nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú

  1 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** HOÀNG HẢI YẾN NGHIấN CỨU PHÁT HIỆN GEN SURVIVIN TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ Chuyờn ngành : Húa sinh Mó số : 60.72.04 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thiện Ngọc PGS.TS. Lờ Quang Huấn HÀ NỘI - 2011   2 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI *** HOÀNG HẢI YẾN NGHIấN CỨU PHÁT HIỆN GEN SURVIVIN TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ Chuyờn ngành : Hỳa sinh Mú số : 60.72.04 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Phạm Thiện Ngọc PGS.TS. Lê Quang Huấn HÀ NỘI - 2011   3 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và làm luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bè bạn. Với tất cả sự kính trọng, tôi xin trân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Thiện Ngọc - Chủ nhiệm bộ môn Hóa sinh - Trường Đại học Y Hà Nội. Thầy là người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương pháp và tác phong làm việc nghiêm túc, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập . Thầy đã xây dựng ý tưởng, cung cấp kinh phí từ đề tài cấp Bộ y tế, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn - Trưởng phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa học và Công ngh ệ Việt Nam, là người hướng dẫn khoa học, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Hội đồng đánh giá đề cương và Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã góp ý cho tôi nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Thầy Cô bộ môn hóa sinh - trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này. Ban giám đốc Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội, khoa Xét nghiệm Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội đã t ạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.   4 Ban giám đốc, khoa ngoại vú, khoa giải phẫu bệnh, phòng mổ bệnh viện K trung ương đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cám ơn tới tất cả các bạn phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Xin bày t ỏ lòng biết ơn đối với bố mẹ và những người thân trong gia đình, bạn bè đồng nghiệp là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn thương yêu, khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tinh thần giúp tôi hoàn thành tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận văn này. Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bênh nhân đã tham gia vào nhóm nghiên cứu, sự đóng góp của các chị đ ã giúp tôi có thành công này. Hà Nội, 24 tháng 12 năm 2011 Hoàng Hải Yến   5 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ một công trình nào khác. Hà Nội, 24 tháng 12 năm 2011 Tác giả Hoàng Hải Yến   6 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA : Dideoxyribonucleic acid RNA : Ribonucleic ac UTV : Ung thư vú UT : Ung thư UTBM : Ung thư biểu mô PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi) RT- PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (Phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược) bp : Base pair dNTP : Deoxynucleoside triphosphate ddNTP : Dideoxynucleotide triphosphate Kb : Kilobase mRNA : messenger RNA (RNA thông tin) TNM : Tumor Nude Metastasis TLPT : Trọng lượng phân tử TAE : Tris - acid acetic - EDTA GAPDH : Glyceraldehyde - 3 Phosphat Dehydrogenase MMLV-RT : Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Trancriptase (Enzym phiên mã ngược) CTC : Circulating Tumor Cell IAP : Inhibitor of apoptosis protein   7 (Chất ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào) ATCC : American Type Culture Colection FBS : Fetal Bovine Serum P/S : Penicillin/Streptomycin DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO : Dimethyl Sulfoxide PBS : Phosphate Buffer Saline ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú (UTV) là loại ung thư (UT) phổ biến ở phụ nữ nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. UTV chiếm gần 30% các loại UT ở phụ nữ, là ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ 2 trong số các loại ung thư. Theo hiệp hội nghiên cứu ung thư thế giới, năm 2008, trên toàn thế giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mớ i được chẩn đoán và 458.503 ca tử vong [49]. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV ở Hà Nội là khoảng 30/100.000 dân và ở TP Hồ Chí Minh là khoảng 20/100.000 dân, đứng đầu trong các loại UT ở phụ nữ [13]. Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong tầm soát, phẫu thuật và các thuốc điều trị ngày càng có hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều trường hợp bệnh nhân UTV nguyên phát ở giai đoạn sớm vẫn bị tái phát bệ nh hoặc tử vong. Các phương pháp cận lâm sàng được áp dụng trong chẩn đoán UT như các phương pháp chẩn đoán hình ảnh, các phương pháp sinh thiết và các phương pháp hóa sinh phát hiện các dấu ấn ung thư (tumor marker). Mỗi loại phương pháp chẩn đoán trên đều có những ưu điểm và hạn chế, do vậy thường phải kết hợp các phương pháp chẩn đoán khác nhau mới đem lại hiệu quả chẩn đoán chính xác và sớ m UTV. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều phương pháp mới giúp cho việc   8 chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV nói riêng đã được ứng dụng. Nguyên tắc chung của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định các đột biến gen liên quan tới UT. Việc phát hiện các đột biến gen UT lấy từ các mô UT, hạch bạch huyết hoặc tủy xương chỉ có thể thực hiện khi sinh thiết hoặc sau phẫu thuật do vậy nhược điểm là phát hiện muộn khi kh ối u đã lớn. Vì vậy, việc chẩn đoán UT thường ít còn ý nghĩa và không giúp cho việc điều trị có hiệu quả cũng như việc theo dõi điều trị. Do vậy, các nghiên cứu phát hiện các chỉ thị UT trong máu nhằm phát hiện di căn tiềm ẩn từ giai đoạn sớm của bệnh nhân ung thư là cần thiết. Các tế bào UT có nguồn gốc từ các tế bào khối u nguyên phát hoặc các khối u đ ã di căn, thâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell - CTC). Các CTC là bằng chứng về sự di căn của các tế bào UT trước khi có các biểu hiện lâm sàng [22]. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị khối u để xác định các tế bào khối u trong máu đóng vai trò quan trọng, có thể góp phần xác định sớm các trường hợp di căn, giúp cho việc chẩn đoán và điều trị có hiệu quả. Một số gen chỉ thị khối u đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó có gen mã hóa survivin. Gen survivin mã hóa một protein ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Gen này được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV, nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là gen survivin không biểu hiện ở các mô bình thường [11]. Do vậy, việc phát hiện gen survivin trong máu có thể góp phần chẩn đoán, tiên l ượng và theo dõi điều trị bệnh nhân UTV [18], [38], [50]. Đặc biệt khi kết hợp với các gen khác như survivin, hTERT và hMAM [41]. Vì vậy, để góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú” với 2 mục tiêu:   9 1. Xây dựng quy trình phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú. 2. Đánh giá khả năng ứng dụng xét nghiệm gen survivin trong chẩn đoán ung thư vú. Chương 1 TỔNG QUAN Bnh ung th vú 1.1.1. Khái niệm bệnh Ung thư là từ dùng để chỉ u bướu ác tính do sự phát triển và biệt hóa của các tế bào ở các mô của cơ thể trong tình trạng không kiểm soát được. Ung thư vú là u ác tính phát sinh từ các tế bào biểu mô nguồn gốc từ mô vú, phần lớn từ các ống dẫn sữa hoặc các tiểu thuỳ. UT có nguồn gốc từ ống sữa được gọi là ung thư biểu mô tuyến sữa và UT có nguồn gốc t ừ tiểu thuỳ được gọi là ung thư biểu mô tiểu thuỳ. Có nhiều dạng UTV khác nhau với trạng thái khác nhau, sự ác tính khác nhau, bản chất di truyền khác nhau và tỷ lệ sống sót khác nhau phụ thuộc vào các yếu tố này. 1.1.2. Dịch tễ học UTV Tình hình ung thư vú trên thế giới Ung thư vú không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiề u nước. Nguy cơ mắc bệnh UTV theo suốt cuộc đời người phụ nữ. Tỷ lệ mắc thay đổi   10 nhiều, từ 25-35/100.000 dân tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan và Canada đến 1- 5/100.000 dân tại Nhật Bản, Mexico, Venezuela [2]. Bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở Mỹ và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở Nam Âu, Tây Âu và thấp nhất ở châu Á. Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp 2 lần so với những năm 50 thế kỷ XX ở một số nước có nền công nghiệp phát triển mạnh trong các năm qua nh ư Nhật Bản, Singapore, một số thành phố của Trung Quốc Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc ở các vùng này phần nào được giải thích do sự thay đổi về lối sống, kinh tế phát triển, ngày càng có nhiều phụ nữ làm việc trong lĩnh vực công nghiệp, tuổi thọ trung bình tăng, thay đổi về sinh sản, chế độ ăn Theo hiệp hội nghiên cứu ung thư thế giới, năm2008, trên toàn thế gi ới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 458.503 ca tử vong [49]. Ở Mỹ, năm 2010, hơn 207.000 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và ước tính có tới 39.800 ca tử vong [16]. Tỷ lệ UTV tăng theo tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi 30 (khoảng 0,8%), sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng một cách nhanh chóng (khoảng 6,5% ở tuổi 30-40). Theo thống kê của hiệp hội phòng chống UT Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân ở độ tuổi 30- 34 lên đến 200/100.000 dân ở độ tuổi từ 45-49. Tuy nhiên người ta nhận thấy rằng nguy cơ mắc bệnh này tăng chậm ở độ tuổi từ 45-50. Điều này gợi ý rằng UTV là loại UT có liên quan mật thiết với nội tiết. Tỷ lệ chế t do UTV tăng lên theo tỷ lệ mắc [2]. Tuy nhiên, ở một số nước phát triển mặc dù tỷ lệ mắc UTV gia tăng nhanh chóng nhưng tỷ lệ chết vẫn giữ được ở mức ổn định nhờ các tiến bộ trong sàng lọc phát hiện bệnh sớm và những thành tựu đạt được trong điều trị. Tình hình ung thư vú tại Việt Nam [...]... vẫn chưa thấy có nghiên cứu về phát hiện gen survivin trên mô và máu bệnh nhân UTV Chính vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT góp phần chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú ” 1.3 Các k thu t sinh h c phân t đ phát hi n gen t các t b o ung th Phát hiện các CTC trong máu... biệt giữa các tế bào sống và tế bào chết Thực tế là chỉ có những tế bào sống được mới có thể phát triển thành ung thư di căn Những kỹ thuật phát hiện dựa vào kháng thể thư ng cho kết quả không đặc hiệu vì cytokeratin cũng biểu hiện trong cả tế bào tạo máu ICC cho phép phát hiện 1 tế bào ung thư trong số 105 tế bào bạch cầu nhưng nó không đủ độ đặc hiệu để phát hiện tổ chức nơi các tế bào ung thư thật... HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư Hiện nay bằng kỹ thuật sinh học phân tử với độ nhạy cao, các nhà khoa học đã chứng minh được các tế bào ung thư có nguồn gốc từ các khối u, sau đó xâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi từ giai đoạn rất sớm trước khi có biểu hiện lâm sàng Các tế bào này gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell - CTC) mang gen đặc trưng... thể phát hiện được 1 tế bào ung thư trong số 106 – 107 tế bào bạch cầu Kỹ thuật phát hiện dựa trên acid nucleic hay miễn dịch tế bào như PCR, RT-PCR được sử dụng rất nhiều Mỗi phương pháp đều sử dụng đặc điểm khác nhau của các CTC để phát hiện ra các CTC Phát hiện các CTC bằng phương pháp hóa miễn dịch dựa vào khả năng phân biệt giữa các tế bào của các tổ chức mô khác nhau của kháng thể, ví dụ như các. .. chẩn đoán để phát hiện các tế bào ung thư lưu hành trong máu đã được thực hiện trên rất nhiều nghiên cứu [15], [28], [32], [47] Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng bộc lộ một vấn đề khó khăn đó là một số gen gây UT cũng biểu hiện trong tế bào máu cũng như trong tế bào biểu mô bình thư ng Điều này dẫn đến kết quả dương tính giả, làm giảm đáng kể sự tương quan giữa sự biểu hiện của các gen UT và các yếu tố... chế, tế bào sẽ không bị phá hủy bởi sự chết theo chương trình và tế bào sẽ phân chia, tạo thành các tế bào con với DNA bị tổn thư ng Điều này có thể là một cơ chế dẫn đến sự phát sinh ung thư 1.2.2 Survivin 1.2.2.1 Cấu trúc survivin   25   Hình 1.2 Survivin Survivin là thành viên thuộc nhóm các protein ức chế sự chết theo chương trình của tế bào (IAP) và điều hòa phân chia tế bào Gen survivin được phát. .. tránh hiện tượng dương tính giả, cần phải lựa chọn cẩn thận được một gen chỉ biểu hiện ở bệnh UT mà không biểu hiện ở các tế bào bình thư ng Gen survivin mã hóa một protein ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) Gen survivin được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV [45], nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là gen survivin. .. cả các loại ung thư ở phụ nữ trên thế giới cũng như ở Việt Nam 1.1.3.Tiến triển và các giai đoạn ung thư vú 1.1.3.1 Tiến triển ung thư vú Biểu hiện lâm sàng của UTV có đặc trưng là kéo dài và rất khác nhau giữa các bệnh nhân Đa số các trường hợp UTV xâm lấn phát sinh từ tế bào biểu mô của thùy hoặc của ống dẫn của tuyến vú Các tế bào bị UT hóa nhân lên với tốc độ khoảng 60 ngày một chu kỳ Ước tính, từ. .. phân bào giảm nhiễm và sự chuyển động của NST trong phân bào nguyên phân [48] * Vai trò của survivin trong tăng sinh mạch Cơ chế tăng sinh mạch của survivin đóng góp vào việc bảo tồn tính toàn vẹn của vi cấu trúc hình ống và ức chế apoptosis ở tế bào nội mạc, làm cho tế bào này có khả năng tồn tại và chức năng bảo vệ tế bào ung thư [52] 1.2.3 Survivin trong ung thư vú Ung thư vú xảy ra khi các tế bào. .. là chủ yếu ở các bệnh nhân này [39] Đôi khi sự lan tràn xảy ra thêm từ hệ tĩnh mạch ở vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết của da dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực và sau đó đến màng phổi và phổi Các tế bào UTV thư ng di căn rất sớm và tại thời điểm chẩn đoán được bệnh không thể phát hiện được các di căn này bằng các phương pháp chẩn đoán hiện có, do vậy việc nghiên cứu phát hiện các tế bào UTV thực . tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú với 2 mục tiêu:   9 1. Xây dựng quy trình phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú. 2. Đánh giá khả. phát hiện các chỉ thị UT trong máu nhằm phát hiện di căn tiềm ẩn từ giai đoạn sớm của bệnh nhân ung thư là cần thiết. Các tế bào UT có nguồn gốc từ các tế bào khối u nguyên phát hoặc các khối. của các tế bào ở các mô của cơ thể trong tình trạng không kiểm soát được. Ung thư vú là u ác tính phát sinh từ các tế bào biểu mô nguồn gốc từ mô vú, phần lớn từ các ống dẫn sữa hoặc các tiểu