Đặc điểm hóa sinh trứng và trình tự vùng điều khiển d-loop của ba giống gà ri gà mông và gà sao nuôi tại Thái Nguyên: cơ sở phân biệt chủng loại

Cơ sở của việc nghiên cứu các tính trạng ở trứng

Các kiểu đơn bội (halotype) khác nhau của mtDNA có thể được sử dụng làm các dấu hiệu chỉ thị trong việc phát hiện sự khác biệt di truyền theo dòng mẹ của các quần thể nuôi nhốt và các quần thể hoang dại. Như vậy chỉ với việc phân tích một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết quả phân tích trên toàn bộ gen cytochromb, điều này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại. - Zhang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nuleotide đầu tiên trong vùng D-loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã được công bố trong Ngân hàng.

Komiyama T và đồng tác giả [19] đã tiến hành phân tích trình tự vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa phương của Nhật bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà Lông đỏ (Jungle Fowl) đã được công bố trên ngân hàng gen Quốc tế EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup). Năm 1999, Kim Thị Phương Oanh và cộng sự [14] đã tiến hành phân tích vị trí nhận biết của một số enzyme giới hạn trên vùng điều khiển D-loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi lam đuôi trắng (L. nycthemera) và gà lôi hông tía (L. Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [2] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop.

Năm 2006 Địch Thị Kim Hương và cộng sự [3] đã xác định được trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucloetide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lương Phượng, đã phát hiện được 22 vị trí khác biệt về nucloetide giữa hai đại diện. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiếp tục so sánh thành phần hóa sinh trứng qua hàm lượng protein, lipit, vật chất khô và xác định trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba mẫu giống gà: gà Ri, gà Mông Nghệ An và gà Sao.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Các phương pháp hóa sinh

Ngoài ra cường độ màu của phức chất có thể tăng lên trong môi trường phản ứng có chứa muối amôn, vòng imidazol, phenol, pirimidin, axit uric, các ion kim loại hoặc các hợp chất chứa nhóm - SH, các axit tự do Tyr, Trp. Sử dụng máy quang phổ để đo mật độ quang, lập đồ thị chuẩn: Pha dung dịch protein 0,02% từ dung dịch gốc albumin tiêu chuẩn 0,1% pha 5 lần được dung dịch albumin có khối lượng 0,2mg/ml. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã dùng gel agrose 0,8 % bởi nồng độ này phù hợp với kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1 - 20kb).

Từ đó đến nay Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã có những đóng góp đáng kể cho những tiến bộ về sinh học phân tử [21]. Trong kỹ thuật PCR, người ta sử dụng enzym DNA Taq polymerase đã được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp DNA trong môi trường phản ứng có chứa 4 loại deoxynuleotide (dNTPs) cùng các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonuleotide có khả năng kết cặp với một đầu của DNA khuôn và là nơi bám của DNA polymerase, từ đó mạch tổng hợp được kéo dài.

- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94 - 95ºC trong khoảng 1 phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. - Giai đoạn gắn mồi: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của hỗn hợp được hạ xuống trong khoảng 30 - 60ºC để cho mồi kết hợp với sợi khuôn. - Giai đoạn kéo dài mạch: Sau khi mồi đã kết hợp được với sợi khuôn, nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC cho phép quá trình tổng hợp các sợi mới xảy ra.

Vì vậy, bộ Kit này phù hợp cho việc tách dòng không chỉ những đoạn gen đầu bằng mà cả những đoạn gen đầu dính (sản phẩm cắt enzyme giới hạn, sản phẩm PCR). Các sản phẩm PCR được nhân lên bằng enzyme taq polymerase trước khi tiến hành phản ứng ghép nối gen cần làm bằng hóa đầu 3‟ trong một hỗn hợp phản ứng gồm cú 5àl 2X Reaction Buffer; 3àl sản phẩm PCR; 0,5àl H2O;. Bổ sung 2 l sản phẩm của phản ứng ghép nối vào mỗi ống tế bào khả biến đã được để trong đá khoảng 30 phút sau khi lấy ra từ -80oC, giữ trong đá.

Trình tự vùng D-loop được xác định dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger [3]: tạo ra các đoạn oliogonuleotide hơn kém nhau 1 nuleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự như dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase… Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn (sản phẩm PCR hoặc DNA plasmid tinh sạch) và mồi phù hợp. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, DNA plasmid 200ng BigDye và nước với tổng thể tích 15 l.