3. Nội dung nghiên cứu
2.3.2.3.Nhân vùng điều khiển D-loop bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1998. Từ đó đến nay Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã có những đóng góp đáng kể cho những tiến bộ về sinh học phân tử [21].
Nguyên tắc chung
Trong kỹ thuật PCR, người ta sử dụng enzym DNA Taq polymerase đã được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp DNA trong môi trường phản ứng có chứa 4 loại deoxynuleotide (dNTPs) cùng các cặp mồi chuyên biệt. Mồi được sử dụng ở đây là các oligonuleotide có khả năng kết cặp với một đầu của DNA khuôn và là nơi bám của DNA polymerase, từ đó mạch tổng hợp được kéo dài. PCR là một quá trình lặp lại, mỗi chu kì gồm có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn biến tính: DNA khuôn bị biến tính ở nhiệt độ 94 - 95ºC trong khoảng 1 phút để tách phân tử DNA thành hai sợi đơn. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào.
- Giai đoạn gắn mồi: Ở giai đoạn này, nhiệt độ của hỗn hợp được hạ xuống trong khoảng 30 - 60ºC để cho mồi kết hợp với sợi khuôn. Nhiệt độ và thời gian của bước này thay đổi, phụ thuộc vào trình tự của mồi.
- Giai đoạn kéo dài mạch: Sau khi mồi đã kết hợp được với sợi khuôn, nhiệt độ được tăng lên đến 72ºC cho phép quá trình tổng hợp các sợi mới xảy ra. Bước này cần 2 - 5 phút tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại.
Sản phẩm cuối cùng của chu kì trước sẽ trở thành nguyên liệu cho chu kỳ tiếp theo. Sau mỗi chu kì, số lượng DNA đích sẽ tăng lên gấp đôi. Sau một thời gian, lượng DNA được tăng lên theo cấp số nhân, nhờ đó người ta có đủ số lượng DNA phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Nguyên liệu - DNA khuôn (Template).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - Cặp mồi H1255 - L16725 chuyên biệt. Ở đây, H (Heavy) và L (Light) là ký hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuleotide đầu 3‟ của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15].
- Bộ hóa chất: dung dịch đệm có chứa NH4+, dNTPs 10mM, MgCl2 10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas.
- Nước khử ion vô trùng.
Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 l như trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng khuếch đại gen
Nước 10,85 l Buffer 2,5 l MgCl2 4 l dNTPs 2,5 l Mồi H1255-F 0,5 l Mồi L16725-R 0,5 l
Taq DNA polymerase 0,15 l
DNA temp 4 l
Tổng thể tích 25 l
Chu trình nhiệt
94ºC - 4 phút (94ºC - 1 phút; 50ºC- 1 phút; 72ºC- 1 phút 20 giây) x 30 chu kỳ; 72ºC -10 phút; giữ ở 4ºC.
Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%.