3. Nội dung nghiên cứu
2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE
• Nguyên tắc
SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi [26].Trong phƣơng pháp này, các phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng của điện trƣờng không đổi. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích đƣợc loại trừ.
Khi protein đƣợc chạy trong điện trƣờng không đổi, phức hệ protein- SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc vào hình dáng, kích thƣớc phân tử. Khi đó protein sẽ đƣợc phân tách thành các băng, vạch khác nhau. Gel thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ từ 5%-15% và có thể đƣợc chạy theo chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng.
• Phƣơng pháp
Máu ngoại vi đƣợc lấy khoảng 3ml -5ml từ ba đại diện của ba giống gà . Để mẫu máu tại nhiệt độ phòng trong 3h. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút. Hút chuyển phần huyết thanh sang eppendorf mới. Mẫu huyết
thanh sau đó đƣợc giữ tại điều kiện -25oC hoặc -75oC.
Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE)
Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970 .Các thiết bị, hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp.
Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau.
Đối với các protein có trọng lƣợng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%, 12.6% và 15% (w/v) thƣờng đƣợc sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS- PAGE đƣợc tiến hành trên gel 12.6% với các thành phần cơ bản nhƣ sau cho 3 mẫu huyết thanh của 3 dòng gà thí nghiệm đã pha loãng 30
lần.
Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE
Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 µl 10% (w/v) SDS,
0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 µl 10% (w/v) APS, 2 µl
TEMED Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8,
45µl 10%
(w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O,
30 µl 10% (w/v) APS, 3 µl TEMED
Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy .