So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển d-loop của ba giống gà ri gà mông và gà sao nuôi tại thái nguyên

So sánh đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển d-loop của ba giống gà ri gà mông và gà sao nuôi tại thái nguyên

BÙI THỊ KIỀU VÂN

SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI,

GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2008

BÙI THỊ KIỀU VÂN

SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP CỦA BA GIỐNG GÀ RI,

GÀ MÔNG VÀ GÀ SAO NUÔI TẠI THÁI NGUYÊN

Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng

THÁI NGUYÊN - 2008

PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng, giảng viên khoa sinh - KTNN trường Đại học

Sư phạm Thái Nguyên, PGS.TS Nông Văn Hải, Phó Viện trưởng, Viện Công

nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người thầy đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Trong thời gian hoc tập và nghiên cứu vừa qua, tôi đón nhận được sự

giúp đỡ hết lòng, chỉ bảo tận tình và sâu sắc của CN Địch Thị Kim Hương,

ThS.NCS Nguyễn Đăng Tôn cùng tập thể các cô, chú, anh, chị cán bộ

nghiên cứu Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam những người đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi và nhiệt tình hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu Tôi rất cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và các thầy, cô giáo, kỹ thuật viên khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã ủng hộ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cho phép tôi được tỏ lòng biết ơn tới Ths Ngôn Thị Hoán, giảng viên

chính khoa Chăn nuôi - Thú y trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong việc nghiên cứu thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ tình cảm của mình bằng lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn dành cho tôi những tình cảm nồng ấm, thân thương nhất trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2008

BÙI THỊ KIỀU VÂN

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 6

1.3.1 Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng 6

1.3.2 Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể .8

1.3.2.1 Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể 8

1.3.2.2 Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà .9

1.3.2.3 Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà 12

1.3.2.4 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới 12

13.2.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 VẬT LIỆU 17

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 17

2.2.1 Hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.3.1 Các phương pháp hóa sinh 19

2.3.1.1 Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ 19

2.3.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng vật chất khô 19

2.3.1.5 Phương pháp xử lý số liệu 21

2.3.2 Các phương pháp sinh học phân tử 22

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật 22

2.3.2.2 Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose 23

2.3.2.3 Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR 24

2.3.2.4 Kĩ thuật tách dòng gen 26

2.3.2.5 Phương pháp xác định trình tự DNA 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH TRỨNG CỦA 3 GIỐNG GÀ 29

3.1.1 Tỷ lệ lòng trắng, lòng đỏ, vỏ tươi 29

3.1.2 Hàm lượng vật chất khô 30

3.1.3 Hàm lượng lipit tổng số 31

3.1.4 Hàm lượng protein tổng số 32

3.2 ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ 34

3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà 34

3.2.2 Nhân đoạn trình tự của vùng D-loop của DNA ty thể 36

3.2.3 Tách dòng và xác định trình tự vùng D- loop của DNA ty thể 39

bp Base pair (cặp bazơ)

ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate

dNTP Deoxynucleotide triphosphate

DNA Deoxyribo Nucleic Axit

D-loop Displacement loop

E.coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

mtDNA DNA ty thể (mitochondrial DNA)

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

PBS Phosphate - buffer saline

PCR Polymerase Chain Reaction

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài 18

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng khuếch đại gen 25

Bảng 3.1 Tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng, vỏ tươi 29

Bảng 3.2 Hàm lượng vật chất khô trong trứng gà 30

Bảng 3.3 Hàm lượng lipid tổng số ở thịt gà thí nghiệm 31

Bảng 3.4 Hàm lượng protein thô trong trứng gà thí nghiệm 33

Bảng 3.5 Thống kê các điểm đa hình ở 2 mẫu nghiên cứu so với trình tự tham khảomã số AB268515 49

Bảng 3.6 So sánh tỷ lệ sai khác trình tự nucleotide của một số giống gà 50

Danh môc c¸c h×nh Hình 1.1 Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà 10

Hình 2.1 Sơ đồ vector tách dòng pJET1/blunt 26

Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ lòng đỏ, lòng trắng của trứng gà 29

Hình 3.2 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng vật chất khô của trứng gà 30

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng lipid tổng số ở trứng gà thí nghiệm 32

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein thô trong thịt gà thí nghiệm 33

Hình 3.5 Ảnh kết quả điện di DNA tổng số 36

Hình 3.6 Ảnh kết quả điện di sản phẩm PCR 39

Hình 3.7 Ảnh điện di một số DNA plasmid trên gel agarose 0,8% 42

Hình 3.8 Ảnhkết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI 44

Hình 3.9 So sánh trình tự D-loop của hai mẫu nghiên cứu Ri (Rhy), Mông (Mna) với trình tự tham khảo mã số AB268515 48

Hình 3.10 Quan hệ di truyền của một số giống gà 50

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm gần đây ngành chăn nuôi gia cầm nước ta phát triển nhanh, đạt được những tiến bộ rõ rệt, số lượng đầu gia cầm cũng như sản lượng thịt, trứng của ngành tăng hàng năm Theo Hoàng Kim Giao và Nguyễn Thanh Sơn (Cục chăn nuôi - Bộ nông nghiệp: Thông tin Hiệp hội chăn nuôi gia cầm Việt Nam - 2005) trong những năm gần đây tốc độ tăng đầu con của đàn gia cầm từ năm 1990 đến năm 2000 là 5%/năm, năm 2002 là 6,69%, năm 2003 là 8,9% Tổng đàn gia cầm trong cả nước 254,057 triệu con năm 2003, sản lượng trứng 4,85 tỷ quả năm 2003

Bên cạnh việc phát triển các giống gà nhập nội có năng suất cao như gà Lergho, Lương Phượng, Lương Phượng Sasso, gà Brow nick, Tam hoàng thì việc bảo tồn và phát triển các giống gà nội có khả năng thích ứng tốt với điều kiện chăn nuôi của địa phương, chất lượng thịt, trứng tốt như gà Đông Tảo, gà Ác, gà Tè, gà Ri, gà Mông, gà Mía, gà Tre, gà Hồ, gà Tàu vàng, gà Móng, gà Chọi cũng đang được quan tâm Gần đây việc nhập nội các giống gà có năng suất cao, chất lượng thịt, trứng tốt, có khả năng thích ứng cao với điều kiện chăn nuôi ở địa phương như gà Sao, gà Ai cập cũng đã và đang thu hút sự chú ý của người nông dân

Việc đánh giá chất lượng trứng, thịt cũng như tìm hiểu sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà trên là cần thiết cho ngành chọn giống gia cầm Hiện nay đã có các công trình nghiên cứu về thành phần hóa sinh trứng gà Ri, gà Ác, Lergho [5], [9], [10], [27], [32], [36]

Xác định sự đa dạng di truyền ở mức phân tử của các giống gà qua nghiên cứu vùng điều khiển D-loop ty thể trên thế giới được chú ý từ những năm 1990 và đang phát triển rộng rãi Ở Việt Nam các xác định đa dạng di truyền ở mức phân tử ở gà qua các nghiên cứu liên quan đến vùng điều khiển D-loop

mới bắt đầu từ những năm 1999 trên đối tượng gà lôi [4] Đến nay việc giải trình tự nucleotide vùng D-loop để đánh giá mức đa dạng di truyền đang được quan tâm Hiện nay TS Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội" trong đó có giống gà Mông và gà Ri

Trong phạm vi nghiên cứu của luận văn này chúng tôi lựa chọn đề tài: " So

sánh thành phần hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển D-Loop của ba giống gà Ri, gà Mông và gà Sao nuôi tại Thái Nguyên"

2 Mục tiêu của đề tài

- So sánh chất lượng trứng của ba giống gà

- So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà - Xác định mối quan hệ di truyền của một số giống gà

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định các chỉ tiêu hóa sinh trứng: Hàm lượng vật chất khô; tỷ lệ lòng trắng; lòng đỏ; hàm lượng lipit; protein

- Tách DNA tổng số từ máu của các giống gà trên - Nhân toàn bộ vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR - Tạo dòng phân tử vùng D-loop

- Phân tích, so sánh trình tự vùng D-loop gen ty thể với trình tự đã được công bố trong ngân hàng genbank

- Vẽ cây phát sinh về mối quan hệ di truyền của một số giống gà

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 NGUỒN GỐC GIA CẦM

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về nguồn gốc gia cầm và đưa ra kết luận rằng: Gà nhà hiện nay có chung nguồn gốc từ gà rừng Gallus gallus Gà rừng có thân hình nhỏ bé, đẻ dồn theo mùa, trứng bé, có khả năng bay xa Cơ sở của kết luận trên là gà nhà có nhiều đặc điểm giống gà rừng về mặt hình thái đến cấu tạo giải phẫu các bộ phận bên trong cơ thể, tiếng gáy, tập tính hoạt động

Theo loại hình gà có thể chia thành 3 kiểu: Kiểu Bakira (gà nguyên thuỷ): nhiều lông, ức nở, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn Kiểu Malaysia (gà chọi): ít lông và cứng, mào và dái tai nhỏ, đầu nhỏ, mắt lõm vào hốc mắt, mỏ ngắn khoẻ Kiểu Cochin: nhiều lông bồng, lông tơ, mào và dái tai vừa, tai nhỏ màu đỏ, mỏ tương đối ngắn Từ 3 loại hình trên, người ta chọn lọc, dần dần hình thành nên các giống gà chuyên thịt, chuyên trứng hay kiêm dụng ngày nay

Theo Nguyễn Ân (1983) [1] và nhiều tác giả đã sắp xếp vị trí của gà nhà trong hệ thống giới động vật như sau: Giới động vật (Animal); Ngành động vật có xương sống (Chordata); Lớp chim (Aves); Bộ gà (Galliformes); Họ Trĩ (Fasia nidea); Chủng Gallus; Loài Gallus gallus

Gà được thuần hoá đầu tiên ở Ấn Độ cách đây 5000 năm, sau đó là Ba Tư Nhờ sự tiến bộ trong công tác chọn giống, từ các giống gà địa phương của châu Á, sau khi nhập vào châu Âu thế kỷ XVIII và XIX, đầu tiên là ở nước Anh, sau đó là nước Mỹ, các giống gà được lai tạo thành nhiều giống gà có năng suất cao hơn Ở nước ta, gà rừng được thuần hoá và nuôi sớm nhất ở vùng Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Tây… Từ giống gà nuôi ban đầu là tiền thân của gà Ri hiện nay nhân dân ta đã tạo được nhiều giống gà: gà Mía, gà Ác, gà Ri, gà Tre, gà Đông Tảo, gà Vàng…

1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BA GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU

1.2.1 Gà Ri

Gà Ri là giống gà nội phổ biến nhất ở nước ta, chiếm 70% tổng số gà trong

cả nước, nguồn gốc từ nhóm gà rừng Gallus bankiva hay Gallus gallus Ngoại

hình thon, nhỏ; mỏ nhỏ; mào cờ có răng cưa mào đỏ tươi rất phát triển ở con trống; tích và dái tai có xen lẫn ánh bạc trắng; cổ thanh, dài vừa phải ngực lép bụng thon, mềm; chân có hai hàng vải màu vàng, có khi xen lẫn màu đỏ tươi Bàn chân có bốn ngón, cựa phát triển sớm ở gà trống Màu lông rất khác nhau phổ biến ở con mái có màu vàng rơm, vàng đất, nâu nhạt và đốm Con trống màu lông đỏ sẫm, ở đầu lông cánh và lông đuôi có màu đen ánh xanh, lông bụng đỏ nhạt hoặc vàng đất Ngoài ra còn màu lông khác như trắng, hoa mơ, đốm trắng [1] Gà Ri mọc lông sớm, tốc độ mọc lông nhanh hơn gà Mía, Đông Tảo nên có khả năng chịu đựng tốt hơn khi nuôi ở điều kiện thời tiết lạnh, gà Ri đẻ trứng sớm, tuổi đẻ đầu lúc 123 ngày tuổi và đạt tỷ lệ đẻ 5% lúc 127 ngày tuổi Sản lượng trứng 90 - 115 quả/năm, con trống nặng 1,5 đến 2kg, con mái nặng 1,1 đến 1,6 kg Gà Ri ham ấp bóng đẻ được 10 - 15 quả lại đòi ấp, khối lượng trung bình 36 – 45g/quả gà có chất lượng trứng, thịt tốt

1.2.2 Gà Mông

Theo Nguyễn Văn Trụ, 2000 [12] cho biết gà Mông phân bố ở vùng núi phía Bắc với số lượng không nhiều và đang có nguy cơ bị lai tạp, mất dần Từ năm 1999 đề án “Bảo tồn quỹ gen Việt Nam 1999 - 2002” và dự án “Bảo tồn các giống vật nuôi có gen quý hiếm 2000 - 2001” đã đưa giống gà này vào bảo tồn tại Sơn La và Hà Nội Gà Mông trưởng thành có hình dạng cân đối, vững chắc, nhanh nhẹn, chân cao màu đen Màu sắc lông đa dạng, màu da đen, thịt đen chiếm 90%, sức kháng bệnh cao, khả năng sinh sản thấp Năng suất trứng thấp, chất lượng trứng tốt, thơm ngon được nhiều người ưa thích Gà Mông nuôi tại huyện Trạm Tấu tỉnh Yên Bái có tuổi thành thục muộn,

gà trống đạp mái lúc 157,20 ngày tuổi; gà mái đẻ trứng lúc 177,65 ngày tuổi Gà mái đẻ ít và thưa, số trứng/mái/lứa là 13,65 quả, khoảng cách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày Trứng gà Mông có khối lượng ở mức trung bình với 44,04g, chỉ số hình thái là 76,23%, chỉ số Haugh 105,90 Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng là 12,41 Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01%, lòng đỏ trứng có tỷ lệ lipit khá cao 26,94% ,[17]

thích ứng tốt với điều kiện sinh thái Việt Nam [14]

Ở 1 ngày tuổi, gà Sao có bộ lông màu cánh sẻ, có những đường kẻ sọc chạy dài từ đầu đến cuối thân Mỏ và chân màu hồng, chân có 4 ngón và có 2 hàng vẩy Giai đoạn trưởng thành gà Sao có bộ lông màu xám đen, trên phiến lông điểm nhiều những nốt chấm trắng tròn nhỏ Thân hình thoi, lưng hơi gù, đuôi cúp Đầu không có mào mà thay vào đó là mấu song cao khoảng 1,5 - 2 cm Mào tích của gà Sao màu trắng hồng và có 2 loại: một loại hình lá dẹt áp sát vào cổ, còn một loại hình lá hoa đá rủ xuống Da mặt và cổ của gà Sao không có lông, lớp da trần này có màu xanh da trời, dưới cổ có yếm thịt mỏng Chân khô, đặc biệt con trống không có cựa

Gà Sao thuộc loài nhút nhát, cảnh giác, bay giỏi như chim, rất ít mổ, cắn nhau, thích mổ những vật lạ Đặc biệt là có tập tính bày đàn cao; không bộc lộ tập tính sinh dục rõ ràng, gà Sao mái đẻ trứng tập trung Gà bắt đầu đẻ vào tuần tuổi thứ 27 và đạt tỷ lệ đẻ 5% ở tuần tuổi thứ 30 khi cơ thể đạt khối lượng khoảng 2,2-2,3 kg Tuổi đẻ đạt đỉnh cao là 34-40 tuần tuổi Năng suất trứng/mái/23 tuần đẻ là 85-100 quả

1.3 CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1 Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng

Theo H Brandsch và H Bichel một số tính trạng thuộc về đặc điểm sinh học như màu lông, màu sắc vỏ trứng, hình dáng cơ thể, thành phần các loại protein, lipit trong trứng, thịt thuộc các tính trạng chất lượng

Chất lượng lòng trắng

Tỷ lệ lòng trắng chiếm 55 - 60% khối lượng trứng nếu nhìn bằng mắt thường những trứng tươi sẽ có lòng trắng màu hơi vàng, những trứng để lâu màu lòng trắng sáng hơn

Theo Rose [27]; Krax [34] và Pingel [35] cấu trúc lòng trắng được chia ra làm 3 lớp đó là: Lớp lòng trắng loãng bên ngoài 23%, Lớp lòng trắng đặc ở giữa 57%, Lớp lòng trắng loãng trong cùng 20%

Độ quánh của lòng trắng đặc (chủ yếu là sợi mucin) giảm đi theo tuổi gia cầm Tỷ lệ lòng trắng đặc và lòng trắng loãng ở trứng gà tươi là 2:1, tỷ lệ này giảm dần theo thời gian bảo quản có khi xuống tới tỷ lệ 1: 1 Lòng trắng trứng có tác dụng hấp thụ cũng như cung cấp các chất dinh dưỡng cho phôi Chiều cao lòng trắng đặc là một chỉ tiêu đánh giá chất lượng bên trong của trứng

Chất lượng lòng đỏ

Lòng đỏ trứng là một tế bào khổng lồ được bao bọc bởi một lớp màng, đây cũng là nguồn dinh dưỡng dự trữ của phôi Tỷ lệ lòng đỏ chiếm 30 đến 33% khối lượng trứng và có đường kính khoảng 30 đến 35mm Lòng đỏ trứng có cấu tạo như sau: Lớp màng dày dày 6 - 11 µm; đĩa phôi màu trắng sáng có đường kính 3mm Để đánh giá chất lượng lòng đỏ người ta dùng chỉ số lòng đỏ Chỉ số này được xác định bằng tỷ lệ giữa chiều cao lòng đỏ so với đường kính lòng đỏ Kết quả nghiên cứu trên gà Ri của Nguyễn Hoài Tao và cs [10], Nguyễn Văn Thạch [11] cho biết chỉ số lòng đỏ trứng là 0,43 Chỉ số lòng đỏ ở gà xương đen Thái Hòa Trung Quốc là 0,46 Vũ Quang Ninh [7]

Thành phần hóa học của trứng

Trứng gia cầm nói chung và trứng gà nói riêng là một loại thực phẩm rất giàu dinh dưỡng, đặc biệt là lòng đỏ cung cấp khoảng 50% protein Thành phần dinh dưỡng của trứng các loại gia cầm khác nhau thì khác nhau Protein trong trứng thường là những protein dễ tiêu hóa Hàm lượng mỡ trong trứng ở dạng nhũ hóa và dễ tiêu hóa và có chứa hàm lượng acid béo không no rất cao, hàm lượng khoáng cao, đặc biệt là hàm lượng sắt và phospho Thành phần khoáng trong trứng có thể thay đổi thông qua khẩu phần ăn của gia cầm đẻ Rose [27] Theo Gilbert [16] trong một lòng đỏ trứng có khối lượng 19g có chứa: 10,5mg natrium; 17,9mg kalium; 25,7mg calcium; 2,6mg magecium; 1,5mg sắt; 29,8mg lưu huỳnh; 24,7mg clo; 98,4mg phospho Hàm lượng vitamin trong trứng cao: 200-800UI vitamin A; 20UI vitamin D; 49µg vitamin B1; 84µg vitaminB2;30µg acid nicotinic; 58 µg vitaminB6; 580µg acid pantothenic; 10µg biotin; 4,5µg acid folic; 0,3µg vitamin B12; 150µg vitamin E; 25µg vitamin K1

* Thành phần hóa học của lòng trắng

Lòng trắng là nơi dự trữ khoảng 88% nước của trứng Rose [27]; Vogt [36] phần còn lại là protein như globulin, ovomucin và albumin Ovomucin chiếm 75% tổng protein trong lòng trắng Globulin chiếm khoảng 20% Thành phần hóa học lòng trắng trứng ở tất cả các loại trứng gia cầm đều giống nhau Lòng trắng đặc có hàm lượng ovomucin gấp 4 lần lòng trắng loãng, đây chính là nguyên nhân tạo nên cấu trúc keo của lòng trắng Độ pH của lòng trắng trứng gà tươi là 7,6; sau 14 ngày bảo quản chúng có thể tăng lên 9,2 Rose [27] Và Hartfiel [33]

*Thành phần hóa học của lòng đỏ

Lòng đỏ trứng gà có chứa 49% nước, 16% protein và 33% mỡ Hai phần ba mỡ trong lòng đỏ là triglicerit; 30% phospholipit và 5% cholesteron Hàm

lượng nước trong lòng đỏ có thể thay đổi từ 46 -50% tùy thuộc vào thời gian và điều kiện bảo quản Hàm lượng mỡ trong lòng đỏ trứng cũng có thể thay đổi theo khẩu phần ăn, chỉ riêng thành phần acid béo không no như palmitin và acid stearic là không thay đổi Hàm lượng acid béo này duy trì ở mức 30-38% trong tổng số chất béo Nếu khẩu phần ăn chứa nhiều acid béo không no mạch đa (PolyUnsaturated Fatty Acid - PUFA) hàm lượng acid béo không no mạch đa trong mỡ trứng cũng tăng lên Rose [27] Theo Creger [32] trong một trứng gà nặng 54g có chứa các acid béo không no là: 2,1g acid béo olêic; 1,2g linoleic; 0,16g linolenic; 0,13g arachidonic và các acid béo no là: 1,3g palmitinic; 0,4g stearic; ngoài ra còn có khoảng 0,2g lipoid khác Do vậy tổng acid béo lên tới 5,5g Thông thường tỷ lệ acid béo không no và no là 2:1

1.3.2 Phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop) ty thể

1.3.2.1 Ty thể - đặc điểm cấu tạo DNA ty thể

Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí Ty thể là trạm chuyển hóa năng lượng từ các phân tử hữu cơ thành dạng năng lượng tích lũy trong phân tử ATP Ty thể có chứa DNA ty thể nó là một hệ di truyền độc lập với hệ di truyền của nhân tế bào

DNA ty thể (mtDNA) là sợi kép với cấu trúc vòng, có chiều dài khoảng 5µm, chiếm từ 1- 5% DNA của tế bào Phân tử mtDNA tự tái bản theo kiểu bán bảo toàn nhờ hệ enzyme DNA polymerase có trong chất nền của ty thể và xảy ra ở gian kỳ của chu kỳ phân chia tế bào Khác với DNA của nhân, mtDNA không liên kết với protein histon, điều này làm cho mtDNA tương tự với DNA của vi khuẩn, mtDNA là một trong các nhân tố quyết định tính di truyền tế bào chất Các gen nằm trên mtDNA mã hóa cho nhiều protein/enzyme và RNA của ty thể

Ở phần lớn các động vật có xương sống, mtDNA có chiều dài khoảng 16,8 kb Trên mtDNA, ngoài các gen cấu trúc còn có một vùng không mang

mã gọi là vùng điều khiển (Displacement loop hay D-loop), trên đó có các promotor của quá trình sao chép và phiên mã của mtDNA Phân tử mtDNA có các đặc điểm đáng chú ý sau:

- Tốc độ tiến hóa phân tử của mtDNA nhanh gấp 5-10 lần so với các gen trong nhân

- Phân tử mtDNA là đơn bội, không tái tổ hợp

Các kiểu đơn bội (halotype) khác nhau của mtDNA có thể được sử dụng làm các dấu hiệu chỉ thị trong việc phát hiện sự khác biệt di truyền theo dòng mẹ của các quần thể nuôi nhốt và các quần thể hoang dại

Vùng điều khiển là vùng tiến hóa nhanh nhất của mtDNA, nó tích lũy các đột biến cùng với sự thêm đoạn, mất đoạn với tỷ lệ cao gấp 5-10 lần so với các gen của ty thể Vì thế, việc xác định trình tự nucleotide đoạn điều khiển mtDNA là công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân nhánh tiến hóa bên trong và giữa các quần thể trong cùng một loài

1.3.2.2 Đặc điểm cấu tạo hệ gen ty thể gà

Toàn bộ 16.775 bp trong genome ty thể của gà Leghorn đã được xác định trình tự, chúng mã hóa cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA Một số gen mã hoá protein hoặc tRNA là các gen nằm gối lên nhau (overlapping genes) [15] Các protein tạo ra được sử dụng để vận chuyển điện tử và phosphoryl hoá trong ty thể Các gen mã hóa cho các protein này đều được dịch mã bởi cùng một bộ mã di truyền Genome ty thể gà có ba đặc điểm riêng, khác lớp thú và lưỡng cư:

- Theo chiều 5‟- 3‟ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 đến vùng D-loop là các gen cytochrome b, tRNA(Thr), tRNA (Pro), ND6 và tRNA (Glu); trong khi ở các động vật khác, gen cytochrome b lại nằm gần vùng điều khiển hơn Trật tự này được bảo toàn trong các loài thuộc bộ gà (Galliformes) [24]

- Một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tương đương với trình tự nằm giữa hai gen tRNA(Cys) và tRNA (Asn) đều có ở tất cả các động vật có xương sống đã được giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà không có đặc điểm này [24]

- COI (cytochrome oxidase I) có mã mở đầu là GTG thay vì ATG Toàn

bộ genome ty thể gà (Gallus gallus) được tổ chức như sơ đồ trong hình 1.1

Hình 1.1 Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà

Đặc điểm di truyền

Di truyền ty thể là di truyền theo dòng mẹ Trong thực tế, có đến 99% ty thể của tế bào con thừa hưởng từ mẹ do bào quan này nằm trong tế bào chất của tế bào trứng So với trứng, tinh trùng có một số lượng các ty thể chỉ bằng 0,1% - 1,5%, số lượng này đảm bảo năng lượng giúp tinh trùng vận động trong quá trình thụ tinh Khi tham gia thụ tinh, ty thể của tinh trùng bị loại bỏ nhờ cơ chế phân giải protein phụ thuộc ubiquitin Đôi khi cơ chế này diễn ra không hoàn toàn dẫn đến sự có mặt của hai dòng ty thể của cả bố lẫn mẹ trong cơ thể con, hiện tượng này được gọi là dị tế bào chất (heteroplasmy)

DNA ty thể không có intron, trong phân tử không có sự tái tổ hợp Tốc độ biến đổi của DNA ty thể nhanh hơn nhiều so với DNA trong nhân, có thể là do ty thể thiếu hụt các cơ chế sửa chữa DNA Tốc độ đột biến cao dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn xảy ra ngay cả trong cùng một loài

Số lượng ty thể có biến đổi về mặt di truyền trong tế bào tùy thuộc không những vào số ty thể nó được thừa hưởng từ mẹ mà còn vào các yếu tố gây đột biến trong môi trường Những biến dị ở genome ngoài nhân không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau Đây là một trong số các ví dụ cho thấy rằng có rất nhiều biến dị trong mã di truyền của ty thể nhưng không có hại đối với cơ thể mang đột biến

Trong hầu hết các trường hợp, mã di truyền là phổ biến Tuy thế, vẫn có một số ngoại lệ trong di truyền học ty thể Dưới đây là một số trường hợp mà người ta đã biết

Bảng 1.1 Sự khác nhau giữa mã di truyền trong nhân và ngoài ty thể

Bộ ba Mã của gen nhân Mã của gen ty thể

DNA ty thể và vai trò của vùng D-loop trong vấn đề định loại gà

Về mặt cấu trúc, vùng D-loop của gia cầm có thể được chia làm 3 đoạn theo Baker và Marshall (1997), bao gồm các đoạn I, II và III Trong đó đoạn II là đoạn bảo thủ nhất, có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ Thông thường, vùng biến đổi nhiều nhất trong D-loop là đoạn III [20] Đoạn này bắt đầu với cụm trình tự bảo thủ 1 (Conserved Sequence Block 1- CSB-1) Yếu tố phiên mã

của ty thể (mtTFA) có thể bám vào trình tự này và chuyển DNA ty thể từ quá trình phiên mã sang quá trình sao chép khi một yếu tố khác kết hợp vào phức hệ mtTFA - CSB - 1

Vùng điều khiển của DNA ty thể có tốc độ tiến hóa nhanh gấp 5-10 lần với các gen ty thể khác Trình tự nuleotide của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài Chính vì thế mà các gen trong genome ty thể và vùng D-loop đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại học phân tử Như vậy, DNA ty thể có thể được coi là một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại hay sự tiến hóa của các quần thể

1.3.2.3 Ý nghĩa của DNA ty thể trong nghiên cứu phân loại ở gà

Phân loại học cổ điển trên các đối tượng thuộc bộ gà chủ yếu dựa vào các đặc điểm bộ lông bên ngoài của con trống, đó là những đặc điểm sinh dục thứ cấp Những đặc điểm này mang một tiềm năng biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ nên không được coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loại ở các loài Khi đó, mtDNA với những ưu điểm nổi bật đã được chọn làm đối tượng để nghiên cứu

1.3.2.4 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới

Trong hơn 30 năm qua, việc nghiên cứu DNA ty thể đã và đang được phát triển tương đối rộng rãi Người ta đã tiến hành nhiều công trình nghiên cứu ở mức độ phân tử trên các đối tượng vi sinh vật, côn trùng, cá, chim, thú, các loài thực vật và con người với nhiều mục đích khác nhau Dưới đây là một vài nghiên cứu cụ thể trên một số loài thuộc bộ Gà (Galliformes):

Năm 1990, Desjadins và Morais đã công bố toàn bộ trình tự mtDNA của

gà nhà (Gallus gallus) với tổng chiều dài 16775bp Với trình tự này, các nhà

khoa học đã có cơ sở để tiến hành nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các đối tượng thuộc bộ gà [15]

Năm 1994 - 1995, Fuhimito và cộng sự [23] đã nghiên cứu mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, công, trĩ, chim cun cút dựa trên các phân tích đoạn điều khiển ty thể Kết quả phân tích tính đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đưa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên Đồng thời họ đã xác định được trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA Kết quả nhận được đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm

đặc trưng của giống Gallus

Randi và cộng sự [16]; Scott [20] phân tích trình tự của một phần đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-loop) của 2 loài gà Lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này

Năm 1999, Kimball và cộng sự [18] cũng dựa trên sự phân tích trình tự đầy đủ của gen cytochrom b (1143bp) và đoạn siêu biến 1(350bp) của vùng điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài trĩ và gà gô Hai cây phân loại được xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận được trên hai đoạn gen cho thấy sự khác nhau là rất ít Như vậy chỉ với việc phân tích một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết quả phân tích trên toàn bộ gen cytochromb, điều này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại

- Zhang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nuleotide đầu tiên trong

vùng D-loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố trong Ngân hàng

Gen Quốc tế Ông đã thiết lập được mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa

trên trình tự vùng D-loop Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có rất nhiều điểm khác nhau G g domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất với G gallus của Thái Lan và các vùng lân cận Nhóm nghiên cứu đã giả thiết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G gallus ở các nơi này và hai loài phụ G g gallus, G g spadiceus có thể thuộc một loài phụ do tính tương đồng cao giữa chúng [22], [30]

- Pereira và cộng sự đã tìm được ít nhất 13 gen giả (pseudogene hay

Numt) trong genome của G gallus với kích thước dao động từ 131 đến 1733

nuleotide Đây là các đoạn DNA ty thể được tìm thấy trong hệ gen nhân của sinh vật nhân thật Một số trong chúng có nhiều điểm tương đồng với các đoạn trong ty thể Do đó, chúng có thể được dùng trong các nghiên cứu mối quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm đối tượng nghiên cứu Tuy nhiên, người ta vẫn chưa xác định được tần số bắt gặp của Numt cũng như đóng góp của nó đối với genome trong nhân [24]

Komiyama T và đồng tác giả [19] đã tiến hành phân tích trình tự vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa phương của Nhật bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà Lông đỏ (Jungle Fowl) đã được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup) Trên cơ sở đó họ đã lập cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản Điều này dẫn đế giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên được đưa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng

Nam Trung Quốc hoặc Đông Nam Á Như vậy có thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-Loop là một công cụ rất hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý

1.3.2.5 Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam

Ở gà Ri và gà Mông đã có một số công trình nghiên cứu được công bố về năng suất phẩm chất, thành phần hóa sinh trứng [5]

Ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về gà Sao mới chỉ tập vào các lĩnh vực khả năng sinh trưởng, năng suất, phẩm chất thịt, thành phần hóa sinh thịt, khả năng sinh sản, năng suất trứng Hiện nay, chưa có công bố nào nghiên cứu về thành phần hóa sinh trứng gà Sao

Cho đến nay ở Việt Nam việc sử dụng phương pháp phân loại phân tử trên đối tượng gà mới chỉ bắt đầu Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng sự [14] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi lam đuôi trắng

(L hatinhensis), trĩ bạc (L nycthemera) và gà lôi hông tía (L diardi) Từ đó

xác định bước đầu được sự khác biệt trên vùng điều khiển mtDNA của 3 loài gà lôi Tuy nhiên, để có những kết luận chính xác về vấn đề này cần phải xác định trình tự vùng điều khiển của 3 dòng gà lôi nói trên

Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [2] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop

Năm 2006 Địch Thị Kim Hương và cộng sự [3] đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucloetide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lương Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucloetide giữa hai đại diện

Năm 2007 Lê Đức Long và cộng sự [4] đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên,

Hà Giang và Yên Bái được nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch Kết quả nghiên cứu đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định được 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này

Hiện nay TS Lê Thị Thúy - Viện Chăn Nuôi đang làm chủ nhiệm đề tài cấp nhà nước "Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống gà nội" trong đó có giống gà Mông và gà Ri

Đến nay, chưa có công bố về trình tự vùng D-loop gà Ri và gà Sao Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiếp tục so sánh thành phần hóa sinh trứng qua hàm lượng protein, lipit, vật chất khô và xác định trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba mẫu giống gà: gà Ri, gà Mông Nghệ An và gà Sao

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU

Vật liệu nghiên cứu là mẫu trứng, máu của các giống gà:

- Gà Ri Hưng Yên (Rhy): Lông vàng, da vàng, chân vàng - Gà Mông Nghệ An (Mna): Lông trắng, xương đen, thịt đen

- Gà Sao dòng trung (Sdt): Lông xám đen điểm các đốm trắng tròn nhỏ Các giống gà trên được nuôi thử nghiệm trong trại giống gà của trường ĐHNL Thái Nguyên theo dự án gà sạch

2.2 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1 Hóa chất

Petroleum ether, axít sunfuric đậm đặc 98%, NaOH 1N, H3BO3 4%, chỉ thị Tasiro, H2O2 30%, dung dịch H2SO4 0,1N

Dung dịch đệm phốt phat citrate, dung dịch đệm Tris tổng hợp (Tris

0,125M, SDS 2%, ß - rccapthanol) được pha theo tỷ lệ 3:1:1

Dung dịch A Na2CO3 2% trong NaOH, dung dịch B CuSO4 0,5% trong natricitrat 1%, dung dịch C hỗn hợp dung dịch A với B theo tỷ lệ 49:1 chỉ pha trước khi dùng, thuốc thử folin, Ba(OH)2

Proteinase K (20mg/ml); Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1); Chlorofom: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0,8%; RNase (10mg/ml); Tris-HCl (0,1M; pH7,5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium Bromide

Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma Dung dịch đệm PBS (Phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0,2g; Na2HPO4 1,44g; KH2PO4 0,24g Dẫn nước đến 100ml

Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8); EDTA (10mM, pH8); NaCl 0,1M; SDS 2,1%

Dung dịch đệm TAE dùng trong kỹ thuật điện di: Tris base; CH3OOH; EDTA (0,5mM, pH8)

Bộ hóa chất dùng cho PCR ( dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt,…) Bộ hóa chất CloneJET TM

PCR Cloning của hãng Fermentas Bộ hóa chất BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Các môi trường nuôi cấy vi sinh vật: LB đặc, LB lỏng, SOC

- Các dung dịch tách chiết DNA plasmid: Dung dịch I (Sol I); Dung dịch II (Sol II); Dung dịch III (Sol III)

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị và hóa chất được sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm hóa sinh - ĐHSP Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ Sinh học

Bảng 2.1 Các thiết bị sử dụng trong đề tài

Tủ lạnh sâu - 20ºC, - 84ºC Sanyo, Nhật Bản

Applied Biosystems, Mỹ Máy Gene Amp PCR System 9700 Applied Biosystems, Mỹ

Máy quang phổ; Tủ cấy vô trùng; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Các phương pháp hóa sinh

2.3.1.1 Phương pháp xác định tỷ lệ lòng trắng, tỷ lệ lòng đỏ

Sử dụng phương pháp cân bằng cân kỹ thuật có độ chính 10-4, xử lý số liệu trên máy vi tính

2.3.1.2 Phương pháp xác định hàm lượng nước

Cân 3 mẫu trứng (lòng đỏ, lòng trắng, vỏ) của mỗi giống trên cân điện tử rồi cho vào tủ sấy ở 60o

C trong 3 - 5 ngày, sau đó lấy mẫu ra cân lại cho tới khi khối lượng không đổi

Hàm lượng nước được tính theo công thức: N = tk 100

Chiết lần 1: Mẫu cho vào 3 tube đổ dung môi hữu cơ theo mức quy định

để vào tủ lạnh nhiệt độ 4oC trong 24 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch

Chiết lần 2: Cho petroleum ether vào theo mức quy định, để vào tủ lạnh ở

nhiệt độ 4o

C trong 12 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch

Chiết lần 3: Cho petroleum ether vào theo mức quy định để vào tủ lạnh

độ 4oC trong 8 giờ, li tâm 12000 v/p, loại bỏ dịch

Lấy vài giọt dịch chiết lên lam kính hơ nhẹ cho petroleum ether bay hết, soi lên kính Nếu thấy lam kính trong suốt chứng tỏ mỡ trong mẫu đã hết Sấy khô các tube đã chiết ở nhiệt độ 105oC, cân đến khối lượng không đổi

Tính kết quả hàm lượng lipid được tính theo công thức: L = AB 100

Trong đó: L: Hàm lượng lipid (%)

A: Khối lượng mẫu ban đầu (g)

B: Khối lượng mẫu sau khi chiết lipid (g)

2.3.1.4 Định lượng Protein (theo phương pháp Lowry)

Nguyên tắc của phương pháp: Dựa vào sự hình thành phức chất đồng và protein (phản ứng Biure) Chất này tác động với thuốc thử folin cho màu đặc trưng cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng protein Phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm

Thuốc thử folin có tác dụng với gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để tạo nên phức chất màu Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol, pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc các hợp chất chứa nhóm - SH, các axit tự do Tyr, Trp Hoặc cường độ màu của phức chất có thể bị giảm khi có mặt của etanol, ete ở nồng độ cao hơn 5%; axeton; Ba(OH)2 ở nồng độ hơn 1%, axit Cl3COOH, hay HClO4 Vì vậy để đạt cường độ màu chính xác dung dịch protein với thuốc thử folin phải được tinh sạch

Phương pháp Lowry có độ nhạy tương đối cao, cho phép xác định dung dịch chứa mẫu vài chục g protein Vì vậy phương pháp này được áp dụng khá phổ biến với các mẫu đã loại bỏ các chất gây tác động tăng hoặc giảm

cường độ của phức chất với thuốc thử folin Tuy nhiên phương pháp này không dùng để định lượng các protein không chứa vòng thơm

Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch C và dịch chiết protein, cho vào mỗi ống nghiệm 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml mẫu + 0,5ml folin để 30' đem đo trên máy quang phổ bước sóng 750nm

Ống đối chứng 2,5ml dung dịch C + 1.5ml H2O + 0,5ml folin

Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml

Tính kết quả: Kết quả trên máy quang phổ xác định được khối lượng

protein trong 0,25ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml) Từ đó tính hàm lượng protein trong nguyên liệu (%) theo công thức:

% protein = 100%

Trong đó: a: số đo trên máy quang phổ P: hệ số pha loãng (200) g: số mg mẫu cần phân tích

Độ lệch chuẩn SX

iiX

Sai số trung bình mX

2.3.2 Các phương pháp sinh học phân tử

2.3.2.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu động vật

Nguyên tắc chung

Màng tế bào được phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân được giải phóng cùng với các protein Sau đó DNA được tinh sạch nhờ proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol:chloroform:isoamylalcohol Cuối cùng, DNA được tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phương pháp ly tâm

Quy trình kỹ thuật

Làm tan máu đông lạnh ở 37- 39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendorf 1,5ml với thể tích 500 l/ống, tách chiết DNA tổng số theo phương pháp của Sambrook và Russell [28] các bước như sau:

Bước 1: Hoà tan 500 l máu với 500 l PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p,

15 phút, 4ºC, đổ dịch, thu cặn

Bước 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 m proteinase K

Mẫu được ủ ở 65ºC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 l dịch

Bước 3: Bổ sung một lượng tương đương Phenol:Chlorofom:Isoamyl

alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC Hút pha trên vào ống mới

Bước 4: Thêm một thể tích tương đương Chloroform:Isoamyl alcohol

(24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15phút, 4ºC Thu pha trên

Bước 5: Thêm CH3COONa một lượng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20º trong 15h (qua đêm)

Bước 6: Ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC để thu DNA Tiếp đó, bổ sung

500 l cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4ºC, bỏ dịch và thu cặn

Bước 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hoà tan cặn trong 50 l H2O, búng nhẹ

2.3.2.2 Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc chung

Điện di là kỹ thuật dùng để tách và định lượng axit nucleic với các kích thước và hàm lượng khác nhau Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO43-

trên bề mặt Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trường với cường độ dòng và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dương Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã dùng gel agrose 0,8 % bởi nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1 - 20kb)

Quy trình kỹ thuật

Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agarose vào 100ml dung dich đệm TAE Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu được dung dịch trong suốt Để nguội đến khoảng 50 - 60ºC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lược Sau 30 phút gel đông lại thì rút răng lược ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE

Tra mẫu DNA: Trộn một lượng mẫu thích hợp (3 l) với đệm tra mẫu (2,5 l), tra vào các giếng trên bản gel Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng 60 - 80mA trong khoảng 30 phút

Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 l/ ml Lấy bản gel ra sau 10 -15 phút và rửa trong nước sạch

Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio-Rad

2.3.2 3 Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1998 Từ đó đến nay Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã có những đóng góp đáng kể cho những tiến bộ về sinh học phân tử [21]

Nguyên tắc chung

Trong kỹ thuật PCR, người ta sử dụng enzym DNA Taq polymerase đã được

phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp DNA trong môi trường phản

ứng có chứa 4 loại deoxynuleotide (dNTPs) cùng các cặp mồi chuyên biệt Mồi được sử dụng ở đây là các oligonuleotide có khả năng kết cặp với một đầu của DNA khuôn và là nơi bám của DNA polymerase, từ đó mạch tổng hợp được kéo dài PCR là một quá trình lặp lại, mỗi chu kì gồm có 3 giai đoạn:

- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94 - 95ºC trong

khoảng 1 phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào

- Giai đoạn gắn mồi: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của hỗn hợp được hạ

xuống trong khoảng 30 - 60ºC để cho mồi kết hợp với sợi khuôn Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự của mồi

- Giai đoạn kéo dài mạch: Sau khi mồi đã kết hợp được với sợi khuôn,

nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC cho phép quá trình tổng hợp các sợi mới xảy ra Bước này cần 2 - 5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại

Sản phẩm cuối cùng của chu kì trước sẽ trở thành nguyên liệu cho chu kỳ tiếp theo Sau mỗi chu kì, số lượng DNA đích sẽ tăng lên gấp đôi Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân, nhờ đó người ta có đủ số lượng DNA phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo

Nguyên liệu - DNA khuôn (Template)

- Cặp mồi H1255 - L16725 chuyên biệt Ở đây, H (Heavy) và L (Light) là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuleotide đầu 3‟ của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15]

- Bộ hóa chất: dung dịch đệm có chứa NH4+, dNTPs 10mM, MgCl2

10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas

- Nước khử ion vô trùng

Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 l như trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng khuếch đại gen

Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%

2.3.2.4 Kĩ thuật tách dòng gen

Kĩ thuật tách dòng gen bao gồm 4 bước sau:

Phản ứng ghép nối đoạn AND vào vector đầu bằng pJET1/Blunt