôn bán rộng rãi mà gà được đưasang các nước thuộc miền Địa Trung Hải và giữa Châu Âu Đến thế kỉ I gànuôi đã được phân bố rộng rãi ở Trung Âu và Đông Âu.

Dẫn theo Nguyễn Đình Ân và nhiều tác giả, trong hệ thống phân loạisinh giới, gà nhà có vị trí phân loại như sau:

Giới Động vật (Animalia)

Nghành Động vật có xương sống (Chordata)Lớp Chim (Aves)

Bộ Gà (Galliformes)Họ Trĩ (Phasianidae)Giống Gallus

Loài Gallus gallus

Phân loài Gallus gallus domesticus

Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà của ta bắt nguồn từ gà rừngGallus bankiva hay còn có tên là Gallus gallus Cách đây khoảng 3000 năm từgiống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian dài nhân dân ta đã tạo ra đượcnhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, và gà Riđược phân bố rất rộng rãi.

Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà ởnước ta đã có từ giai đoạn Phùng Nguyên cách đây 3500 năm Cơ sở của kếtluận này là tượng gà bằng đất nung tìm thấy ở xóm Rền, Đồng Đậu, VĩnhPhúc.

Theo Nguyễn Đức Tâm [9] nghề nuôi gà ở nước ta muộn hơn cách đâykhoảng 3328 ± 100 năm, đến giai đoạn Đông Sơn (2800 ± 100 năm) đã cótượng gà bằng đồng khá phổ biến.

Theo tác giả Đào Văn Tiến (1971) [11] thì gà được nuôi cách đây 3000 năm Theo các tài liệu nghiên cứu về khảo cổ và di chỉ tìm được chothấy

vùng nuôi gà sớm nhất ở nước ta nằm giữa hai dãy núi Ba Vì và Tam Đảo Gànuôi lúc bấy giờ tầm vóc còn bé, khả năng sinh sản thấp và đó chính là tổ tiêngiống gà hiện nay Trải qua thời kì dài làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo sởthích và điều kiện khí hậu, đất đai, trình độ canh tác, tập quán tổ tiên ta đãtạo nên các giống gà khác nhau mà cho đến ngày nay vẫn tồn tại và phát triểnnhư gà Ri, gà Đông Tảo, gà Hồ, gà Tre

1.1.2 Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu

ngói Đến tuổi thành thục, con trống nặng từ 1,6- 2,2 kg; con mái nặng từ 1,1

- 1,6 kg Sản lượng trứng 80 - 100 quả/năm Khối lượng trứng nhỏ: 40 - 50gam Gà Ri được chọn lọc, sản lượng trứng có thể đạt 120 - 130 quả/năm GàRi có sức chống chịu bệnh tật cao, thịt có hương vị thơm ngon, phẩm chất tốt[7].

Gà Ri có đặc tính cần cù, chịu khó kiếm ăn, khả năng chống chịu tốtvới thời tiết, bệnh tật, nuôi con khéo, đẻ trứng sớm với khẩu phần ăn nghèochất dinh dưỡng 13-15% đạm thì vẫn nuôi được gà đẻ trứng bình thường.

1.1.2.2 Gà Mông

Ở nước ta gà Mông được nuôi chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắctrong các gia đình dân tộc thiểu số, đặc biệt là người H'Mông, được nuôi vớiphương thức chăn thả quảng canh không có đầu tư.

Đặc điểm gần giống với kiểu Bakira, Gà Mông có tầm vóc tương đốilớn từ 3 - 4kg, có chân cao, tốc độ sinh trưởng khá, nhiều lông, ức nở, mào vàdái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn, màu sắc lông đa dạng Gà Mông thích nghitốt với điều kiện thời tiết khí hậu, dịch bệnh, phẩm chất thịt ngon, ít mỡ, giàudinh dưỡng Tuy nhiên gà Mông thường nuôi con và chăm sóc con kém hơngà Ri [7].

Gà Mông không những là món ăn ngon, bổ mà còn có giá trị dược liệucao, rất tốt cho những người bị bệnh tim mạch Đồng bào người Mông dùngxương, thịt của gà Mông như một loại thuốc bồi dưỡng sức khỏe cho nhữngngười ốm yếu Gà mái đẻ ít và thưa số trứng/mái/lứa là 13,65 quả, khoảngcách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày Trứng gà Mông có khối lượng ở mức trungbình với 44,04g Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng12,41 Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01% lòng đỏ trứng có tỷ lệlipit khá cao 26,94% [20].

Đặc tính riêng biệt: Da, thịt, xương và phủ tạng có màu đen chiếm 90%,ngoại trừ màu lông do quá trình nuôi bị lai tạp, chưa được chọn lọc nên màu sắc

lông gà Mông thường rất đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng Về tập tính, trước đây, gà Mông được nuôi thả tự do nên tập tính cóphần hoang dại Ban ngày gà được thả rông tự kiếm ăn, tối về chuồng hoặcđậu trên cây ngủ Thức ăn có thể là giun, dế, ngô, thóc , người nuôi ít choăn thêm.

1.1.2.3 Gà Đa cựa

Là giống gà địa phương được nuôi ở chủ yếu ở các tỉnh miền núi phíabắc trong các gia đình dân tộc thiểu số Tầm vóc tương đối lớn, màu sắc lôngđa dạng: Xám, vàng, đỏ nâu Phẩm chất thịt ngon, ít mỡ Gà có khả năngchống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật Đặc điểm đặc biệt dễ nhận thấy là châncó nhiều cựa nên được gọi là gà Đa cựa.

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ

Sinh học phân tử nghiên cứu ở mức độ phân tử các phản ứng sinh họcxảy ra trong tế bào Hoạt động của từng gen cũng như sự phối hợp giữa cácgen; Kiểm soát sự phiên mã, dịch mã cũng như sự phân bố của các proteintrong tế bào; các phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động sống của tế bào cũngnhư điều hòa hoạt động giữa các tế bào trong một mô, giữa các mô với nhau

Sự phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA bởi James D.Watson vàFrancis H.C Crick (1953) chính thức khởi đầu cho thời kì hiện đại của sinhhọc phân tử.

Trải qua hơn nửa thế kỉ sinh học phân tử đã đạt được những thành tựuvĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh họccủa sự sống ở cấp độ phân tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứngdụng vào thực tiễn Geneomics và Proteomics là vấn đề đang được quan tâmđặc biệt hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấutrúc và chức năng của axit nucleic, về đặc điểm của genome nhân, genome tythể, genome lạp thể Những đặc điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của

các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống và nghiên cứu ởngười Cùng với cấu trúc DNA và RNA còn có đặc điểm của quá trình tái bảnDNA và phiên mã cũng được quan tâm, vì nó là cơ sở của những kĩ thuật sinhhọc phân tử - các thao tác ở DNA và RNA.

Phân loại học phân tử (Molecular systematics ) là sự phát hiện, mô tảvà giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài trong phạmvi loài [16] Các phương pháp dùng trong phân loại phân tử: Hiện nay có hàngloạt các phương pháp đang được sử dụng trong phân loại học phân tử như:Điện di isozym, phản ứng chuỗi polymerase (PCR); Kĩ thuật phân tích hiệntượng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN (RFLP technology); Phân tíchđa hình của ADN được nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified PolimorphicDNA - RAPD) ;Phân tích tính đa hình chiều dài các phân đoạn ADN đượcnhân bản có chọn lọc (Amplified Fragment Length Polimorphism-AFLP)

1.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máucủa gia cầm

Máu là một loại dịch thể lỏng, có màu đỏ, vị hơi mặn và được lưuthông liên tục trong hệ tuần hoàn của cơ thể Máu cũng là một mô lỏng (mômáu) bao gồm các tế bào máu như: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu Ngoài racòn có huyết tương (dịch ngoại bào) Máu cùng với các dịch thể khác của cơthể như: Dịch bạch cầu, dịch gian bào, dịch tiêu hóa là những môi trườngsống của tất cả các loại tế bào trong cơ thể và được gọi là nội bào Máu làthành phần rất quan trọng của nội môi Nội môi luôn được ổn định và cânbằng đã đảm bảo cho các quá trình sống của cơ thể được diễn ra một cáchbình thường và do đó cơ thể mới được tồn tại, sinh trưởng và phát triểntốt Các tế bào máu luôn được đổi mới trong cơ thể nhưng vẫn luôn duy trìmột tỷ lệ tương đối ổn định.

Việc nghiên cứu các thành phần của máu cũng như các chỉ số sinh lý,hóa sinh máu có ý nghĩa quan trọng trong công tác giống, chỉ số sinh lý, hóasinh đã trở thành hằng số đặc trưng cho phẩm chất giống, quy định đặc tính ditruyền bên trong cơ thể, từ đó cho phép khảo sát và điều tra các chỉ tiêu chocông tác chọn giống và lai tạo giống gia súc, gia cầm.

Thành phần của máu: Lấy máu và chống đông rồi cho vào một ốngnghiệm, sau đó ly tâm, ta sẽ thấy máu được chia làm hai phần rõ rệt:

- Phần trên có màu vàng nhạt vì có các sắc tố màu vàng và chiếmkhoảng 55-60% thể tích của máu.

- Phần dưới đặc hơn có màu đỏ thẫm, chiếm khoảng từ 40-45% thể tíchcủa máu, đó là các tế bào máu gồm có : Các hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu.

Lượng máu trong cơ thể là tỉ lệ % của khối lượng máu so với trọnglượng cơ thể Tỉ lệ này thay đổi tùy loài: Ở mèo 6,6%, ở thỏ 5,5% và ở gà8,5% - 9% (gà 180 - 315ml; vịt 360ml).

Tỉ trọng của máu thay đổi thuộc vào tùy loài, thành phần nhóm tuổinhưng mức độ thay đổi không lớn.

Số lượng hồng cầu, bạch cầu của gia cầm không giống nhau, phụ thuộcvào giống, tuổi và giới tính.

pH của máu và hệ đệm: Phản ứng của máu phụ thuộc vào tỉ lệ ion H+và OH- trong máu, phản ứng máu nói chung ổn định ít có sự dao động giữacác loài:

Máu Ngựa pH=7,4; Dê=7,49; Gà=7,42; Lợn=7,49.

pH máu được duy trì ở trạng thái ổn định nhờ sự hoạt động của cơ quanbài tiết và các hệ đệm của máu: Hồng cầu có 5 đôi hệ đệm, huyết tương có 4đôi hệ đệm Nghiên cứu về hệ đệm của máu là cơ sở để sử dụng các dung dịchđệm trong điện di huyết thanh và hemoglobin cho phù hợp với pH của nó.Trong điện di người ta sử dụng các dung dịch đệ m khác nhau phù hợp vớitừng đối tượng.

1.3.2 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyếtthanh máu

Trong những năm gần đây, nhờ các phương pháp và kỹ thuật phân tíchsinh hóa hiện đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là phương pháp điện di và cácphương pháp nhuộm hóa tế bào đã góp phần quan trọng để nghiên cứu, pháthiện cấu trúc enzym của protein huyết thanh, sữa, các kiểu hemoglobin…trêncơ sở đó nghiên cứu cơ chế phân tử của trao đổi chất, hoạt động của gen trongtế bào Nhiều dẫn liệu trong lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền của cáctính trạng hóa sinh đã được ứng dụng trong công tác chọn giống vật nuôi mộtcách có hiệu quả.

Các tính trạng hoá sinh là những tính trạng muốn xác định nó, người taphải dùng các phương pháp phân tích hoá học, hoá sinh học Hướng nghiêncứu di truyền học hoá sinh ngày càng phát triển mạnh mẽ trên tất cả các đốitượng vi sinh vật, thực vật, động vật và người Nhờ cải tiến các kĩ thuật phântích hoá sinh ngày càng hiện đại, chính xác, có sự kết hợp giữa các máy phântích tự động với máy vi tính đã rút ngắn khá nhiều thời gian phân tích các tínhtrạng tới hàng trăm, hàng nghìn lần.

Nghiên cứu tính đa hình di truyền của hemoglobin, protein, huyết thanhmáu, protein trong sữa hoặc các enzym trong máu và các cơ quan… đã đượctiến hành từ lâu.

Năm 1955, Smithies O đã chứng minh tính đa dạng di truyền cácprotein huyết thanh máu động vật Ông đã dùng hai phương pháp chính là:Phương pháp miễn dịch học phát hiện nhóm globin, lipoprotein…và phươngpháp miễn dịch học phát hiện hemoglobin, haptoglobin, transferin.

Nhiều nhà nghiên cứu về sau đã sử dụng các phương pháp điện di trêngiấy, trên gel tinh bột, gel agarose, gel polyacrylamide…để xác định tính đahình của hemoglobin, các protein trong máu, mô cơ quan, sữa, trứng và cácenzym trong máu, trong các dịch của cơ thể.

Protein huyết thanh máu là hỗn hợp các chất khác nhau Người ta đã đisâu chứng minh vai trò quan trọng của các tiểu phần huyết thanh với các quátrình trao đổi chất và liên quan của chúng với các chỉ tiêu kinh tế khác.

1.3.3 Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật

Tùy theo phương pháp xác định thành phần protein huyết thanh mà tađược số tiểu phần (cấu tử) khác nhau.

Phương pháp điện di trên giấy tách protein huyết thanh bò, lợn đượcbốn tiểu phần chính; Anbumin là tiểu phần chạy nhanh nhất về phía cựcdương, tiếp theo là các tiểu phần αglobulin, βglobulin, γglobulin.

Về thành phần protein huyết thanh của lợn, gà, cá và một số động vậtnuôi khác khi điện di trên giấy cũng được 4 tiểu phần chính là anbumin,αglobulin, βglobulin, γglobulin.

Khi phân tích protein huyết thanh trên gel tinh bột thủy phân, gelpolyacrylamide…số cấu tử sẽ lớn hơn do mỗi tiểu phần ở trên giấy sẽ đượctách ra nhiều phần nhỏ như tiền anbumin, anbumin, hậu anbumin, α1globulin,α2globulin βglobulin, γ1globulin, γ2globulin…

Anbumin là nguyên liệu xây dựng các tế bào, anbumin huyết thanhđóng vai trò giữ áp lực thẩm thấu keo, vận chuyển và liên kết axít béo,vitamin…

Anbumin liên quan đến một số tính trạng kinh tế như lợn sinh trưởngnhanh, tỷ lệ nạc cao thì chúng có hàm lượng anbumin cao.

αglobulin tuy hàm lượng thấp so với tổng lượng protein huyết thanhnhưng chúng có vai trò quan trọng trong liên kết với gluxit, lipit để tạo ralipoprotein, glucoprotein Đồng thời, chúng tham gia vận chuyển cholestron.Khi dùng thạch, tinh bột tách được 2 phần α1globulin, α2globulin.α2globulin được quan tâm nhiều hơn vì nó chứa haptoglobin, nó liên quanđến hàm lượng mỡ sữa và sự tích lũy mỡ sữa ở động vật.

βglobulin có nhiệm vụ liên kết và chuyển hóa sắt, tạo máu, vận chuyểncác ion kim loại, chuyển hóa mỡ…

Khi tách βglobulin bằng gel tinh bột được phần transferin có vai tròquan trọng trong việc tạo máu Liên quan đến sản lượng sữa ở bò, sức khángbệnh tự nhiên ở gia súc.

γ globulin là tiểu phần rất quan trọng Nó là protein miễn dịch, ở độngvật γ- globulin được chia ra làm 5 nhóm: IgA, IgG, IgH, IgD và IgE (do cáclympho B sản xuất) Các globulin miễn dịch có tác dụng chống lại các khángnguyên lạ xâm nhập vào cơ thể Thông qua hệ thống miễn dịch, các globulinmiễn dịch đã bảo vệ cho cơ thể, và có vai trò trong bảo tồn nòi giống [2].

1.4 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ1.4.1 Cấu trúc và chức năng của ty thể

Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào hô hấp hiếu khí, có chứcnăng vô cùng quan trọng là trạm chuyển hóa năng lượng từ các phân tử dinhdưỡng thành dạng năng lượng tích trữ trong phân tử ATP là dạng năng lượngcần thiết cho tất cả các hoạt động sống của tế bào.

Ty thể được Altman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 đượcBenđa đặt tên là Mitochondria (theo tiếng Hy Lạp- Mistos là sợi và chondira-là hạt) vì chúng có dạng sợi hoặc dạng hạt khi xem dưới kính hiển vi thường.

Ty thể là những thể nhỏ có màng bao bọc, số lượng ty thể trong các tếbào rất khác nhau, có thể hàng trăm hoặc hàng nghìn Ty thể có nhiều hìnhdạng khác nhau như hình cầu, hình que, hình sợi Ty thể có khả năng chuyểnđộng, thay đổi kích thước, hình dạng và liên kết lại với nhau thành các cấutrúc dài hơn hoặc phân ra thành các cấu trúc ngắn hơn Trong tế bào, ty thểthường tập trung ở các nơi đang diễn ra sự trao đổi chất mạnh nhất.

Cấu trúc của ty thể được bao bọc bằng một màng kép lớp ngoài nhẵn,lớp trong có nhiều nếp gấp chạy song song và ăn sâu vào trung tâm của ty thể.

Giữa hai lớp màng trong và màng ngoài có chứa dịch kẽ màng Mặt ngoài củalớp ngoài và mặt trong của lớp trong có chứa nhiều hạt với kích thước từ 80-90 Ao chứa các enzyme và cofacto Ty thể như một nhà máy để sản sinh ranăng lượng của tế bào Hệ thống sản sinh ra năng lượng trong ty thể bao gồmhai quá trình oxy hóa và photphoril hóa Quá trình oxy hóa giải phóng ra cácđiện tử, các điện tử tác dụng như tác nhân tích lũy và biến đổi năng lượng.Trong điều kiện nếu thiếu oxy sẽ diễn ra quá trình tổng hợp ATP là chất tíchlũy năng lượng dưới dạng các cầu nối photphát giầu năng lượng Tại ty thể sẽtiếp nhận các sản phẩm được phân giải từ các chất như protein, lipit và gluxitdiễn ra trong bào tương đến dạng pyruvat và chuyển sang dạng AxetylcoenzimA Trong ty thể, axetyl coenzimA đã qua quá trình oxy hóa trong chutrình Krebs Với chu trình này, đã có bốn lần giải phóng 2H+ nghĩa là giảiphóng hai điện tử Các ion H+ giải phóng ra được các chất vận chuyển H+ tiếpnhận chuyển vào chuỗi hô hấp và cuối cùng chuyển hydro cho oxy Trongchuỗi hô hấp, năng lượng giải phóng được tích lại dưới dạng ATP Ty thể còncó đặc điểm là trong dịch nền của nó có những hạt DNA và ARN Ty thể đãsử dụng DNA làm khuôn mẫu để sản sinh ra ty thể mới.

1.4.2 Sự tổng hợp protein trong ty thể

Nhờ có đủ các nhân tố riêng của mình (mtDNA, mARN, tARN vàriboxom) nên ty thể có thể tự tổng hợp các protein cho mình Sự tổng hợpprotein cũng diễn ra trên riboxom theo cơ chế chung, nhưng axit amin khởiđộng, giống như ở Bacteria là N-fomyl- methionin, chứ không phải methioninnhư ở tế bào Eukaryota Ty thể không thể tự tổng hợp tất cả protein của ty thểbởi vì mtDNA chỉ chứa lượng nucleotit mã hóa cho khoảng 500 axit amin.Rất nhiều protein của ty thể được tổng hợp từ mạng lưới nội chất có hạt trongtế bào chất theo mã của các gen trong nhiễm sắc thể của nhân, sau đó đượcvận chuyển vào ty thể Ty thể tự tổng hợp một số protein không hòa tan cần

cho màng trong và một số protein có chức năng điều chỉnh quá trình hoạt hóacác gen ty thể của nhân tế bào.

1.4.3 Chủng loại phát sinh của ty thể

Trước đây có giả thuyết cho rằng trong quá trình tiến hóa của tế bào thìty thể có nguồn gốc từ sự phân hóa của màng sinh chất ăn sâu vào tế bào chất,về sau tách ra và phức tạp hóa hệ thống mào trở thành một bào quan độc lập,với dẫn chứng là nhiều bọn vi khuẩn có cấu trúc mezoxom - là một phần củamàng sinh chất gấp nếp ăn sâu vào tế bào chất, có chứa các enzym và nhân tốcủa sự hô hấp hiếu khí - đó là hình ảnh của ty thể ở dạng nguyên thủy Nhưnghiện nay người ta công nhận giả thuyết cộng sinh về nguồn gốc chủng loạicủa ty thể Sự xuất hiện ty thể trong tế bào Eukaryota là kết quả cộng sinh củamột dạng vi khuẩn hiếu khí với tế bào Dẫn chứng thuyết phục nhất là trong tythể có chứa DNA giống DNA của vi khuẩn, riboxom của ty thể về kích thướcvà rARN giống với riboxm vi khuẩn, và đặc biệt là cơ chế và hoạt động tổnghợp protein trong ty thể có nhiều đặc điểm giống với vi khuẩn.

1.4.4 MtDNA của động vật có xương sống và mtDNA gà

MtDNA là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, có chiều dài chừng 5µm.Trong tế bào mtDNA chiếm từ 1 - 5% DNA của tế bào MtDNA tự tái bảntheo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ DNA polimerase có trong chất nền ty thể và xảyra ở gian kỳ của chu kì tế bào MtDNA có dạng vòng và không liên kết vớihiston, điều này làm cho mtDNA khác với DNA của nhân tế bào và mtDNAtương tự với DNA của vi khuẩn MtDNA là một trong các nhân tố qui địnhtính di truyền tế bào chất.

Sự di truyền của các gen ty thể phụ thuộc vào hai yếu tố: Kiểu di truyềncủa bản thân bào quan và số bản sao nhiễm sắc thể trong tế bào Ở phần lớncác loài, mỗi cá thể nhận được các bào quan từ mẹ cùng với tế bào chất củatrứng Kiểu di truyền này được gọi là di truyền theo dòng mẹ Kiểu di truyền

này có đặc điểm: Thứ nhất, kiểu gen của con hoàn toàn do mẹ quyết định.Nếu mẹ mang đột biến ở gen bào quan thì con sẽ có kiểu hình đột biến cho dùbố bình thường Thứ hai, ảnh hưởng đến kiểu di truyền này là số lượng bảnsao nhiễm sắc thể trong bào quan.

Phân tử mtADN có các đặc điểm chú ý sau:- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 lần so với gen nhân.- Số lượng bản sao lớn.

- Đơn bội, không có sự tái tổ hợp.- Chỉ di truyền theo dòng mẹ.

Mt DNA của động vật có xương sống nói chung có dạng vòng kép,gồm một chuỗi nặng (chuỗi H) giàu Guamin, và một chuỗi nhẹ (chuỗi L) giàucytozin, có chiều dài khoảng 5µm Phân tử mtDNA không liên kết với proteinhistone, có khả năng tái bản theo cơ chế bán bảo toàn nhờ sử dụng cácenzyme DNA polymerase trong chất nền ty thể Ở đa số các động vật, phân tửmtDNA chứa khoảng 16-17kb, mã hóa cho các loại protein/enzyme tham giavào các quá trình tổng hợp năng lượng, trao đổi chất của tế bào, trong đógồm 22 loại tRNA, 2 loại rRNA 16S và 12S, 13 chuỗi polypeptide [15, 25].

Tất cả các động vật có xương sống đã được phân tích đều có 37 gentrên phân tử DNA ty thể và thường không có khoảng trống giữa các gen(không có intron) Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trong phân tử DNA dạngvòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này được thể hiện rõ khi sosánh trình tự genome ty thể các bậc taxon bậc bộ trở lên Vì thế, các đặc điểmvề trật tự các gen trên ty thể có triển vọng được sử dụng như một dấu hiệuphân loại với các taxon bậc cao [30].

Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 lần so với các gen nhândo thiếu cơ chế sửa chữa DNA do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể,không chỉ giữa các loài mà còn cả trong cùng một loài Bên cạnh đó, các biến

dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tếbào khác nhau MtDNA còn có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyềntheo dòng mẹ, có nhiều bản sao trong tế bào và bền vững hơn DNA nhântrong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [18], vì vậy có thể được sử dụngnhư một dấu hiệu để nhận biết các sai khác di truyền.

Năm 1990, trình tự genome mtDNA lần đầu tiên được công bố trên đốitượng gà Leghorn trắng bởi các tác giả Desjardins và Moais [16] MtDNA cóchiều dài khoảng 16,8 kb và ngoài các gen cấu trúc còn có một vùng điềukhiển không mang mã di truyền gọi là vùng D-Loop Tuy có nhiều đặc điểmtương đồng với hệ genome mtDNA của các động vật có xương sống, hệgenome mtDNA của gà vẫn mang những điểm khác biệt:

- Trên chuỗi nhẹ, trật tự gen theo chiều 5'-3' là NADH dehydrogenase(ND5), Cytochrome b (Cyt b), tRNAthr , tRNApro, ND6, tRNAGlu và vùng điềukhiển trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần vùng điều khiểnhơn [16].

- Ở gà thiếu 1 điểm khởi đầu sao chép nằm giữa 2 gen tRNACys vàtRNAAsn như ở các động vật có xương sống khác [16].

- Gen Cytochrome oxydase I (COI) có bộ 3 mở đầu là GTG thay vìATG Toàn bộ genome ty thể gà (Galuss galuss) được tổ chức như sơ đồtrong hình 1.1.

Hình 1.1 Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể GàND: NADH dehydrogenase; CO: Cytochrome oxydase

Đoạn D-loop trên mtDNA là một vùng không mang mã di truyền, cóchiều dài 1227bp ở gà nhà [16], chứa điểm khởi đầu sao chép và các promotercho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ Về cấu trúc vùngtrình tự D-Loop có thể chia thành ba domain I, II và III [14] Trong đódomain II bảo thủ nhất, chứa một số đơn vị cấu trúc không thay đổi ngay cả ởbậc phân loại họ Ngƣợc lại domain III đƣợc coi là biến đổi nhiều nhất [25].

Đoạn trình tự D-Loop là vùng tiến hóa nhanh nhất trong phân tửmtDNA Trung bình, nó tích lũy các đột biến nhanh hơn 5-10 lần so với bất kìgen nào trong hệ gen ty thể vì vậy có thể xem trình tự nucleotide của vùng D-Loop là một công cụ quan trọng để đánh giá đa dạng di truyền, sự phân hóabên trong loài và giữa các quần thể cùng loài.

1.4.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới

Năm 1994-1995, Fuhimito và cộng sự [33] đã tiến hành nghiên cứu

mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, Công , Trĩ, chim Cun cút dựatrên các phân tích đoạn điều khiển ty thể Kết quả phân tích đa hình chiều dàicác đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giảnày đưa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên Đồng thời họ đã xác địnhđược trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA Kết quả nhậnđược đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiểnmtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus.

Randi và cộng sự (1997) [19]; Scott(1997) [24] phân tích trình tự củamột phân đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-Loop)của 2 loài gà lôi đặc hữu ởViệt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này.

Năm 1999, Kimball và cộng sự [21] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủcủa gen cytochrom b (1143 bp) và đoạn siêu biến 1 (350 bp) của vùng điềukhiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gàGô Hai cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trênmột đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kếtquả phân tích trên toàn bộ gen cytochrom b, điều này cho thấy trình tự vùngđiều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại.

Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc vàđánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của trung Quốc Họ giải trình tự539 nucleotide vùng trình tự D-Loop của 6 giống gà, so sánh với trình tựnucleotide của các giống gà G gallus, G.sonneratii, G.varius, G lafayettei lưugiữ trong GenBank và thiết lập cây chủng loại phát sinh giữa các giống Đồngthời, dựa trên đoạn trình tự phân tích được họ cũng nhân thấy sự khác biệtđáng kể về mặt di truyền giữa các giống gà chuyên trứng và các giống nuôivới mục đích khác, chủ yếu là do sự khác biệt về dòng mẹ giữa các giống [31].Năm 2002 Zang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nucleotide đầu tiêntrong vùng D-Loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung

Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus,Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố trong ngânhàng gen quốc tế Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của chúngdựa trên trình tự vùng D-Loop Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus córất nhiều điểm khác nhau G g domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhấtvới G gallus của Thái Lan và các vùng lân cận Nhóm nghiên cứu đã giảthuyết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G.gallus ở cácnơi này và hai loài phụ G g Gallus, G g spadiceus có thể thuộc một loài phụdo tính tương đồng cao giữa chúng [36].

Năm 2003, S Moulin và cộng sự đã sử dụng 800 bp của đoạn D-Loopvà 400 bp của gen cyt b để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của 2 loài gàLôi Lophura nycthemera và L leucomelanos Các kết quả thu được đã gópphần phân biệt 2 loài trên và đồng thời làm sáng tỏ nguồn gốc của một số loàithuộc 2 loài này [29].

Năm 2003, T Komiyama và cộng sự cũng dựa trên trình tự đầy đủ củavùng D-Loop để nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa và quá trình thuần hóa của 3giống gà Naganakidori của Nhật Bản Trên cơ sở cây chủng loại phát sinh xâydựng được các nhà nghiên cứu cho rằng tuy có nhiều điểm khác biệt đáng chúý, 3 giống gà trên đều có nguồn gốc từ giống gà chọi Shamo Kết quả này còndẫn đến kết luận 3 giống gà được đưa từ các vùng lân cận miền Nam trungQuốc hoặc Đông Dương qua Okinawa vào Nhật Bản [22, 23].

Pereira và cộng sự (2004) đã tìm được ít nhất 13 gen giả (pseudogenehay Numt) trong genome của G.gallus với kích thước dao động từ 131 đến1733 nucleotide Đây là các đoạn DNA ty thể được tìm thấy trong hệ gennhân của sinh vật nhân thật Một số trong chúng có nhiều điểm tương đồngvới các đoạn trong ty thể Do đó, chúng có thể được dùng trong các nghiêncứu mối quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm

đối tượng nghiên cứu Tuy nhiên, người ta vẫn chưa xác định được tần số bắt gặp của Numt cũng như đóng góp của nó đối với genome trong nhân [33].

Komiya T và đồng tác giả (2004) [23] đã tiến hành phân tích trình tựvùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộcgà địa phương của Nhật Bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhàlông đỏ (Jungle Fowl) đã được công bố trên ngân hàng gen Quốc TếEMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup) Trên cơ sở đó họ đãthiết lập cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồngốc từ gà chọi Shamo Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dàiđều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau.Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawavốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn sovới Honshu/Kyushu Nhật Bản Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dàiNhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận củavùng Nam Trung Quốc và Đông Nam Á Như vậy có thể thấy trình tựnucleotide của vùng D-Loop là một công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đadạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý.

1.4.6 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng sự đã sử dụng phương phápđa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP) nghiên cứu vùng D-Loop của 3 loài gàlôi Việt Nam gồm: gà lôi đuôi trắng, trĩ bạc và gà lôi hông tía Các kết quả thuđược cho thấy sự sai khác về trình tự nhận biết các enzyme trong vùng trìnhtự nói trên [13].

Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn genđiều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vectorpBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotidevùng D-Loop.

Năm 2006 Địch Thị Kim Hương và cộng sự [6] đã xác định được trìnhtự vùng D-Loop gồm 1277 nucleotide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, LươngPhượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nuclotide giữa hai đại diện.

Năm 2007 Lê Đức long và cộng sự đã giải trình tự và so sánh trình tựnucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên,Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dựán gà sạch Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khácbiệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này.

Năm 2008 Nguyễn Trường Huy và cộng sự [5] đã xác định được trìnhtự 300 nucleotide đầu tiên trong đoạn D-Loop của 4 mẫu thuộc 4 giống gà:Gà Ác, gà Mía, gà Hồ và gà Mông và so sánh với trình tự tương ứng trênđoạn D-Loop 2 giống gà Leghorn và gà bản địa Lào Dựa trên cây chủng loạiphát sinh xây dựng được, có thể đưa ra kết luận sơ bộ về mối quan hệ ditruyền giữa các mẫu thuộc 4 giống gà nghiên cứu so với 2 giống gà đượcchọn để so sánh.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

Vật liệu nghiên cứu là mẫu máu của các giống gà:

- Gà Ri Bắc Kạn (RI): Lông vàng, da vàng, chân vàng.

- Gà Mông Bắc Kạn (Mo): Lông đỏ thẫm điểm đốm trắng nhỏ, da vàng,chân chì.

- Gà Đa Cựa Bắc Kạn (Da): Lông màu đỏ thẫm, da vàng, chân vàng vàcó nhiều cựa.

Các giống gà trên được lấy từ Bản Hậu - Xã Mỹ Phương - Huyện BaBể - Tỉnh Bắc Kạn.

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ2.2.1 Hóa chất

Protease K (20mg/l); phenol:chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1);Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0.8%; Tris-HCl (0.1M; pH7.5);NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium bromide.

Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma Dung dịch đệm PBS (phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl0.2g; Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g Dẫn nước đến 100ml.

Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8);EDTA (10mM, pH8); NaCl 0.1M; SDS 2.1%.

Dung dịch đệm TAE dùng trong kĩ thuật điện di: Tris base;CH3COOH; EDTA (0.5mM, pH8).

Bộ hóa chất dùng cho PCR (dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt )

Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS,0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l

TEMED Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10%

(w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O,30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED.

Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol,2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8

Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3

2.2.2 Thiết bị

Các thiết bị và hóa chất được sử dụng thuộc sở hữu của phòng thínghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng -Viện Công Nghệ Sinh Học.

Các thiết bị sử dụng trong đề tài

- Bể ổn nhiệt hãng Tempette Junior Tech- Cân phân tích hãng metter Toledo, Thụy Sỹ- Máy li tâm hãng Sorvall

- Máy điện di hãng PowerPac 300, Mỹ- Máy khuấy trộn hãng OSI, Rotolab

- Máy làm khô chân không hãng Speed Vac Sc 110A- Savan, Mỹ- Máy PCR-PTC 100 hãng MJ Research, Mỹ

- Máy chụp ảnh hãng Bio-Rad, Mỹ- Lò vi sóng hãng Samsung, Hàn Quốc- Pipetman các loại hãng Gilson, Pháp

- Tủ lạnh sâu -20oC, -84oC do hãng Sanyo, Nhật Bản sản xuất.

- Máy gene AmpPCR System 9700 do hãng Applied Biosystems, Mỹsản xuất.

- Máy xác định trình tự tự động ABI PRISMTM3100 Genetic Analyserdo hãng Applied Biosystems, Mỹ sản xuất.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật• Nguyên tắc chung

Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoàinhân được giải phóng cùng với các protein Sau đó DNA được tinh sạchnhờ

proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol Cuối cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm.

• Quy trình kĩ thuật

Làm tan máu đông lạnh ở 37-39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chiamáu vào các ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNAtổng số theo phương pháp của Sambrook và Russell [35] các bước như sau:

Bước 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4 oC,đổ dịch, thu cặn.

Bước 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 µlproteinase K Mẫu thu được ủ ở 65oC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng,chia vào mỗi ống Epp 500 µl dịch.

Bước 3: Bổ sung một lượng tương đương Phenol: Chlroform: Isoamylalcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4 oC.Hút pha trên vào ống mới.

Bước 4: Thêm một thể tích tương đương Chloroform: Isoamyl alcohol(24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC Thu pha trên.

Bước 5: Thêm CH3COONa một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịchtrong ống Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20oC trong 15h (qua đêm).

Bước 6: Ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC để thu DNA Tiếp đó, bổ sung500µl cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC, bỏ dịch và thu cặn.

Bước 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hòa tan cặn trong 50 µl H2O,búng nhẹ.

2.3.2 Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose• Nguyên tắc chung

Điện di là kĩ thuật dùng để tách và định lượng axit nucleic với các kíchthước và hàm lượng khác nhau Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của