Đang tải... (xem toàn văn)
So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển d-loop của ba giống gà ri gà mông và gà sao nuôi tại thái nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------- -------- BÙI THỊ KIỀU VÂN SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------- -------- BÙI THỊ KIỀU VÂN SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới tới PGS.TS. Nguyễn Trọng Lạng, giảng viên khoa sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, PGS.TS. Nông Văn Hải, Phó Viện trưởng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Trong thời gian hoc tập và nghiên cứu vừa qua, tôi đón nhận được sự giúp đỡ hết lòng, chỉ bảo tận tình và sâu sắc của CN. Địch Thị Kim Hương, ThS.NCS. Nguyễn Đăng Tôn cùng tập thể các cô, chú, anh, chị cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam những người đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi và nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi rất cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và các thầy, cô giáo, kỹ thuật viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã ủng hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn tới Ths. Ngôn Thị Hoán, giảng viên chính khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong việc nghiên cứu thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ tình cảm của mình bằng lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn dành cho tôi những tình cảm nồng ấm, thân thương nhất trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008 BÙI THỊ KIỀU VÂN MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu của đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu . 2 Chƣơng I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM 3 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 4 1.2.1. Gà Ri . 4 1.2.2. Gà Mông . 4 1.2.3. Gà Sao 5 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI . 6 1.3.1. Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng . .6 1.3.2. Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể .8 1.3.2.1. Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể . .8 1.3.2.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà .9 1.3.2.3. Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà 12 1.3.2.4. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới . 12 13.2.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam 15 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17 2.1. VẬT LIỆU . 17 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 17 2.2.1. Hóa chất 17 2.1.2. Thiết bị 18 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 19 2.3.1. Các phƣơng pháp hóa sinh 19 2.3.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ 19 2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng vật chất khô . 19 2.3.1.3. Định lượng lipid tổng số 19 2.3.1.4. Định lượng Protein. 20 2.3.1.5. Phương pháp xử lý số liệu 21 2.3.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử . 22 2.3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật . 22 2.3.2.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose 23 2.3.2.3. Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR 24 2.3.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen . 26 2.3.2.5. Phương pháp xác định trình tự DNA 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1. SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ 29 3.1.1. Tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ tƣơi 29 3.1.2. Hàm lƣợng vật chất khô . 30 3.1.3. Hàm lƣợng lipit tổng số . 31 3.1.4. Hàm lƣợng protein tổng số . 32 3.2 . ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ . 34 3.2.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 34 3.2.2. Nhân đoạn trình tự của vùng D-loop của DNA ty thể 36 3.2.3. Tách dòng và xác định trình tự vùng D- loop của DNA ty thể . 39 3.2.3.1. Tách dòng vùng D-loop . 39 3.3.2.2. Xác định trình tự vùng D-loop của DNA ty thể . 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 Kết luận. . 51 Đề nghị 52 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 53 PHỤ LỤC 57 BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Amp Ampicilline bp Base pair (cặp bazơ) ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate dNTP Deoxynucleotide triphosphate DNA Deoxyribo Nucleic Axit D-loop Displacement loop E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Epp Eppenđorf EtBr Ethidium Bromide EtOH Ethanol (cồn) IPTG Isopropyl thio-β-D- galactoside kb Kilo base LB Luria - Bertani mtDNA DNA ty thể (mitochondrial DNA) NADH Nicotinamide adenine dinucleotide PBS Phosphate - buffer saline PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleaxit RNase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris-Acetate-EDTA TE Tris EDTA Tm Melting Temperature (nhiệt độ nóng chảy) v/p vòng/phút Danh mục các bảng Bng 1.1. S khỏc nhau gia mó di truyn trong nhõn v ngoi ty th . 11 Bng 2.1. Cỏc thit b s dng trong ti 18 Bng 2.2. Thnh phn phn ng khuch i gen . 25 Bng 3.1. T l lũng , lũng trng, v ti . 29 Bng 3.2. Hm lng vt cht khụ trong trng g 30 Bng 3.3. Hm lng lipid tng s tht g thớ nghim 31 Bng 3.4. Hm lng protein thụ trong trng g thớ nghim 33 Bng 3.5. Thng kờ cỏc im a hỡnh 2 mu nghiờn cu so vi trỡnh t tham kho mó s AB268515 49 Bng 3.6. So sỏnh t l sai khỏc trỡnh t nucleotide ca mt s ging g . 50 Danh mục các hình Hỡnh 1.1. S t chc ca DNA ty th G 10 Hỡnh 2.1. S vector tỏch dũng pJET1/blunt 26 Hỡnh 3.1. Biu biu din t l lũng , lũng trng ca trng g 29 Hỡnh 3.2. Biu biu din hm lng vt cht khụ ca trng g 30 Hỡnh 3.3. Biu biu din hm lng lipid tng s trng g thớ nghim 32 Hỡnh 3.4. Biu biu din hm lng protein thụ trong tht g thớ nghim . 33 Hỡnh 3.5. nh kt qu in di DNA tng s 36 Hỡnh 3.6. nh kt qu in di sn phm PCR . 39 Hỡnh 3.7. nh in di mt s DNA plasmid trờn gel agarose 0,8% . 42 Hỡnh 3.8. nh kt qu kim tra plasmid tỏi t hp bng XhoI v XbaI . 44 Hỡnh 3.9. So sỏnh trỡnh t D-loop ca hai mu nghiờn cu Ri (Rhy), Mụng (Mna) vi trỡnh t tham kho mó s AB268515 48 Hỡnh 3.10. Quan h di truyn ca mt s ging g 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây ngành chăn nuôi gia cầm nước ta phát triển nhanh, đạt được những tiến bộ rõ rệt, số lượng đầu gia cầm cũng như sản lượng thịt, trứng của ngành tăng hàng năm. Theo Hoàng Kim Giao và Nguyễn Thanh Sơn (Cục chăn nuôi - Bộ nông nghiệp: Thông tin Hiệp hội chăn nuôi gia cầm Việt Nam - 2005) trong những năm gần đây tốc độ tăng đầu con của đàn gia cầm từ năm 1990 đến năm 2000 là 5%/năm, năm 2002 là 6,69%, năm 2003 là 8,9%. Tổng đàn gia cầm trong cả nước 254,057 triệu con năm 2003, sản lượng trứng 4,85 tỷ quả năm 2003. Bên cạnh việc phát triển các giống gà nhập nội có năng suất cao như gà Lergho, Lương Phượng, Lương Phượng Sasso, gà Brow nick, Tam hoàng . thì việc bảo tồn và phát triển các giống gà nội có khả năng thích ứng tốt với điều kiện chăn nuôi của địa phương, chất lượng thịt, trứng tốt như gà Đông Tảo, gà Ác, gà Tè, gà Ri, gà Mông, gà Mía, gà Tre, gà Hồ, gà Tàu vàng, gà Móng, gà Chọi . cũng đang được quan tâm. Gần đây việc nhập nội các giống gà có năng suất cao, chất lượng thịt, trứng tốt, có khả năng thích ứng cao với điều kiện chăn nuôi ở địa phương như gà Sao, gà Ai cập cũng đã và đang thu hút sự chú ý của người nông dân. Việc đánh giá chất lượng trứng, thịt cũng như tìm hiểu sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà trên là cần thiết cho ngành chọn giống gia cầm. Hiện nay đã có các công trình nghiên cứu về thành phần hóa sinh trứng gà Ri, gà Ác, Lergho . [5], [9], [10], [27], [32], [36]. Xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên cứu vùng điều khiển D-loop ty thể trên thế giới được chú ý từ những năm 1990 và đang phát triển rộng rãi. Ở Việt Nam các xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử ở gà qua các nghiên cứu liên quan đến vùng điều khiển D-loop Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 mới bắt đầu từ những năm 1999 trên đối tượng gà lôi [4]. Đến nay việc giải trình tự nucleotide vùng D-loop để đánh giá mức đa dạng di truyền đang được quan tâm. Hiện nay TS. Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội" trong đó có giống gà Mông và gà Ri. Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn này chúng tôi lựa chọn đề tài: " So sánh thành phần hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi tại Thái Nguyên". 2. Mục tiêu của đề tài - So sánh chất lượng trứng của ba giống gà. - So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà. - Xác định mối quan hệ di truyền của một số giống gà. 3. Nội dung nghiên cứu - Xác định các chỉ tiêu hóa sinh trứng: Hàm lượng vật chất khô; tỷ lệ lòng trắng; lòng đỏ; hàm lượng lipit; protein. - Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên. - Nhân toàn bộ vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR. - Tạo dòng phân tử vùng D-loop. - Phân tích, so sánh trình tự vùng D-loop gen ty thể với trình tự đã được công bố trong ngân hàng genbank. - Vẽ cây phát sinh về mối quan hệ di truyền của một số giống gà. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. NGUỒN GỐC GIA CẦM Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết luận rằng: Gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus. Gà rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa. Cơ sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về mặt hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập tính hoạt động. Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu: Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, ức nở, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn. Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ. Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu đỏ, mỏ tương đối ngắn. Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay. Theo Nguyễn Ân (1983) [1] và nhiều tác giả đã sắp xếp vị trí của gà nhà trong hệ thống giới động vật như sau: Giới động vật (Animal); Ngành động vật có xương sống (Chordata); Lớp chim (Aves); Bộ gà (Galliformes); Họ Trĩ (Fasia nidea); Chủng Gallus; Loài Gallus gallus. Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba Tư. Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước Anh, sau đó là nước Mỹ, các giống gà được lai tạo thành nhiều giống gà có năng suất cao hơn. Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo, gà Vàng…. [...]... giống gà nội" trong đó có giống gà Mông và gà Ri Đến nay, chưa có công bố về trình tự vùng D-loop gà Ri và gà Sao Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiếp tục so sánh thành phần hóa sinh trứng qua hàm lượng protein, lipit, vật chất khô và xác định trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba mẫu giống gà: gà Ri, gà Mông Nghệ An và gà Sao Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... biệt trên vùng điều khiển mtDNA của 3 loài gà lôi Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà lôi nói trên Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [2] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop Năm... định được trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA Kết quả nhận được đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm đặc trưng của giống Gallus Randi và cộng sự [16]; Scott [20] phân tích trình tự của một phần đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này Năm... LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU Vật liệu nghiên cứu là mẫu trứng, máu của các giống gà: - Gà Ri Hưng Yên (Rhy): Lông vàng, da vàng, chân vàng - Gà Mông Nghệ An (Mna): Lông trắng, xương đen, thịt đen - Gà Sao dòng trung (Sdt): Lông xám đen điểm các đốm trắng tròn nhỏ Các giống gà trên được nuôi thử nghiệm trong trại giống gà của trường ĐHNL Thái Nguyên theo dự án gà sạch 2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT... Thị Kim Hương và cộng sự [3] đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucloetide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lương Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucloetide giữa hai đại diện Năm 2007 Lê Đức Long và cộng sự [4] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... cytochromb, điều này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại - Zhang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nuleotide đầu tiên trong vùng D-loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố trong Ngân hàng Số hóa bởi... suất trứng thấp, chất lượng trứng tốt, thơm ngon được nhiều người ưa thích Gà Mông nuôi tại huyện Trạm Tấu tỉnh Yên Bái có tuổi thành thục muộn, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5 gà trống đạp mái lúc 157,20 ngày tuổi; gà mái đẻ trứng lúc 177,65 ngày tuổi Gà mái đẻ ít và thưa, số trứng/ mái/lứa là 13,65 quả, khoảng cách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày Trứng gà Mông. .. trong loài và giữa các quần thể địa lý 1.3.2.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam Ở gà Ri và gà Mông đã có một số công trình nghiên cứu được công bố về năng suất phẩm chất, thành phần hóa sinh trứng [5] Ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về gà Sao mới chỉ tập vào các lĩnh vực khả năng sinh trưởng, năng suất, phẩm chất thịt, thành phần hóa sinh thịt, khả năng sinh sản, năng suất trứng Hiện... Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này Hiện nay TS Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội"... trong nhân và ngoài ty thể Bộ ba Mã của gen nhân Mã của gen ty thể AUA, AUU Ile Met UGA Stop Trp AGA, AGG Arg Stop DNA ty thể và vai trò của vùng D-loop trong vấn đề định loại gà Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn theo Baker và Marshall (1997), bao gồm các đoạn I, II và III Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng . VÂN SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI, GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: DI. cứu của luận văn này chúng tôi lựa chọn đề tài: " So sánh thành phần hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của ba giống gà Ri, gà Mông và