3. Nội dung nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật
• Nguyên tắc chung
Màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân đƣợc giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA đƣợc tinh sạch nhờ
proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA đƣợc tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phƣơng pháp ly tâm.
• Quy trình kĩ thuật
Làm tan máu đông lạnh ở 37-39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia
máu vào các ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [35] các bƣớc nhƣ sau:
Bƣớc 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4 oC,
đổ dịch, thu cặn.
Bƣớc 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 µl
proteinase K. Mẫu thu đƣợc ủ ở 65oC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng,
chia vào mỗi ống Epp 500 µl dịch.
Bƣớc 3: Bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng Phenol: Chlroform: Isoamyl
alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4 oC.
Hút pha trên vào ống mới.
Bƣớc 4: Thêm một thể tích tƣơng đƣơng Chloroform: Isoamyl alcohol
(24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC. Thu pha trên.
Bƣớc 5: Thêm CH3COONa một lƣợng bằng 1/10 thể tích dung dịch
trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20oC trong 15h (qua đêm).
Bƣớc 6: Ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung
500µl cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC, bỏ dịch và thu cặn.
Bƣớc 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hòa tan cặn trong 50 µl H2O, búng nhẹ.