nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú (UTV) là loại ung thư (UT) phổ biến ở phụ nữ nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. UTV chiếm gần 30% các loại ung thư ở phụ nữ, là ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ 5 trong số các loại ung thư. Theo Hội nghiên cứu ung thư Mỹ, hàng năm trên toàn thế giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 465.000 ca tử vong. Ở Anh năm 2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh mới trong đó 40.840 ca tử vong [33]. Ở Mỹ, năm 2010, hơn 207.000 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và ước tính có tới 39.800 ca tử vong [38]. Tại Việt Nam, theo ghi nhận UT giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở Hà Nội là 29,7/100.000 dân, tại TP Hồ Chí Minh tỷ lệ này là 19,4/100.000 dân, đứng đầu trong các loại UT ở nữ [1] [2] [16]. Mặc dù vào những năm 1990 trở về đõy đó có nhiều tiến bộ trong tầm soát, chẩn đoán sớm và các thuốc điều trị ngày càng có hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều trường hợp UTV được chẩn đoán ở giai đoạn muộn dẫn đến việc điều trị tốn kém về kinh tế cho bệnh nhân mà hiệu quả điều trị lại thấp. Các phương pháp cận lâm sàng được áp dụng trong chẩn đoán UT như các phương pháp chẩn đoán hình ảnh, các phương pháp sinh thiết và các phương pháp hóa sinh phát hiện các dấu ấn ung thư (tumor marker). Mỗi loại phương pháp chẩn đoán trên đều có những ưu điểm và hạn chế, do vậy thường phải kết hợp các phương pháp chẩn đoán khác nhau mới đem lại hiệu quả chẩn đoán chính xác và chẩn đoán sớm UTV. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành y sinh học phân tử, đã có nhiều phương pháp mới giúp cho việc chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV nói riêng đã được ứng dụng. Nguyên tắc chung của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định các gen gây UT có tính 1 chất gia đình, các gen nguy cơ, gen gây UT và các thương tổn đột biến gen đặc hiệu cho UT. Việc phát hiện các gen UT nếu được lấy từ cỏc mụ UT qua sinh thiết hoặc phẫu thuật sẽ có nhược điểm lớn là phát hiện muộn khi khối u đã lớn, gây đau đớn cho bệnh nhân, khó làm nhiều lần, phụ thuộc vào kỹ thuật sinh thiết nên không thể được xem là phương pháp thường quy để chẩn đoán hoặc theo dõi trong quá trình điều trị. Do vậy, các nghiên cứu phát hiện các chỉ thị UT trong máu ngoại vi có ưu điểm và đang được các nhà nghiên cứu chú ý. Các tế bào UT có nguồn gốc từ các tế bào khối u nguyờn phỏt hoặc các khối u đã di căn, sau đó thâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi. Các tế bào này gọi là các tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell -CTC). Các CTC là bằng chứng về sự di căn của các tế bào UT trước khi cú cỏc biểu hiện lâm sàng. Hơn nữa, việc phát hiện các gen UT nếu được lấy từ mẫu máu ngoại vi sẽ có ưu điểm ớt gõy đau đớn cho bệnh nhân, có thể làm nhiều lần. Vì vậy, việc sử dụng chỉ thị khối u để xác định các tế bào khối u trong máu ngoại vi đóng vai trò quan trọng, có thể góp phần chẩn đoán nhanh, chính xác bệnh. Một số gen chỉ thị khối u đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó có mRNA Survivin. Gen Survivin mã hóa một protein ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Protein này được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV, nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là protein này không biểu hiện ở cỏc mụ bình thường [4]. Có rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ thị mRNA của Survivin còn biểu hiện trong các bệnh nhân UT chưa có hạch, do vậy gen Survivin có thể được xem như là một công cụ hữu hiệu trong chẩn đoán sớm và tiên lượng UTV. Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về vấn đề này trong ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng. Chính vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu ngoại vi chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành 2 nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi ” với 2 mục tiêu: 1. Xây dựng qui trình phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi. 2. Bước đầu nhận xét giá trị của xét nghiệm phát hiện gen Survivin trong chẩn đoán ung thư vú. 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Khái niệm bệnh và dịch tễ học UTV. 1.1.1. Khái niệm bệnh Ung thư vú là tên gọi của ung thư có nguồn gốc từ mụ vỳ, phần lớn từ các ống dẫn sữa hoặc các tiểu thuỳ.UTV có nguồn gốc từ ống sữa được gọi là UT biểu mô tuyến sữa và UT có nguồn gốc từ tiểu thuỳ được gọi là UT biểu mô tiểu thuỳ.Cú nhiều dạng UTV khác nhau với trạng thái khác nhau, sự ác tính khác nhau, bản chất di truyền khác nhau và tỷ lệ sống sót khác nhau phụ thuộc vào các yếu tố này. 1.1.2. Dịch tễ học UTV * Tình hình ung thư vú trên thế giới Ung thư vú không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiều nước. Nguy cơ mắc bệnh UTV theo suốt cuộc đời người phụ nữ. Tỷ lệ mắc thay đổi nhiều, từ 25-35/100.000 dân tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan và Canada đến 1- 5/100.000 dân tại Nhật Bản, Mexico, Venezuela [16] [18] [19]. Bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở Mỹ và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở Nam Âu,Tõy Âu và thấp nhất ở châu Á. UTV có xu hướng tăng lên ở tất cả các nước đặc biệt ở Nhật Bản và Singapore, nơi có lối sống đang được phương Tây hoá và chế độ ăn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển UTV [16]. Theo Hội nghiên cứu ung thư Mỹ, hàng năm trên toàn thế giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 465.000 ca tử vong. Ở Anh năm 2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh mới trong đó 40.840 ca tử vong (Hobday & Perez, 2005). Ở Mỹ năm 2007 có 178.480 ca 4 mới được xác định mắc bệnh UTV trong đó 40.460 ca tử vong (American cancer society, statistics 2007). Tỷ lệ UTV tăng theo tuổi, hiếm gặp ở lứa tuổi 30 (khoảng 0,8%), sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng một cách nhanh chóng (khoảng 6,5% ở tuổi 30-40). Theo thống kê của hiệp hội phòng chống UT Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân ở độ tuổi 30-34 lên đến 200/100.000 dân ở độ tuổi từ 45-49 [3]. Tuy nhiên người ta nhận thấy rằng nguy cơ mắc bệnh này tăng chậm ở độ tuổi từ 45-50. Điều này gợi ý rằng UTV là loại UT có liên quan mật thiết với nội tiết. Tỷ lệ chết do UTV tăng lên theo tỷ lệ mắc [3]. Tuy nhiên, ở một số nước phát triển mặc dù tỷ lệ mắc UTV gia tăng nhanh chóng nhưng tỷ lệ chết vẫn giữ được ở mức ổn định nhờ các tiến bộ trong sàng lọc phát hiện bệnh sớm và những thành tựu đạt được trong điều trị. Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp 2 lần so với những năm 50 thế kỷ XX ở một số nước có nền công nghiệp phát triển mạnh trong các năm qua như Nhật Bản, Singapore, một số thành phố của Trung Quốc Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc ở cỏc vựng này phần nào được giải thích do sự thay đổi về lối sống, kinh tế phát triển, ngày càng có nhiều phụ nữ làm việc trong lĩnh vực công nghiệp, tuổi thọ trung bình tăng, thay đổi về sinh sản, chế độ ăn * Tình hình ung thư vú tại Việt Nam Tại Việt Nam, theo ghi nhận tình hình UT ở Hà Nội, TP Hồ Chí Minh và một số tỉnh trong nhiều năm, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi năm 2000 là 17,4/100.000 dõn,đứng đầu trong các loai UT ở phụ nữ. Khác với các nước phương tây, ở Việt Nam UTV bắt đầu tăng nhanh ở độ tuổi 35 và đạt tỷ lệ cao nhất ở độ tuổi trước và sau mãn kinh( 45-54 tuổi) rồi sau đó có xu hướng giảm xuống rõ rệt. 5 Tại Việt Nam giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở Hà Nội là 29,7/100.000 dân, tại TP Hồ Chí Minh và Cần Thơ là 19,4/100.000 dân, ở Hải phòng là 10,5/100.000 dân, ở Thái Nguyên là 11,6/100.000 dân, ở Huế là 12,2/100.000 dân. Đây là loại UT có tỷ lệ mắc đứng đầu ở phụ nữ Việt Nam. Tóm lại, UTV là bệnh phổ biến nhất trong tất cả các loại ung thư ở phụ nữ trên thế giới cũng như ở Việt Nam. 1.2. Tiến triển và các giai đoạn ung thư vú. 1.2.1. Tiến triển ung thư vú. Biểu hiện lâm sàng của UTV có đặc trưng là kéo dài và rất khác nhau giữa các bệnh nhân. Đa số các trường hợp UTV xâm lấn phát sinh từ tế bào biểu mô của thùy hoặc của ống dẫn của tuyến vú. Các tế bào bị UT hóa nhân lên với tốc độ khoảng 60 ngày một chu kỳ. Ước tính, từ khi tế bào chuyển biến ác tính đầu tiên đến khi phát hiện được khối u có kích thước 1cm thì phải mất khoảng thời gian vài năm. Chỉ một số ít bệnh nhân (< 3%) ngay sau khi xuất hiện các triệu chứng, UTV tiến triển nhanh và tử vong trong vài tháng [4] [5]. UTV có khả năng chữa khỏi ở nhiều bệnh nhân nếu bệnh được chẩn đoán trong giai đoạn tiền lâm sàng (chưa có triệu chứng hay dấu hiệu lâm sàng). Green Wood, Bloom và CS theo dõi những trường hợp UTV không điều trị, thấy thời gian sống thêm trung bình kể từ khi chẩn đoán là 31 tháng, tỷ lệ sống thêm 3 năm là 40% và 5 năm là 18 - 20%, có 4% sống thêm 10 năm [3]. Giai đoạn tại chỗ: Khối u nguyên phát xuất phát từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng, tức phần chế tiết của tuyến vú. Sau đó phát triển lan sang mô lân cận, xô đẩy tổ chức tuyến vú bình thường. Xu hướng vượt khỏi mô tuyến vú xâm nhiễm mô xung quanh đến các cấu trúc lân cận như da, làm co rút da, sần da cam, phù nề da, đỏ và loét da. Khi chỳng xõm nhiễm đến cân cơ ngực và thành ngực tạo thành một khối cứng. 6 Giai đoạn lan tràn: + Theo đường bạch huyết: Nhờ mạng lưới mạch bạch huyết dày đặc, UTV lan tới các chặng hạch trong đó hạch nách là vị trí hay gặp do đây là vị trí chính dẫn lưu dịch, bạch huyết của vú. Tiếp theo là hạch thượng đòn, rồi đi vào hệ tuần hoàn tĩnh mạch cạnh sống, đám rối này được nối trực tiếp với vú qua mạch máu liên sườn. + Theo đường máu: Các tế bào UTV có thể di căn đến khắp nơi trong cơ thể, tuy nhiên UTV thường di căn tới xương, phổi, gan, não. Khoảng 20 - 30% các bệnh nhân hạch nách âm tính nhưng có di căn xa chứng tỏ di căn theo đường máu là chủ yếu ở các bệnh nhân này. Đôi khi sự lan tràn xảy ra thêm từ hệ tĩnh mạch ở vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết của da dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực và sau đó đến màng phổi và phổi. Các tế bào UTV thường di căn rất sớm và tại thời điểm chẩn đoán được bệnh không thể phát hiện được các di căn này bằng các phương pháp chẩn đoán hiện có, do vậy vai trò của điều trị toàn thân được đặt ra ngay từ khi bệnh ở giai đoạn sớm [6] [7]. 1.2.1.Các giai đoạn của ung thư vú. * Hệ thống xếp giai đoạn TNM Dưới đây là hệ thống xếp GĐ (2004) của ủy ban Liên kết chống Ung thư Mỹ (AJCC) [27]. Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu trong đó cú cỏc nghiên cứu đa quốc gia áp dụng hệ thống xếp GĐ này. T: U nguyờn phỏt T0 Không có u nguyờn phỏt Tis (UTBM tại chỗ): UTBM nội ống, UTBM thùy tại chỗ, bệnh Paget núm vú không có u. T1 U có đường kính lớn nhất ≤ 2cm 7 T2 U có đường kính lớn nhất > 2cm và ≤ 5cm T3 U có đường kính lớn nhất > 5cm T4 U xâm lấn thành ngực hoặc da bất kể kích thước (thành ngực gồm xương sườn, cơ gian sườn, cơ răng cưa trước, không tính cơ ngực) N: Hạch vùng N0 Không di căn hạch vùng N1 Di căn hạch nỏch cựng bờn di động N2 Di căn hạch nỏch cựng bờn cố định hoặc dính nhau hoặc di căn hạch vú trong cựng bờn nhưng không di căn hạch nách. N3 Di căn hạch hạ đũn cựng bên có hoặc khụng kốm hạch nỏch cựng bờn, hoặc di căn hạch vú trong cựng bờn kốm di căn hạch nỏch cựng bờn, hoặc di căn hạch thượng đũn cựng bên có hoặc khụng kốm hạch nách hoặc hạch vú trong cựng bờn. M: Di căn xa M0 Không di căn xa M1 Có di căn xa Phân loại có những điểm mới: di căn hạch hạ đòn xếp vào N3 (trước không đề cập), di căn hạch thượng đũn khụng xếp M1 nữa mà thành N3. Di căn hạch vú trong trước đây xếp vào N3, nay phân ra khụng kốm đi căn hạch nách (N2b) và kèm di căn hạch nách (N3b) 8 * Xếp giai đoạn lâm sàng Bảng 1.1. Phân chia giai đoạn UTV GĐ TNM tương ứng 0 Tis N0 M0 I T1 N0 M0 IIA T0 N1 M1 T1 N1 M0 T2 N0 M0 IIB T2 N1 M0 T3 N0 M0 IIIA T0 N2 M0 T1 N2 M0 T2 N2 M0 T3 N1 M0 T3 N2 M0 IIIB T4 N0 M0 T4 N1 M0 T4 N2 M0 IIIC T bất kỳ, N3, M0 IV T bất kỳ, N bất kỳ, M1 1.3. Chẩn đoán ung thư vú 1.3.1. Chẩn đoán xác định Chẩn đoán xác định UTV nhất thiết phải có sự khẳng định của giải phẫu bệnh học. Giải phẫu bệnh được coi như “một tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán ung thư vú. Hiện tại Bệnh viện K, UTV được chẩn đoán xác định dựa vào 3 phương pháp: + Lâm sàng: khối u và tính chất khối u. + Chụp tuyến vú. + Mô bệnh học: chọc hút bằng kim nhỏ. 9 Nếu một trong 3 yếu tố này còn nghi ngờ phải sinh thiết tức thì để chẩn đoán xác định. Ngoài 3 phương pháp thông dụng trờn cũn một số phương pháp khác như: sinh thiết kim, sinh thiết mở, sinh thiết 48 giờ, chụp vú kỹ thuật số, siêu âm vú, chụp cộng hưởng từ hạt nhân được áp dụng cho từng trường hợp. Hiện nay, do nhiều lý do mà chẩn đoán UTV bằng kỹ thuật sinh học phân tử chưa được ứng dụng rộng rãi, mặc dù kỹ thuật này thường cho kết quả chẩn đoán chính xác và độ tin cậy cao. Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc phát hiện, chẩn đoán UTV ở phụ nữ. 1.3.2. Chẩn đoán phân biệt: - U xơ tuyến vú: thường gặp ở phụ nữ trẻ, u thường tròn nhẵn, ranh giới rõ ràng, di động. Để chẩn đoán phân biệt phải chụp X - quang tuyến vú, làm xét nghiệm mô bệnh học. - Viêm xơ tuyến vú mang hóa: có thể gặp một nang đơn độc hoặc nhiều nang to nhỏ rải rác cả hai bờn vỳ. Kích thước có thể to từ vài mm đến 10cm, khi khám có cảm giác cũng phải chẩn đoán phân biệt nhờ vào siêu âm. - Viờm giãn tuyến vú: chảy dịch đầu vú dai dẳng lúc đầu là dịch vàng trong, sau đó có thể bội nhiễm thành dịch vàng mủ hoặc chất bã có mùi hôi, một số khác chảy dịch máu. - Áp xe tuyến vú: có triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau. - Nang sữa: hình thành sau quá trình viêm tắc ống dẫn sữa, nang sữa có thể lỏng nhưng có thể đặc sền sệt. - U nhú nội ống: là những tổn thương trong lòng ống dẫn sữa thường gặp ở những ống dẫn sữa chính, tính chất u tròn, mềm có thể gây chảy dịch, máu qua núm vú. - U mỡ hoặc hoại tử mỡ ở vú: hiếm gặp - U phyloide lành tuyến vú 10 [...]... đến nay ở Vi t Nam vẫn chưa thấy có nghiên cứu về gen Survivin trên bệnh nhân UTV Chính vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu ngoại vi góp phần chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu Nghiên cứu phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi ” 32 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1... hiện Survivin (+) tại thời điểm kiểm 31 tra xét nghiệm ban đầu bị tái phát bệnh, trong khi tỉ lệ tái phát chỉ tìm thấy trên 2 trong số 6 bệnh nhân ung thư vú (chiếm 33,3%) mà biểu hiện Survivin (-) Vì vậy, vi c phát hiện các tế bào ung thư lưu hành có biểu hiện Survivin mRNA có thể cung cấp thông tin có giá trị cho các dự báo di căn và tái phát của ung thư vú [24] Như vậy có thể thấy gen Survivin có giá... mỏu ngoại vi Một công trình nghiên cứu của Yie SM, Luo B và cộng sự tại trung tâm nghiên cứu UT Chengdu,Trung Quốc về sự biểu hiện của gen Survivin từ các tế bào UTV lưu hành trong máu ngoại vi dựa trên kỹ thuật RT-PCR .Trong số 67 bệnh nhân UTV ở giai đoạn khác nhau, người ta đã phát hiện được mRNA Survivin trong các mẫu máu ngoại vi ở 34 bệnh nhân chiếm 50,7% nhưng không phát hiện được gen này ở 135... hình nghiên cứu ung thư ở động vật, hiện tượng di căn chỉ xảy ra khi phát hiện 1/10 000 CTC Kết quả này mở ra triển vọng có thể phát hiện sớm khối u dựa vào vi c phát hiện các CTC mang những gen chỉ thị đặc trưng cho khối u lưu hành trong mỏu.Vỡ thế bên cạnh 19 vi c tìm ra các dấu ấn ung thư có bản chất là protein, các dấu ấn ung thư là các gen đặc hiệu có thể góp phần chẩn đoán sớm UTV Gen Survivin trong. .. Survivin trong ung thư vú Hình 1.4 Gen Survivin Survivin là protein được mã hóa bởi gen BIRC5 Survivin là một protein thuộc nhóm chất ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào (IAP) Survivin được phát hiện vào năm 1997 bởi kỹ thuật Hybridization Screening từ thư vi n hệ gen của người Chức năng protein Survivin ức chế hoạt hoá caspase là enzyme thủy phân protein, điều hòa sự phân chia tế bào và thúc... vỳ bình thư ng và cao hơn hẳn ở bệnh nhân UTV di căn Đó có thể là do Survivin tham gia vào sự phát triển của các khối u và sự di căn của tế bào ung thư Các nhà khoa học đã thực hiện rất nhiều nghiên cứu đã nhận ra rằng Survivin có thể tham gia vào quá trình tăng trưởng của các tế bào ung thư và phát triển với tốc độ rất nhanh dẫn đến vi c dựng cỏc thuốc hoá học trị liệu để diệt tế bào ung thư là rất... thư ng khỏe mạnh Sự biểu hiện của gen Survivin từ các tế bào UTV lưu hành trong máu ngoại vi có liên quan đáng kể với các thông số bệnh học lâm sàng như thâm nhiễm mạch, loại mô học, kích thư c khối u, tình trạng hạch và các giai đoạn lâm sàng của bệnh với p . qui trình phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi. 2. Bước đầu nhận xét giá trị của xét nghiệm phát hiện gen Survivin trong chẩn đoán ung thư vú. 3 Chương. bào UT trong máu ngoại vi chẩn đoán UTV ở phụ nữ, chúng tôi tiến hành 2 nghiên cứu Nghiên cứu phát hiện gen Survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu ngoại vi ” với 2 mục tiêu: 1 có nghiên cứu nào về vấn đề này trong ung thư nói chung và ung thư vú nói riêng. Chính vì vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu ngoại