Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển d loop ty thể của ba giống gà ri, mông và đa cựa

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––––– HỨA THỊ NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––––– HỨA THỊ NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:PGS.TS NGUYỄN TRỌNG LẠNG THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên hƣớng dẫn tận tình, chu đáo trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán Phòng Công nghệ DNA ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt PGS.TS Nông Văn Hải tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn tạo điều kiện tốt để hoàn thành khóa luận Trong suốt trình học tập nghiên cứu đƣợc anh chị NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hƣơng, CN Vũ Hải Chi - cán nghiên cứu phòng quan tâm, hƣớng dẫn cho lời khuyên quý báu Tôi trân trọng biết ơn giúp đỡ Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô cán sở Đào Tạo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả luận văn Hứa Thị Nga Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố công trình khác Tác giả luận văn Hứa Thị Nga Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Adenin bp Base pair (cặp bazơ) cs Cộng C Cytozin ddNTP Dideoxynucleside triphosphate dNTP Deoxynucleside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid D-Loop Displacement loop - đoạn điều khiển ty thể EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr Ethidium brommide EtOH Ethanol Epp Eppendorf G Guamin Kb kilo base kDa kilo Dalton mtDNA DNA ty thể (mitochondrial DNA) NXB Nhà xuất NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PBS Phosphate - buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease SDS Sodium Doecyl Sulphate T Timin TAE Tris - Acetate - EDTA Tm Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen 28 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt 29 Bảng 2.3 Chu trình nhiệt cho PCR máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 30 Bảng 3.1 Thống kê điểm đa hình hai mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn 41 Bảng 3.2 So sánh mức độ sai khác trình tự nucleotide 42 Bảng 3.3 Thống kê xuất băng điện di protein huyết gà thí nghiệm 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ tổ chức DNA ty thể Gà 16 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số 33 Hình 3.2 Ảnh chụp kết điện di sản phẩm PCR 36 Hình 3.3 So sánh trình tự D-Loop hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 40 Hình 3.4 Quan hệ di truyền số giống gà 42 Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết 43 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu đề tài Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Sơ lƣợc nguồn gốc vị trí phân loại gà nhà 1.1.2 Một số đặc điểm ba giống gà nghiên cứu 1.2 ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ 1.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tiêu sinh lý, hóa sinh máu gia cầm 1.3.2 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết máu 10 1.3.3 Thành phần protein huyết gia súc số động vật 11 1.4 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ 12 1.4.1 Cấu trúc chức ty thể 12 1.4.2 Sự tổng hợp protein ty thể 13 1.4.3 Chủng loại phát sinh ty thể 14 1.4.4 MtDNA động vật có xƣơng sống mtDNA gà 14 1.4.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà giới 17 1.4.6 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà Việt Nam 20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU 22 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 22 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.1 Hóa chất 22 2.2.2 Thiết bị 23 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.3.1 Tách chiết tinh DNA tổng số từ máu động vật 23 2.3.2 Kĩ thuật điện di DNA gel agarose 24 2.3.3 Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 25 2.3.4 Nhân vùng điều khiển D-Loop kĩ thuật PCR 27 2.3.5 Tinh sản phẩm DNA 29 2.3.6 Phƣơng pháp xác định trình tự 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ 31 3.1.1 Tách chiết tinh DNA tổng số từ máu gà 31 3.1.2 Nhân vùng điều khiển D-Loop DNA ty thể 33 3.1.3 Xác định trình tự vùng điều khiển DNA ty thể 37 3.2 THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Gần kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm đƣợc giới quan tâm phát triển mạnh số lƣợng chất lƣợng Chăn nuôi gia cầm chiếm vị trí quan trọng chƣơng trình cung cấp protein động vật cho ngƣời Gia cầm chiếm 20-25% tổng sản phẩm thịt, nƣớc phát triển thịt gà chiếm tới 30% Ở nƣớc ta ngành chăn nuôi gia cầm nghề sản xuất truyền thống, giữ vị trí quan trọng thứ hai tổng giá trị sản xuất Đàn gia cầm nƣớc ta phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu tỉnh phía Bắc (66%), tỉnh phía Nam chiếm 34% Đàn vịt ngƣợc lại phân bố chủ yếu tỉnh phía Nam (60%) miền Bắc đàn vịt chiếm khoảng 40% Theo số liệu Tổng cục thống kê, số lƣợng đàn gia cầm nƣớc ta đến ngày 1/8/2004 218,15 triệu con, tƣơng đƣơng với số đầu năm 2001 (218,1 triệu con) thấp năm 2002 ( 233,3 triệu con) năm 2003 (254,06 triệu) Sản lƣợng thịt 316,41 ngàn tấn, thấp năm 2001 (322,6 ngàn tấn), năm 2002 (338,4 ngàn tấn) 2003 (372,72 ngàn tấn) Sản lƣợng trứng 3,94 tỷ quả, thấp năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) 2003 (4,85 tỷ) Nguyên nhân ảnh hƣởng dịch cúm gia cầm [10].Năm 2005, Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn hoàn thành việc xây dựng đề án đổi hệ thống chăn nuôi gia cầm nƣớc ta Theo đề án, ngành chăn nuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sang sản xuất hàng hóa lớn theo hƣớng công nghiệp hóa bán công nghiệp sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung địa phƣơng; mục tiêu đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khối lƣợng thịt 1000 nghìn , sản lƣợng trứng 11,0 tỷ tổng giá trị sản xuất chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hiện 75-80% chăn nuôi gà nƣớc ta sử dụng giống địa phƣơng, nuôi gà chăn thả với giống truyền thống địa phƣơng không ngừng phát triển hiệu ngày tăng giống địa phƣơng đƣợc đầu tƣ để bảo tồn quỹ gen nhằm chọn lọc nâng cao suất Các giống gà nội ta có hạn chế suất, nhƣng khả thích ứng với điều kiện chăn nuôi Việt Nam cao, phẩm chất trứng thịt tốt đặc biệt số giống gà có giá trị dƣợc liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe ngƣời Gà Ri ta, gà ngƣời H'Mông giống gà có phẩm chất quý đó.Và giống gà đƣợc nhiều ngƣời quan tâm phẩm chất, tác dụng gà Đa cựa Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi dựa vào đặc điểm hình thái dựa vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh hóa Các đặc tính chịu kiểm soát gen, thuộc hệ gen thể sinh vật tƣơng tác gen với môi trƣờng phân tích đa hình protein huyết giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng giống gà thí nghiệm, so sánh trình tự đoạn D-loop giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác định mối quan hệ di truyền giống gà, việc làm cần thiết nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo sở cho việc lai tạo giống đáp ứng đƣợc nhu cầu thị trƣờng Vì lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu đa hình protein huyết trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể ba giống gà: Ri, Mông Đa cựa" Mục tiêu nghiên cứu đề tài - So sánh trình tự đoạn điều khiển DNA ty thể giống gà - Xác định mối quan hệ di truyền ba đại diện ba giống gà - Phân tích đa hình protein huyết ba đại diện ba giống gà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Nội dung nghiên cứu - Tách chiết tinh DNA tổng số từ mô máu gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa - Phân lập vùng D-Loop hệ gen ty thể kỹ thuật PCR - Xác định trình tự vùng D-Loop so sánh với trình tự tham khảo đƣợc công bố Ngân hàng trình tự gen quốc tế Trên sở đó, đánh giá sơ khác biệt di truyền ba đại diện ba giống gà nói Từ cung cấp liệu ban đầu cho nghiên cứu đa dạng di truyền cải tạo giống gà Công nghệ gen Công nghệ tế bào - Dùng phƣơng pháp điện di để điện di huyết ba đại diện ba giống gà từ phân tích đa hình protein huyết ba đại diện ba giống gà nói Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Sơ lƣợc nguồn gốc vị trí phân loại gà nhà Các giống gà đƣợc hình thành từ trình lai tạo, tiến hóa lâu dài phức tạp loại hình sau gà rừng - Gallus Bankiva: Phân bố Miến Điện, Đông Dƣơng Philippin - Gallus Soneratii: Phân bố Tây Nam Ấn Độ - Gallus Lafazetti: Phân bố Sri Lanca - Gallus Varius: Phân bố Inđônêxia Ở vùng thung lũng sông Ấn, hóa gà nhà diễn thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm trƣớc Công nguyên (CN) Vào khoảng 2000 năm trƣớc CN gà đƣợc đƣa sang Trung Quốc Sau gà phân bố Hy Lạp, gà vừa vật để làm cảnh, tế lễ, giải trí (chọi gà) Thông qua ngƣời Hy Lạp có mối quan hệ buôn bán rộng rãi mà gà đƣợc đƣa sang nƣớc thuộc miền Địa Trung Hải Châu Âu Đến kỉ I gà nuôi đƣợc phân bố rộng rãi Trung Âu Đông Âu Dẫn theo Nguyễn Đình Ân nhiều tác giả, hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau: Giới Động vật (Animalia) Nghành Động vật có xƣơng sống (Chordata) Lớp Chim (Aves) Bộ Gà (Galliformes) Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus Loài Gallus gallus Phân loài Gallus gallus domesticus Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà ta bắt nguồn từ gà rừng Gallus bankiva hay có tên Gallus gallus Cách khoảng 3000 năm từ giống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian dài nhân dân ta tạo đƣợc nhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, gà Ri đƣợc phân bố rộng rãi Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà nƣớc ta có từ giai đoạn Phùng Nguyên cách 3500 năm Cơ sở kết luận tƣợng gà đất nung tìm thấy xóm Rền, Đồng Đậu, Vĩnh Phúc Theo Nguyễn Đức Tâm [9] nghề nuôi gà nƣớc ta muộn cách khoảng 3328 ± 100 năm, đến giai đoạn Đông Sơn (2800 ± 100 năm) có tƣợng gà đồng phổ biến Theo tác giả Đào Văn Tiến (1971) [11] gà đƣợc nuôi cách 3000 năm Theo tài liệu nghiên cứu khảo cổ di tìm đƣợc cho thấy vùng nuôi gà sớm nƣớc ta nằm hai dãy núi Ba Vì Tam Đảo Gà nuôi lúc tầm vóc bé, khả sinh sản thấp tổ tiên giống gà Trải qua thời kì dài làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo sở thích điều kiện khí hậu, đất đai, trình độ canh tác, tập quán tổ tiên ta tạo nên giống gà khác mà ngày tồn phát triển nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà Hồ, gà Tre 1.1.2 Một số đặc điểm ba giống gà nghiên cứu 1.1.2.1 Gà Ri Có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus banguira thƣờng gặp nƣớc Đông Nam Á nhƣ Ấn Độ, Mianma, Malaysia Ở nƣớc ta gà Ri đƣợc nuôi phổ biến miền nƣớc Mầu sắc lông có nhiều loại: Vàng , nâu, đen, trắng, xám thể tính pha tạp nặng Tầm vóc nhỏ, dáng gọn, chân có hai hàng vẩy xếp nhƣ hình mái ngói Đến tuổi thành thục, trống nặng từ 1,6- 2,2 kg; mái nặng từ 1,1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 1,6 kg Sản lƣợng trứng 80 - 100 quả/năm Khối lƣợng trứng nhỏ: 40 - 50 gam Gà Ri đƣợc chọn lọc, sản lƣợng trứng đạt 120 - 130 quả/năm Gà Ri có sức chống chịu bệnh tật cao, thịt có hƣơng vị thơm ngon, phẩm chất tốt [7] Gà Ri có đặc tính cần cù, chịu khó kiếm ăn, khả chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật, nuôi khéo, đẻ trứng sớm với phần ăn nghèo chất dinh dƣỡng 13-15% đạm nuôi đƣợc gà đẻ trứng bình thƣờng 1.1.2.2 Gà Mông Ở nƣớc ta gà Mông đƣợc nuôi chủ yếu tỉnh miền núi phía bắc gia đình dân tộc thiểu số, đặc biệt ngƣời H'Mông, đƣợc nuôi với phƣơng thức chăn thả quảng canh đầu tƣ Đặc điểm gần giống với kiểu Bakira, Gà Mông có tầm vóc tƣơng đối lớn từ - 4kg, có chân cao, tốc độ sinh trƣởng khá, nhiều lông, ức nở, mào dái tai lớn, mỏ cong nhọn, màu sắc lông đa dạng Gà Mông thích nghi tốt với điều kiện thời tiết khí hậu, dịch bệnh, phẩm chất thịt ngon, mỡ, giàu dinh dƣỡng Tuy nhiên gà Mông thƣờng nuôi chăm sóc gà Ri [7] Gà Mông ăn ngon, bổ mà có giá trị dƣợc liệu cao, tốt cho ngƣời bị bệnh tim mạch Đồng bào ngƣời Mông dùng xƣơng, thịt gà Mông nhƣ loại thuốc bồi dƣỡng sức khỏe cho ngƣời ốm yếu Gà mái đẻ thƣa số trứng/mái/lứa 13,65 quả, khoảng cách lứa đẻ 19,88 ngày Trứng gà Mông có khối lƣợng mức trung bình với 44,04g Tỷ lệ vật chất khô lòng đỏ trứng 50,56%, lòng trắng 12,41 Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01% lòng đỏ trứng có tỷ lệ lipit cao 26,94% [20] Đặc tính riêng biệt: Da, thịt, xƣơng phủ tạng có màu đen chiếm 90%, ngoại trừ màu lông trình nuôi bị lai tạp, chƣa đƣợc chọn lọc nên màu sắc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn lông gà Mông thƣờng đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng Về tập tính, trƣớc đây, gà Mông đƣợc nuôi thả tự nên tập tính có phần hoang dại Ban ngày gà đƣợc thả rông tự kiếm ăn, tối chuồng đậu ngủ Thức ăn giun, dế, ngô, thóc , ngƣời nuôi cho ăn thêm 1.1.2.3 Gà Đa cựa Là giống gà địa phƣơng đƣợc nuôi chủ yếu tỉnh miền núi phía bắc gia đình dân tộc thiểu số Tầm vóc tƣơng đối lớn, màu sắc lông đa dạng: Xám, vàng, đỏ nâu Phẩm chất thịt ngon, mỡ Gà có khả chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật Đặc điểm đặc biệt dễ nhận thấy chân có nhiều cựa nên đƣợc gọi gà Đa cựa 1.2 ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ Sinh học phân tử nghiên cứu mức độ phân tử phản ứng sinh học xảy tế bào Hoạt động gen nhƣ phối hợp gen; Kiểm soát phiên mã, dịch mã nhƣ phân bố protein tế bào; phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động sống tế bào nhƣ điều hòa hoạt động tế bào mô, mô với Sự phát cấu trúc chuỗi xoắn kép DNA James D.Watson Francis H.C Crick (1953) thức khởi đầu cho thời kì đại sinh học phân tử Trải qua nửa kỉ sinh học phân tử đạt đƣợc thành tựu vĩ đại mà đỉnh cao phát triển khám phá chất sinh học sống cấp độ phân tử xây dựng kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng vào thực tiễn Geneomics Proteomics vấn đề đƣợc quan tâm đặc biệt mà sở lĩnh vực phát cấu trúc chức axit nucleic, đặc điểm genome nhân, genome ty thể, genome lạp thể Những đặc điểm khác cấu trúc chức Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống nghiên cứu ngƣời Cùng với cấu trúc DNA RNA có đặc điểm trình tái DNA phiên mã đƣợc quan tâm, sở kĩ thuật sinh học phân tử - thao tác DNA RNA Phân loại học phân tử (Molecular systematics ) phát hiện, mô tả giải thích tính đa dạng sinh học mức độ phân tử loài phạm vi loài [16] Các phƣơng pháp dùng phân loại phân tử: Hiện có hàng loạt phƣơng pháp đƣợc sử dụng phân loại học phân tử nhƣ: Điện di isozym, phản ứng chuỗi polymerase (PCR); Kĩ thuật phân tích tƣợng đa hình độ dài phân đoạn ADN (RFLP technology); Phân tích đa hình ADN đƣợc nhân ngẫu nhiên (Random Amplified Polimorphic DNA - RAPD) ;Phân tích tính đa hình chiều dài phân đoạn ADN đƣợc nhân có chọn lọc (Amplified Fragment Length Polimorphism-AFLP) 1.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tiêu sinh lý, hóa sinh máu gia cầm Máu loại dịch thể lỏng, có màu đỏ, vị mặn đƣợc lƣu thông liên tục hệ tuần hoàn thể Máu mô lỏng (mô máu) bao gồm tế bào máu nhƣ: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu Ngoài có huyết tƣơng (dịch ngoại bào) Máu với dịch thể khác thể nhƣ: Dịch bạch cầu, dịch gian bào, dịch tiêu hóa môi trƣờng sống tất loại tế bào thể đƣợc gọi nội bào Máu thành phần quan trọng nội môi Nội môi đƣợc ổn định cân đảm bảo cho trình sống thể đƣợc diễn cách bình thƣờng thể đƣợc tồn tại, sinh trƣởng phát triển tốt Các tế bào máu đƣợc đổi thể nhƣng trì tỷ lệ tƣơng đối ổn định Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Việc nghiên cứu thành phần máu nhƣ số sinh lý, hóa sinh máu có ý nghĩa quan trọng công tác giống, số sinh lý, hóa sinh trở thành số đặc trƣng cho phẩm chất giống, quy định đặc tính di truyền bên thể, từ cho phép khảo sát điều tra tiêu cho công tác chọn giống lai tạo giống gia súc, gia cầm Thành phần máu: Lấy máu chống đông cho vào ống nghiệm, sau ly tâm, ta thấy máu đƣợc chia làm hai phần rõ rệt: - Phần có màu vàng nhạt có sắc tố màu vàng chiếm khoảng 55-60% thể tích máu - Phần dƣới đặc có màu đỏ thẫm, chiếm khoảng từ 40-45% thể tích máu, tế bào máu gồm có : Các hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Lƣợng máu thể tỉ lệ % khối lƣợng máu so với trọng lƣợng thể Tỉ lệ thay đổi tùy loài: Ở mèo 6,6%, thỏ 5,5% gà 8,5% - 9% (gà 180 - 315ml; vịt 360ml) Tỉ trọng máu thay đổi thuộc vào tùy loài, thành phần nhóm tuổi nhƣng mức độ thay đổi không lớn Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu gia cầm không giống nhau, phụ thuộc vào giống, tuổi giới tính pH máu hệ đệm: Phản ứng máu phụ thuộc vào tỉ lệ ion H+ OH- máu, phản ứng máu nói chung ổn định có dao động loài: Máu Ngựa pH=7,4; Dê=7,49; Gà=7,42; Lợn=7,49 pH máu đƣợc trì trạng thái ổn định nhờ hoạt động quan tiết hệ đệm máu: Hồng cầu có đôi hệ đệm, huyết tƣơng có đôi hệ đệm Nghiên cứu hệ đệm máu sở để sử dụng dung dịch đệm điện di huyết hemoglobin cho phù hợp với pH Trong điện di ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm khác phù hợp với đối tƣợng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 1.3.2 Cơ sở khoa học việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết máu Trong năm gần đây, nhờ phƣơng pháp kỹ thuật phân tích sinh hóa đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt phƣơng pháp điện di phƣơng pháp nhuộm hóa tế bào góp phần quan trọng để nghiên cứu, phát cấu trúc enzym protein huyết thanh, sữa, kiểu hemoglobin…trên sở nghiên cứu chế phân tử trao đổi chất, hoạt động gen tế bào Nhiều dẫn liệu lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền tính trạng hóa sinh đƣợc ứng dụng công tác chọn giống vật nuôi cách có hiệu Các tính trạng hoá sinh tính trạng muốn xác định nó, ngƣời ta phải dùng phƣơng pháp phân tích hoá học, hoá sinh học Hƣớng nghiên cứu di truyền học hoá sinh ngày phát triển mạnh mẽ tất đối tƣợng vi sinh vật, thực vật, động vật ngƣời Nhờ cải tiến kĩ thuật phân tích hoá sinh ngày đại, xác, có kết hợp máy phân tích tự động với máy vi tính rút ngắn nhiều thời gian phân tích tính trạng tới hàng trăm, hàng nghìn lần Nghiên cứu tính đa hình di truyền hemoglobin, protein, huyết máu, protein sữa enzym máu quan… đƣợc tiến hành từ lâu Năm 1955, Smithies O chứng minh tính đa dạng di truyền protein huyết máu động vật Ông dùng hai phƣơng pháp là: Phƣơng pháp miễn dịch học phát nhóm globin, lipoprotein…và phƣơng pháp miễn dịch học phát hemoglobin, haptoglobin, transferin Nhiều nhà nghiên cứu sau sử dụng phƣơng pháp điện di giấy, gel tinh bột, gel agarose, gel polyacrylamide…để xác định tính đa hình hemoglobin, protein máu, mô quan, sữa, trứng enzym máu, dịch thể Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 11 Protein huyết máu hỗn hợp chất khác Ngƣời ta sâu chứng minh vai trò quan trọng tiểu phần huyết với trình trao đổi chất liên quan chúng với tiêu kinh tế khác 1.3.3 Thành phần protein huyết gia súc số động vật Tùy theo phƣơng pháp xác định thành phần protein huyết mà ta đƣợc số tiểu phần (cấu tử) khác Phƣơng pháp điện di giấy tách protein huyết bò, lợn đƣợc bốn tiểu phần chính; Anbumin tiểu phần chạy nhanh phía cực dƣơng, tiểu phần αglobulin, βglobulin, γglobulin Về thành phần protein huyết lợn, gà, cá số động vật nuôi khác điện di giấy đƣợc tiểu phần anbumin, αglobulin, βglobulin, γglobulin Khi phân tích protein huyết gel tinh bột thủy phân, gel polyacrylamide…số cấu tử lớn tiểu phần giấy đƣợc tách nhiều phần nhỏ nhƣ tiền anbumin, anbumin, hậu anbumin, α1globulin, α2globulin βglobulin, γ1globulin, γ2globulin… Anbumin nguyên liệu xây dựng tế bào, anbumin huyết đóng vai trò giữ áp lực thẩm thấu keo, vận chuyển liên kết axít béo, vitamin… Anbumin liên quan đến số tính trạng kinh tế nhƣ lợn sinh trƣởng nhanh, tỷ lệ nạc cao chúng có hàm lƣợng anbumin cao αglobulin hàm lƣợng thấp so với tổng lƣợng protein huyết nhƣng chúng có vai trò quan trọng liên kết với gluxit, lipit để tạo lipoprotein, glucoprotein Đồng thời, chúng tham gia vận chuyển cholestron Khi dùng thạch, tinh bột tách đƣợc phần α1globulin, α2globulin α2globulin đƣợc quan tâm nhiều chứa haptoglobin, liên quan đến hàm lƣợng mỡ sữa tích lũy mỡ sữa động vật Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... các giống mới đáp ứng đƣợc các nhu cầu thị trƣờng hiện nay Vì vậy chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D- loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa" 2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà - Xác định mối quan hệ di truyền của ba đại diện của ba giống gà - Phân tích đa hình protein. .. đó, đánh giá sơ bộ về sự khác biệt di truyền giữa ba đại diện của ba giống gà nói trên Từ đó cung cấp d liệu ban đầu cho các nghiên cứu về đa d ng di truyền và cải tạo giống gà bằng Công nghệ gen và Công nghệ tế bào - D ng phƣơng pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà nói trên Số hóa bởi Trung tâm... protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 3 Nội dung nghiên cứu - Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mô máu của gà Ri, gà Mông, và gà Đa cựa - Phân lập vùng D- Loop của hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR - Xác định trình tự vùng D- Loop và so sánh với trình tự tham khảo đã đƣợc công bố trên Ngân hàng trình tự gen... thuộc hệ gen của cơ thể sinh vật và sự tƣơng tác giữa các gen với môi trƣờng phân tích đa hình protein huyết thanh của các giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng của các giống gà thí nghiệm, so sánh trình tự đoạn D- loop của các giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà, đó là một việc làm cần thiết nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo... tốt đặc biệt là một số giống gà còn có giá trị d ợc liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe của con ngƣời Gà Ri của ta, gà của ngƣời H 'Mông là một trong những giống gà có phẩm chất quý đó .Và một giống gà hiện đƣợc rất nhiều ngƣời quan tâm về phẩm chất, tác d ng của nó đó là gà Đa cựa Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi d a vào những đặc điểm hình thái còn d a vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh... http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.1.1 Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà Các giống gà hiện nay đƣợc hình thành từ quá trình lai tạo, tiến hóa lâu d i và phức tạp của 4 loại hình sau của gà rừng - Gallus Bankiva: Phân bố ở Miến Điện, Đông D ơng và Philippin - Gallus Soneratii: Phân bố ở Tây và. .. 4 đôi hệ đệm Nghiên cứu về hệ đệm của máu là cơ sở để sử d ng các dung d ch đệm trong điện di huyết thanh và hemoglobin cho phù hợp với pH của nó Trong điện di ngƣời ta sử d ng các dung d ch đệm khác nhau phù hợp với từng đối tƣợng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 1.3.2 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết thanh máu Trong những... nhọn, màu sắc lông đa d ng Gà Mông thích nghi tốt với điều kiện thời tiết khí hậu, d ch bệnh, phẩm chất thịt ngon, ít mỡ, giàu dinh d ỡng Tuy nhiên gà Mông thƣờng nuôi con và chăm sóc con kém hơn gà Ri [7] Gà Mông không những là món ăn ngon, bổ mà còn có giá trị d ợc liệu cao, rất tốt cho những ngƣời bị bệnh tim mạch Đồng bào ngƣời Mông d ng xƣơng, thịt của gà Mông nhƣ một loại thuốc bồi d ỡng sức khỏe... ta nằm giữa hai d y núi Ba Vì và Tam Đảo Gà nuôi lúc bấy giờ tầm vóc còn bé, khả năng sinh sản thấp và đó chính là tổ tiên giống gà hiện nay Trải qua thời kì d i làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo sở thích và điều kiện khí hậu, đất đai, trình độ canh tác, tập quán tổ tiên ta đã tạo nên các giống gà khác nhau mà cho đến ngày nay vẫn tồn tại và phát triển nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà Hồ, gà Tre 1.1.2 Một... http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà của ta bắt nguồn từ gà rừng Gallus bankiva hay còn có tên là Gallus gallus Cách đây khoảng 3000 năm từ giống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian d i nhân d n ta đã tạo ra đƣợc nhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, và gà Ri đƣợc phân bố rất rộng rãi Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà ở nƣớc