3. Nội dung nghiên cứu
2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR
Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (polimerase chain reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên đƣợc Mullis và cộng sự mô tả năm 1986.
• Nguyên tắc:
Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại invitro một trình tự DNA lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene từ những đoạn DNA ngắn đƣợc phân lập hoặc từ một lƣợng rất nhỏ lấy ra đƣợc khuếch đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp. Đồng thời nó giúp cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự DNA trong bộ gene của các cơ thể sinh vật khác nhau.
Phản ứng chuỗi polimerase đƣợc thực hiện khi có DNA mẫu, 2 đoạn mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphat( dATP, dTTP,
dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng chuỗi PCR đƣợc thực
hiện trên thiết bị nhân DNA.
Một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau:
- Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng kép sang sợi
- Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp xuống 40- 65oC cho phép hai đoạn mồi gắn DNA mẫu ở vị trí tƣơng đồng theo nguyên tắc bổ sung ( A - T, G - X) ở hai đầu DNA cần nhân.
- Giai đoạn kéo dài: Ở nhiệt độ 72oC DNA Taq polimerase hoạt động
kéo dài DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu.
Sau một chu kì gồm 3 giai đoạn nhƣ trên, một đoạn DNA khuôn đƣợc nhân lên thành hai, các đoạn DNA đƣợc nhân bản trong mỗi chu kì lại đƣợc coi là DNA khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì
nhân bản sẽ tạo ra 2k DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu.
• Nguyên liệu
- DNA khuôn (Teplate)
- Cặp mồi H1255- L16725 chuyên biệt. Ở đây, H(Heavy) và L( Light) là kí hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuclotide đầu 3' của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15].
+
- Bộ hóa chất: Dung dịch đệm có chứa NH4
10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas. - Nƣớc khử ion vô trùng.
, dNTPs 10mM, MgCl2
Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 µl nhƣ trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen
Nƣớc 10,85 µl Buffer 2,5 µl MgCl2 4 µl dNTPs 2,5 µl Mồi H1255-F 0,5 µl Mồi L16725-R 0,5 µl
Taq DNA polymerase 0,15 µl
DNA temp 4 µl
Bảng 2.2. Chu trình nhiệt Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn
mồi Kéo dài Ổn định
Giữ mẫu
Nhiệt độ 94oC 94oC 50oC 72oC 72oC 4oC
Thời gian 4' 1' 1' 1'20" 10' ∞
Số chu kì 1 30 1
Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%.