Hình 1.2. Survivin Hình 1.3. Sơ đồ NST 17 và vị trắ của gen survivin
thể ghép nối.
Survivin đóng vai trò quan trọng ngăn chặn tế bào chết theo chương trình bằng cách trực tiếp hay gián tiếp ức chế hoạt hoá caspase 3 và 7 [46]. C aspases (viết tắt của cysteine-aspartic protease) là enzyme protease dạng cysteine-aspartic là một trong những yếu tố chắnh tham gia vào quá trình apoptosis. C aspases có vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis bằng cách phá hủy những enzym nhân đôi và enzym sửa chữa DNA, hoạt hóa những enzym để cắt DNA thành những mảnh nhỏ giống nhau, phá vỡ cấu trúc protein trong nhân..
* Vai trò của survivin trong phân chia tế bào
Survivin có vai trò điều hòa sự phân chia tế bào ở pha G2/M. Trong chu kỳ tế bào, survivin được phát hiện ở phần tâm ở kỳđầu/ kỳ giữa và có ở vùng giữa sợi thoi vô sắc ở kỳ sau/kỳ cuối, nhưng không phát hiện được vào thời
điểm kết thúc kỳ cuối [29]. Trong một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng survivin
tồn tại ở tâm động cho đến kỳ giữa, sau đó đến phần giữa của thoi vô sắc vào k ỳ sau và tách về phắa hai cực ở kỳ cuối nguyên phân và phân bào giảm nhiễm [44]. Survivin được cho là nằm trong nhóm protein vận chuyển nhiễm sắc thể (NST), có nhiệm vụ vận chuyển NST đến trung tâm của tế bào ở kỳ
giữa và có vai trò quan trọng trong quá trình phân bào giảm nhiễm và sự
chuyển động của NST trong phân bào nguyên phân [48].
* Vai trò của survivin trong tăng sinh mạch
Cơ chế tăng sinh mạch của survivin đóng góp vào việc bảo tồn tắnh toàn vẹn của vi cấu trúc hình ống và ức chế apoptosis ở tế bào nội mạc, làm cho tế bào này có khả năng tồn tại và chức năng bảo vệ tế bào ung thư [52].
1.2.3. Survivin trong ung thư vú
Ung thư vú xảy ra khi các tế bào mất khả năng kiểm soát sự cân bằng của quá trình tăng trưởng và chết tế bào. Bình thường, sự tăng trưởng mạnh
của tế bào này sẽ bị ức chế do số lượng tế bào chết tăng lên gọi là quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Tại trường đại học St Vincent, người ta đã nghiên cứu các protein liên quan đến sự tăng trưởng và chết của tế bào, đặc biệt có một loại protein tên là survivin. Protein này biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển vì giúp đảm bảo sự sống còn của bào thai chỉ cho đến khi sinh. Survivinđược tìm thấy trong nhiều loại ung thư
bao gồm cả ung thư vú. Điều đặc biệt có ý nghĩa là các protein này không biểu hiện ở các mô vú bình thường nhưng lại có nồng độ rất cao trong các khối u vú ác tắnh [11], [23]. Kiểu biểu hiện của protein này và chức năng ức chế quá trình apoptosis cho thấy vai trò quan trọng của survivin đối với việc duy trì sự sống của tế bào ung thư và ức chế quá trình apoptosis [17]. Survivin
biểu hiện cao trong các dòng tế bào UTV, UTP và thấp hơn nhiều trong các UT khác [50]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng survivin có thể là một chỉ thị
ung thư lý tưởng trong chẩn đoán, tiên lượng UT [18], [38], [50]. Survivin có nồng độ cao hơn đáng kể trong các hạch bạch huyết ở bệnh nhân UTV khi so sánh với mô vú bình thường đặc biệt ở bệnh nhân UTV di căn. Đó có thể là do survivin tham gia vào sự phát triển của các khối u và sự di căn của tế bào ung thư [42], [51]. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng survivin có thể tham gia vào quá trình tăng sinh tế bào ung thư và sự tăng sinh này là rất mạnh, do
đó làm mất hiệu quảđiều trị bằng hoá trị liệu [17]. Trong một nghiên cứu với trên 500 bệnh nhân UTV cho thấy nồng độ survivin càng cao thì càng có nhiều khả năng bệnh tái phát và tiên lượng sống của bệnh nhân càng giảm. Vì vậy, survivin có thể là một yếu tố dự báo tiên lượng bệnh nhân UTV [18]. Hơn nữa, mRNA của survivin đã đýợc phát hiện tới 69,2% -93,8% trên mô bệnh nhân UTV nguyên phát, mức biểu hiện của survivin có liên quan với kết quả lâm sàng của bệnh nhân [26], [34], [40]. Paul N. Span và cộng sự sau khi nghiên cứu trên 275 mô vú của bệnh nhân UTV đã được phẫu thuật, định
lượng mRNA của survivin bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan cho thấy nồng độ mRNA của survivin tỷ lệ với mức độ nặng nhẹ của bệnh nhân [38]. Như vậy, nhóm bệnh nhân có nguy cơ thấp có thể tránh những điều trị
không cần thiết và nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao sẽ phải điều trị tắch cực hơn. Những kết quả này cũng cho thấy gen survivinđược coi như là một mục tiêu đầy hứa hẹn trong điều trị cho bệnh nhân ung thư vú [38]. Một nghiên cứu khác của Shin-Ichi Yamashita và cộng sự tại bệnh viện Kumamoto, Nhật Bản, trên 76 mẫu mô của bệnh nhân UTV giai đoạn nguyên phát. Những bệnh nhân này tại thời điểm phẫu thuật được chẩn đoán là UTV chưa có di căn và
được theo dõi điều trị trong 5 năm. mRNA của survivin được đánh giá bằng kỹ thuật real-time PCR sử dụng TaqMan. Khi so sánh sự biểu hiện của
survivin trên 76 bệnh nhân UTV với các yếu tố bệnh học lâm sàng không tìm thấy sự liên quan giữa tỷ lệ survivin và các yếu tố như tuổi, tình trạng mãn kinh, tình trạng ER và PgR và loại phẫu thuật. Kết quả cho thấy khối u giai
đoạn từ T1-T4 liên quan với nồng độ của mRNA của survivin tăng dần lên (p=0.0104). Nồng độ mRNA của survivinở bệnh nhân UTV giai đoạn III cao hơn so với giai đoạn I hoặc II, bệnh nhân có di căn hạch cao hơn so với bệnh nhân không có hạch (p = 0,0001). Những bệnh nhân có biểu hiện survivin
thấp có khả năng sống sót tốt hơn đáng kể so với những bệnh nhân có biểu hiện survivin cao trong UTV giai đoạn I và II (p <0,0001). Như vậy, survivin
có thể được sử dụng như một chỉ thị mới để tiên lượng và theo dõi điều trị
UTV, nó có thể là một mục tiêu đầy hứa hẹn cho liệu pháp điều trị UTV [42], [52]. Survivin không những được nghiên cứu trên mô mà còn được nghiên cứu nhiều trên máu ngoại vi. Công trình nghiên cứu của Yie SM, Luo B và cộng sự tại trung tâm nghiên cứu UT Chengdu, Trung Quốc về sự biểu hiện của gen survivin từ các tế bào UTV lưu hành trong máu ngoại vi dựa trên kỹ
các tác giảđã phát hiện được mRNA của survivin trong các mẫu máu ngoại vi
ở 34 bệnh nhân chiếm 50,7% nhưng không phát hiện được gen này ở nhóm chứng gồm 135 phụ nữ bình thýờng khỏe mạnh. Sự biểu hiện của gen
survivin từ các tế bào UTV lưu hành trong máu ngoại vi có liên quan đáng kể
với các thông số bệnh học lâm sàng như thâm nhiễm mạch, loại mô học, kắch thýớc khối u, tình trạng hạch và các giai đoạn lâm sàng của bệnh với p<0,01. Các bệnh nhân trên đýợc theo dõi tiếp trong 36 tháng, kết quả cho thấy 9 trong số 11 bệnh nhân UTV (chiếm 81,8%) có biểu hiện survivin (+) tại thời điểm kiểm tra xét nghiệm ban đầu bị tái phát bệnh, trong khi tỉ lệ tái phát chỉ
tìm thấy trên 2 trong số 6 bệnh nhân UTV (chiếm 33,3%) mà biểu hiện
survivin (-). Vì vậy, việc phát hiện các tế bào ung thý lýu hành có biểu hiện mRNA của survivin có thể cung cấp thông tin có giá trị cho các dự báo di cãn và khả nãng tái phát của UTV [51]. Chắnh vì lý do này mà nghiên cứu đánh giá sự biểu hiện gen survivin trong máu và mô nhằm mục đắch tìm ra tế bào ung thư vú lưu hành có thể là một mục tiêu lý tưởng trong chẩn đoán, tiên lượng và theo dõi điều trị UTV.
Ở Việt Nam có rất nhiều nghiên cứu về UTV, tập trung chủ yếu vào lâm sàng, chẩn đoán hình ảnh, giải phẫu bệnh. Các nghiên cứu về gen ung thư
trong chẩn đoán và điều trị UTV chưa nhiều. Nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử trong những năm gần đây đã làm thay đổi nhiều quan niệm trong chẩn đoán và điều trị UTV. Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Phan Tôn Hoàng và PGS. Tạ Thành Văn là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng kỹ
thuật sinh học phân tử đánh giá mức độ sao chép của gen HIP (heparansulsulfate interacting protein) ở mô UTV. Các tác giả đã đưa ra những bằng chứng về sự khác biệt đáng kể mức độ sao chép mRNA của HIP
ở mô UTV so với mô u xơ vú đơn thuần. Đặc biệt mức độ sao chép này lại phụ thuộc vào giai đoạn tiến triển của khối u. Trong khi đó, biểu hiện mức độ
thấp ở 1 trong số 5 mẫu u xơ (chiếm tỷ lệ 20%) [5]. Vì vậy nghiên cứu các loại dấu ấn ung thư có bản chất là gen có thể mở ra ứng dụng phát hiện sớm, tiên lượng và theo dõi điều trị UTV. Tuy nhiên cho đến nay ở Việt Nam vẫn chưa thấy có nghiên cứu về phát hiện gen survivin trên mô và máu bệnh nhân UTV. Chắnh vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT góp phần chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ỘNghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú Ợ
1.3. Các k thu t sinh h c phân t đ phát hi n gen t các t b o ung th .
Phát hiện các CTC trong máu hoặc tủy xương đòi hỏi kỹ thuật có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao để có thể phát hiện được 1 tế bào ung thư trong số
106 Ờ 107 tế bào bạch cầu. Kỹ thuật phát hiện dựa trên acid nucleic hay miễn dịch tế bào như PCR, RT-PCR được sử dụng rất nhiều. Mỗi phương pháp đều sử dụng đặc điểm khác nhau của các CTC để phát hiện ra các CTC.
Phát hiện các CTC bằng phương pháp hóa miễn dịch dựa vào khả năng phân biệt giữa các tế bào của các tổ chức mô khác nhau của kháng thể, vắ dụ
như các tế bào biểu mô từ các tế bào tạo máu có nhân. Kháng nguyên được sử
dụng nhiều nhất trên tế bào biểu mô là cytokeratin được biểu hiện giống nhau
ở các tế bào biểu mô. Các kháng thể có đánh dấu qui định cho cytokeratin,
được phân tắch bởi sử dụng kắnh hiển vi huỳnh quang (fluorescence microscopy - FM), kỹ thuật dòng chảy (flow cytometry - FC) và thường xuyên hơn bởi kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (immunocytochemistry Ờ ICC) với kỹ thuật nhuộm peroxidase hoặc alkaline phosphatase
1.3.1. Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry Ờ IHC) Nguyên lý
Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (IHC) là phương pháp áp dụng các nguyên lý và kỹ thuật miễn dịch để nghiên cứu tế bào và mô. Dựa trên sự biểu lộ
mang tắnh đặc hiệu kháng nguyên trên bề mặt tế bào, các kháng thể đặc hiệu sẽ giúp cho việc nhận ra và phân loại các tế bào, mô. IHC được sử dụng rộng rãi trong sử dụng rộng rãi để phát hiện các tế bào bất thường trong bệnh ung thư. Trong trường hợp phổ biến nhất, một kháng thể liên hợp với một loại enzym, vắ dụ như peroxidase, có thể xúc tác cho phản ứng màu. Ngoài ra, kháng thể cũng có thể được gắn huỳnh quang như fluorescein hoặc Rhodamine.
Hình 1.5. Kỹ thuật IHC