tham gia của nhiều người và tốn thời gian, đặc biệt đểđánh giá độ tin cậy của kỹ thuật phải cần ắt nhất 100000 tế bào để phân tắch sự có mặt các tế bào ung thư. Vì vậy, kỹ thuật này không thểđánh giá chắnh xác được lượng tế bào rất thấp trong máu [43].
1.3.2. Kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (Immunocytochemistry- ICC) Nguyên lý
ICC là kỹ thuật được sử dụng để đánh giá sự có mặt của một loại protein hoặc kháng nguyên đặc hiệu trong tế bào bằng cách sử dụng của một kháng thể đặc hiệu liên kết với kháng nguyên, do đó cho phép hiển thị và
kiểm tra dưới kắnh hiển vi.
Phát hiện các CTC trong tủy xương dựa vào kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (ICC) được sử dụng rất nhiều trên thế giới. Ưu điểm của phương pháp này là ICC có thể kết hợp với FISH cho phép phân loại các tế bào ở mức độ
phân tử và phân tắch hình thái tế bào. Tuy nhiên, để xác định các tế bào có chứa cytokeratin đòi hỏi kháng thể đánh dấu cần thấm được qua màng tế bào.
Điều này sẽ gây ra chết tế bào và do đó không thể phân biệt giữa các tế bào sống và tế bào chết. Thực tế là chỉ có những tế bào sống được mới có thể phát triển thành ung thư di căn.
Những kỹ thuật phát hiện dựa vào kháng thể thường cho kết quả không
đặc hiệu vì cytokeratin cũng biểu hiện trong cả tế bào tạo máu. ICC cho phép phát hiện 1 tế bào ung thư trong số 105 tế bào bạch cầu nhưng nó không đủđộ đặc hiệu để phát hiện tổ chức nơi các tế bào ung thư thật sự có mặt.
Kỹ thuật ICC là 1 kỹ thuật đòi hỏi có sự tham gia của nhiều người và tốn thời gian. Hơn nữa, đây là kỹ thuật thao tác bằng tay rất tốn tiền nên không thể sử dụng là phương pháp thường quy để chẩn đoán ung thư [10].
1.3.3. PCR
Kỹ thuật phát hiện phân tử dựa trên acid nucleic như PCR, RT-PCR
được sử dụng phân tắch acid nucleic để nhận biết giữa tế bào tạo máu và tế
bào ung thư biểu mô. Hiện nay, đây là những kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các CTC trong tủy xương và trong máu.
PCR được phát minh bởi Kary Mullis năm 1983, và giúp ông đoạt giải Nobel hóa học năm 1993.
Nguyên lý
PCR được sử dụng để khuếch đại một chuỗi DNA (DNA đắch). Chuỗi này có thể là gen, một phần của gen, hay chuỗi không mã hóa. PCR dựa trên
hoạt động của DNA polymerase. Khi DNA polymerase tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn cần có mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn có thể bắt cặp chuyên biệt với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase nối dài mồi tạo một mạch DNA mới [4], [9].
Quy trình
Các phản ứng PCR được thực hiện với nhiều bước thay đổi nhiệt độ và lặp lại nhiều chu kỳ (thường là 20-35 chu kỳ). Nhiệt độ và thời gian mỗi chu kỳ phụ thuộc vào nhiều thông số: enzyme, nồng độ cation và dNTPs, nhiệt độ
chảy của mồi...
- Khởi đầu: cho nhiệt độ tăng đến 94-98oC, kéo dài 1-9 phút
- Biến tắnh: là bước đầu tiên của các chu kỳ lặp lại, ở nhiệt độ 94-98oC sẽ
phá vỡ nối hydrogen của chuỗi đôi DNA tạo thành các chuỗi đơn.
- Bắt cặp: nhiệt độ được hạ xuống 55-65oC để các đoạn mồi bắt cặp bổ
xung vào hai đầu của đoạn DNA đắch.
- Kéo dài chuỗi: nhiệt độ phụ thuộc vào DNA polymerase sử dụng, thường là 72oC, thắch hợp cho hoạt tắnh của DNA polymerase kéo các dNTPs lại đầu 3Ỗcủa đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5Ỗ của sợi DNA
đắch để tổng hợp mạch bổ xung mới.
- Kéo dài kết thúc: thường được thực hiện ở nhiệt độ 70-74oC trong 5-15 phút sau chu kỳ PCR cuối cùng để đảm bảo tất cả các chuỗi đơn DNA
được kéo dài đủ.
- Giữ nhiệt kết thúc: ở nhiệt độ 4-15oC, thời gian không cố định để lưu giữ phản ứng trong thời gian ngắn.
Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đắch đã được nhân thành hai bản sao, và nếu chu kỳ được lặp lại liên tục 25-35 lần thì từ 1 DNA đắch sẽđược khuếch
đại lên 225 đến 235 bản sao, tức là hàng tỷ bản sao[4], [8], [9], [27]. Thông thường tổng số chu kỳ dưới 30, nếu càng kéo dài thì khả năng xảy ra đột biến càng cao và tạo sản phẩm PCR ngoài mong muốn.
Hình 1.6. Các bước cơ bản của phản ứng PCR