3. Nội dung nghiên cứu
3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà
Để tiến hành đánh giá đa dạng di truyền các giống gà, vấn đề quan trọng đầu tiên là phải thu nhận đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch và không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết DNA từ máu động vật nhƣng việc lựa chọn một phƣơng pháp tách chiết có nhiều ƣu điểm và phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu cho nên chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russel để tách chiết DNA.
Trƣớc tiên, máu đông đƣợc làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39oC trong 2
giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian nhƣ vậy, plasminogen trong huyết tƣơng sẽ đƣợc chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein nhƣ fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào đƣợc giải phóng. Sau khi rã đông đem ly tâm dung dịch máu đã đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì dộ pH của máu. Các tế bào thu đƣợc đem hòa tantrong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải
phóng DNA ra môi trƣờng. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các Mg2+, nhờ
tham gia bảo vệ DNA khỏi sự phân giải của các nuclease. Ngoài ra, protease K có trong đệm chiết sẽ phân hủy các liên kết peptit trong protein. pH kiềm của dung dịch đệm chiết làm DNA trở nên ổn định.
Để loại bỏ thành phần protein trong mẫu tách, chúng tôi tiến hành lắc mạnh mẫu với hỗn hợp phenol: chloroform: isoamy alcohol. Chloroform làm tăng cƣờng hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhƣng không làm ảnh hƣởng đến cấu trúc của DNA. Đồng thời, nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nƣớc với với pha hữu cơ. Isoamy alcohol có tác dụng làm giảm bọt trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp đƣợc phân làm ba pha: pha trên cùng là pha nƣớc có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, và pha cuối cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamy alcohol. Pha nƣớc đƣợc hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó đƣợc xử lý bằng hỗn hợp chloroform: isoamy alcohol nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA. Bƣớc này có thể lặp lại 1-2 lần.
Thu tủa bằng cách bổ sung vào dịch chiết 50 µm CH3COONa 3M, pH 5,2 và 1ml EtOH 100%. EtOH có tác dụng hút lớp nƣớc bao quanh phân tử
DNA, để lộ ra các gốc phosphat tích điện âm. Khi đó các ion Na+ sẽ kết hợp
với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleitit giảm, do
đó DNA bị kết tủa. Trong điều kiện -20oC trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần
nhƣ DNA kết tủa hoàn toàn. Tủa thu đƣợc đƣợc rửa bằng EtOH 70%, Làm khô và hòa tan trong nƣớc. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế
chúng tôi đã loại RNA bằng RNase, ủ ở 37oC trong 2-3 giờ. DNA tinh sạch
đƣợc hòa tan trong nƣớc khử ion vô trùng và đem điện di kiểm tra trên gel agrose 0,8%. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số
1: DNA tổng số gà Ri; 2: DNA tổng số gà Mông; 3: DNA tổng số gà Đa Cựa
Trên ảnh điện di, các mẫu đều xuất hiện một vạch DNA sáng đậm ở vị trí cao nhất trên bản gel. Theo lý thuyết, DNA tổng số bao gồm các đoạn có kích thƣớc từ 10 kb đến 300 kb, khi điện di sẽ tập trung thành một vạch đậm. Nếu DNA tách chiết đƣợc có lẫn protein, các phân tử protein chƣa đƣợc loại hoàn toàn sẽ tạo thành vạch sáng kéo dài phía trên vạch DNA tổng số. Hình 1.3 cho thấy sản phẩm DNA tách chiết ít bị lẫn protein tạp và dựa vào độ sáng của vạch DNA tổng số, có thể thấy nồng độ DNA thu đƣợc khá cao. Chúng tôi kết luận DNA tổng số tách chiết từ các mẫu máu gà đảm bảo chất lƣợng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.