Nghiên cứu đặc ñiểm sinh học của vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô

Mở ñầu Vi tảo lục (Micro - green algae) phong phú thành phần loài ña dạng cấu trúc Chúng vi sinh vật có khả quang tự dưỡng, màu lục, ñơn bào, cộng ñơn bào dạng tập ñoàn Chúng có kích thước hiển vi, sống trôi nước, ñáy thuỷ vực, sống bám ao, hồ hồ chứa thuỷ vực nước ngọt, gặp thuỷ vực nước lợ nước biển Nhiều loài vi tảo lục có giá trị khoa học thực tiễn Ngày nay, nhiều loài vi tảo lục ñược nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu ñể ứng dụng vào số lĩnh vực như: sản xuất thực phẩm chức năng, nhiên liệu sinh học, chiết suất hợp chất sinh học, xử lý ô nhiễm môi trường, làm sinh vật thị sinh học… Rừng ngập mặn Xuân Thuỷ - (RNM Xuân Thuỷ) khu bảo tồn dự trữ sinh ñất rừng ngập mặn ðây rừng ngập mặn ñầu tiên Việt Nam ñược quốc tế công nhận theo công ước Ramsar, rừng ngập mặn thứ 50 giới RNM Xuân Thuỷ ñược nâng cấp từ khu bảo tồn ñất ngập nước Xuân Thuỷ theo ñịnh số 01/2003/Qð-TTg Thủ tướng Chính phủ Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam ngày tháng năm 2003 [6] Nhưng nay, RNM Xuân Thuỷ có tượng bị ô nhiễm môi trường tác ñộng mật ñộ dân cư vùng ñệm cao, nhiều người dân sống chủ yếu nghề khai thác nuôi trồng thuỷ sản ðiều ảnh hưởng nghiêm trọng ñến ña dạng loài thuỷ sinh vật nói chung vi tảo lục nói riêng Ngày mưu cầu mưu sinh mà nhiều người dân quanh khu vực rừng ñã khai thác ñánh bắt cách bừa bãi, làm tăng nguy cân sinh thái nơi ñây Mặt khác, ung thư bệnh chiếm tỉ lệ tử vong cao Trên giới ñã có nhiều nghiên cứu bệnh ung thư, phương thuốc ñiều trị chúng Và vi tảo phương thuốc hữu hiệu ñó ðã có nhiều nghiên cứu khả kháng chữa số bệnh ung thư vi tảo, tạo nên bước ñột phá công nghệ ngành y dược Vì lý trên, thực ñề tài: “Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh thăm dò khả kháng tế bào ung thư biểu mô” với mục ñích sau: Nghiên cứu, phân tích thành phần dinh dưỡng vi tảo Ankistrodesmus khu rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh Bảo tồn nguồn gen chủng tảo Ankistrodesmus Nghiên cứu, tách chiết ứng dụng thành phần acid béo có vi tảo Ankistrodesmus Thăm dò khả kháng tế bào ung thư biểu mô chủng vi tảo nghiên cứu Công việc ý nghĩa mặt kinh tế, xã hội, khoa học mà có ý nghĩa tiền ñề cho nghiên cứu ứng dụng khác sau Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN (RNM) XUÂN THỦY, NAM ðỊNH Hình 1.1 Bản ñồ RNM Xuân Thuỷ nhìn từ vệ tinh [22] RNM Xuân Thuỷ nằm phía ñông nam huyện Giao Thuỷ tỉnh Nam ðịnh, có toạ ñộ 20o13’48’’Bắc 106o31’00’’ ðông, cửa Ba Lạt sông Hồng Diện tích toàn vườn khoảng 7100 ha, gồm 3100 diện tích ñất có rừng 4000 ñất rừng ngập nước, bao gồm phần bãi Cồn Ngạn, Cồn Lu Cồn Xanh ðất ngập nước là: “Các vùng ñầm lầy, than bùn vùng nước tự nhiên hay nhân tạo, có nước thường xuyên hay tạm thời, nước ñứng hay nước chảy, nước ngọt, nước lợ hay nước mặn, kể vùng nước ven biển có ñộ sâu không mét thuỷ triều thấp ñều vùng ñất ngập nước” [19] Vùng ñệm RNM Xuân Thuỷ có diện tích 8000 ha, gồm phần diện tích lại Cồn Ngạn (ranh giới tính từ phía ñê biển ñến lạch sông Vọp), ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ diện tích bãi Trong diện tích xã: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc, Giao Xuân Giao Hải [6] Vùng ñệm vùng rừng, ñất vùng ñất có mặt nước nằm sát ranh giới với vườn quốc gia khu bảo tồn thiên nhiên; có tác dụng ngăn chặn giảm nhẹ xâm phạm khu rừng ñặc dụng [8] Hệ sinh thái rừng ngập mặn có vai trò to lớn ñời sống người hoạt ñộng kinh tế xã hội Rừng ngập mặn có vai trò to lớn, ñược coi nguồn tài nguyên ven biển thật quý giá hữu ích Các khu rừng ngập mặn ñóng vai trò phổi thiếu, ñảm bảo cho hệ sinh thái ven biển phát triển Hàng năm vào tháng 11 tháng 12 âm lịch, ñàn chim từ Xibêri, Hàn Quốc, Trung Quốc di cư tránh rét ñến dừng chân ñây, tích luỹ lượng, ñẻ trứng lại bay ñi Vào ngày chim cư, bơi thuyền hay len lỏi rừng sú, vẹt ngắm nhìn nhiều loài chim lạ ñi lại, kiếm ăn Tại vườn ước tính có 219 loài chim thuộc 41 họ, ñó có loài có sách ñỏ quốc tế: rẽ mỏ thìa, cò thìa, choắt mỏ thìa, mòng biển mỏ ngắn, bồ nông choắt chân màng lớn, cò lao Ấn ðộ, choắt mỏ vàng, cò trắng Trung Quốc… Trên vùng ñất ngập mặn này, nước thuỷ triều có khoảng 165 loài ñộng vật 154 loài ñộng vật ñáy, tổng cộng khoảng 500 loài ñộng vật Về thực vật, vườn có 120 loài thực vật bậc cao, ñó có nhiều loài rong tảo có giá trị kinh tế cao, ñó có gần 20 loài thích nghi với ñiều kiện sống ngập nước nên ñã cấu thành khu rừng ngập mặn Ngoài giá trị bảo tồn cao, rừng ngập mặn vườn ươm cho sống biển Nơi ñây cung cấp nguồn lợi thuỷ sản phong phú với 500 loài ñộng thực vật thuỷ sinh cỏ biển cung cấp nhiều loài thuỷ hải sản có giá trị kinh tế cao tôm, cua, cá biển, vạng, trai, sò, cá tráp, rong câu vàng… Giá trị thuỷ sản khu vực hàng năm ước ñạt tới 50 tỷ ñồng phần lớn nhờ vào ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ khu dự trữ thiên nhiên quan trọng Với ưu ñãi mà thiên nhiên ñã ban tặng, nơi ñây ñang chứa ñựng tiềm vô quý giá sinh thái biển, du lịch biển vùng ñất ñược ñánh giá có ña dạng sinh học cao Tuy nhiên vườn ñang gặp nhiều thách thức cân sinh thái, mà nguyên nhân chủ yếu tác ñộng người [1,5,22] Chim giang sen quý Cò mỏ thìa mặt ñen Gà nước ñầu ñỏ Cò trắng lớn Rừng ngập mặn Xuân Thủy Hình 1.2 Một vài hình ảnh ñộng, thực vật RNM Xuân Thuỷ [22] ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI TẢO LỤC VÀ VI TẢO Ankistrodesmus 1.2.1 Vi tảo lục Vi tảo lục gồm tế bào sống ñơn ñộc, tế bào sống thành tập ñoàn, ña dạng Cấu trúc tế bào vi tảo lục có tốc ñộ tiến hóa khác Tế bào dạng amip ñến dạng phân hóa mô Vi tảo lục phân bố rộng khắp, từ nước nghèo dinh dưỡng ñến nước lợ, nước biển, hay vật ẩm sống mặt ñất Hình dạng cấu trúc chung tế bào vi tảo lục ña dạng, dạng monas ñơn ñộc hay tập ñoàn: có dạng sợi (Fristchiella), dạng hạt, dạng màng, dạng ống,… Phần lớn vi tảo lục có dạng hình cầu (Chlorella), hình bầu dục, hình vuông, hình chữ nhật hay hình lưỡi liềm (Ankistrodesmus) Cấu tạo vách tế bào vi tảo lục ñơn giản, có hai loại: vách trần vách xenluloza Trên vách có mấu lồi gai phân bố với chức bảo vệ thể, giúp tế bào trôi ðôi số loài vi tảo có gai phát triển thành sừng gọi tảo sừng (Golenkinia, Scenedesmus) Ngoài số loài khác có bao nhầy bao bọc vách tế bào Có chức bảo vệ thể, tham gia trình dinh dưỡng thể nhờ lớp vi khuẩn sống cộng sinh với lớp nhầy Phần lớn vi tảo lục có màu lục cỏ Sắc lạp cấu tạo thực vật gồm hai lớp màng bao bọc, bên có chất (stroma) với hệ thống túi dẹt gọi thylakoid Sắc lạp hình phiến, hình lưới, hình dải, hình trụ, hình cốc, hình sao… Thường có – thylakoid xếp chồng lên Trên màng thylakoid có nhiều chất diệp lục chlorophyll a b, xantophyl enzyme tham gia trình quang hợp Có hay nhiều pyranoid (nhân tinh bột hay nhân protein) Nhiệm vụ chủ yếu pyraniod tổng hợp tinh bột Sản phẩm dự trữ tinh bột, có dầu (lipit) Trên sắc lạp tảo lục ñơn bào hay tế bào sinh sản di ñộng thường có ñiểm mắt màu ñỏ Phần lớn tế bào di ñộng vi ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ tảo lục có sợi lông roi (tiên mao) dài trơn nhẵn Một số loài lông roi ráp có lông nhỏ mặt Có loài bề mặt lông roi có hay vài tầng vẩy nhỏ Các tế bào di ñộng tảo lục thường có lông roi, số có lông roi, lông roi hay nhiều nằm trước tế bào Cũng có có sợi lông roi Phần lớn tế bào tảo lục có nhân nằm có số tế bào ña nhân Hệ thống không bào vi tảo lục chủ yếu làm nhiệm vụ tiết [2,4,36] • Vai trò vi tảo lục Vi tảo nói chung vi tảo lục nói riêng có vai trò quan trọng tự nhiên ñời sống nhân loại ðại dương chiếm 71% diện tích bề mặt trái ñất Hàng năm vi tảo tổng hợp ñại dương 70 – 280 tỷ chất hữu Trong thủy vực nước chúng cung cấp oxy hầu hết thức ăn sơ cấp cho cá ñộng vật thủy sinh khác Vi tảo lục góp phần bảo vệ môi trường nuôi trồng thủy sản cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa Như “phát triển nhóm vi tảo lục Chlorella” cách hợp lý có tác dụng khống chế phát triển vi khuẩn Vibrio harveyi (vi khuẩn phát sáng gây bệnh làm tôm chết ñáy ao), lợi ích phiêu sinh thực vật trình hấp thụ ánh sáng mặt trời quang hợp tạo oxy cho tôm, cá hấp thụ CO2 làm môi trường nước ñược cải thiện tốt [35] Nhiều tảo ñơn bào ñược nuôi công nghiệp ñể tạo nguồn thức ăn cho ngành nuôi tôm, ngành nuôi trồng thủy sản cho loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ñối với giai ñoạn ấu trùng bào ngư, loài giáp xác, số loài cá cho sinh vật phù du • Ứng dụng vi tảo lục ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Vi tảo lục có vai trò lớn hệ sinh thái, ñã có nghiên cứu nước giới ứng dụng vi tảo sản phẩm vi tảo sống Các chất thực phẩm sản phẩm chức quan trọng thị trường từ vi tảo bao gồm hợp chất β-caroten, acid béo không no (PUFA) EPA DHA, polysaccarozo β-glucan [16] Chlorella, Ankistrodesmus Scenedesmus loài vi tảo ñã ñược sử dụng ñể xử lý nước thải ô nhiễm hữu từ bột giấy nghiền bột giấy xay dầu oliu [14] Vi tảo ñã ñược sử dụng ñể loại bỏ kim loại nặng từ nước thải [15,21] Chlorella, Scenedesmus có khả hấp thụ số kim loại nặng như: Hg, Cr, Cu, Se, As nhằm giảm bớt hàm lượng chúng nước thải [19] Nhóm nhà khoa học Nga ðức E Safarova ñứng ñầu ñã nghiên cứu khả sử dụng chủng tảo Scenedesmus obliquus ES-55 phân hủy sinh học chất phenathrene (C14H10), ñây hợp chất thơm ña vòng ñược dùng ñể chế tạo thuốc nhuộm dược phẩm Kết cho thấy, ñiều kiện tế bào ñược chiếu sáng sinh sản pha log, chất phenathrene bị phân hủy nồng ñộ 10 mg/l Khả phân hủy chất môi trường BBM ñạt ñược tới 42%, ñối với môi trường Kuhl ñạt 24% [19] Bước ñầu phát số acid béo vi tảo phục vụ cho khả kháng tế bào ung thư, chữa số bệnh người Các loại acid béo omega-3, omega-6 có ứng dụng lớn khả ngăn ngừa, chữa số loại bệnh ung thư ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ruột kết, ung thư vú [34] 1.2.2 Vi tảo Ankistrodesmus 1.2.2.1 Vị trí phân loại (taxon) vi tảo Ankistrodesmus Theo tài liệu “Tảo nước Việt Nam - Phân loại tảo lục (Chlorococcales)” Dương ðức Tiến, Võ Hành [2] tài liệu “Vi tảo ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ (microaglae)” Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Hoài Hà [4], vị trí vi tảo lục Ankistrodesmus hệ thống phân loại tảo ñược xếp sau: Giới: Plantae Ngành: Chlorophyta Lớp: Chlorophyceae Bộ: Sphaeropleales Họ: Ankistrodesmaceae Chi: Ankistrodesmus 1.2.2.2.ðặc ñiểm sinh học vi tảo Ankistrodesmus Tế bào vi tảo Ankistrodesmus thường dài – có hình kim, hình suốt, cong – dạng hình lưỡi liềm Chúng ñứng riêng lẻ, thành ñám xoắn lại với nhau, ñôi tạo thành chùm xung quanh tảo khác [23] Các tế bào liên kết với thành cụm từ – 32 tế bào, tế bào dài, vót nhọn hai ñầu Tế bào gắn với tế bào khác trung tâm thể, nằm song song xếp tỏa tròn Tế bào lớp màng nhày bao bọc; có lục lạp; hạt tinh bột Vi tảo Ankistrodesmus sinh sản vô tính bào tử gốc [24] Vi tảo Ankistrodesmus phổ biến, chúng thường ñược tìm thấy ao hồ nước ngọt, ñôi sống vũng nước thác nước [24] ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng, phát triển vi tảo Ankistrodesmus Sự phát triển vi tảo Ankistrodesmus phụ thuộc vào nhiều yếu tố ñộ pH, nhiệt ñộ, ánh sáng, ñộ ẩm, chất lượng nước, môi trường dinh dưỡng + Ánh sáng Giống bao loài thực vật khác, vi tảo phải quang hợp, tức chúng hấp thụ carbon vô ñể chuyển hoá thành chất hữu Trong ñó, ánh sáng nguồn lượng cho trình quang hợp Vì vậy, ảnh hưởng ánh sáng cần phải ñược xem xét khía cạnh như: cường ñộ ánh sáng, phổ ánh sáng, thời gian chiếu sáng Mặc dù, ánh sáng ban ngày ñủ cung cấp cho quang hợp Nhưng cường ñộ ánh sáng ban ngày lại phụ thuộc lớn vào ñiều kiện thời tiết, khí hậu ñịa phương, thay ñổi ñột ngột cường ñộ ánh sáng, thời gian chiếu sáng (do thời tiết thay ñổi) làm ảnh hưởng ñến trình sinh trưởng vi tảo, chí làm cho vi tảo tàn lụi hàng loạt Vì mà có nhiều nghiên cứu ánh sáng nhân tạo ñể thích hợp cho việc nuôi cấy vi tảo + Nhiệt ñộ Vi tảo Ankistrodesmus sống khoảng nhiệt ñộ từ 16 – 30oC Nếu nhiệt ñộ cao 30oC tảo bị chết thấp 16oC vi tảo chậm phát triển + ðộ pH Sự biến ñộng pH môi trường ñều có ảnh hưởng tới phát triển vi tảo Ankistrodesmus Nếu pH cao thấp ñều làm chậm tốc ñộ tăng trưởng vi tảo Mức pH tốt cho phát triển vi tảo từ 7.2 – 8.2 Trong trình quang hợp vi tảo hấp thụ mạnh CO2 làm cho pH tăng cao + Môi trường dinh dưỡng ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ ðể mô tả xác ñịnh tên loài, ñã sử dụng số ñặc ñiểm hình thái chủng vi tảo Các hình thái ñược phát vào khả phát triển vi tảo cần nghiên cứu môi trường chuẩn ñoán ñã ñược thừa nhận sử dụng phương pháp soi kính kiển vi quang học Kết ñược trình bày hình 3.6 Quan sát kính hiển vi huỳnh quang Zeiss, thấy chủng A có tế bào dài, cong hình lưỡi liềm, thu hẹp dần phía cuối nhọn Các tế bào ñứng riêng lẻ, thành ñám xoắn lại với Các tế bào dính với phần lưng, theo Hình 3.6 Hình thái chủng A hướng khác Chúng liên kết thành tập ñoàn từ – 32 tế bào, kích thước chiều dài tế bào ño ñược 9.34 µm bề rộng 325 µm ðể xác ñịnh rõ chủng tiến hành phân loại theo phương pháp sinh học phân tử dựa phân tích giải trình tự gen rDNA 18S 3.4.2 Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử Trình tự ñặc thù nucleotide DNA quy ñịnh hình thành ñặc ñiểm tảo Người ta ñã tách ñược DNA tảo, nhân ñoạn gen cần quan tâm giải mã trình tự gen chúng Mỗi loài có trình tự nucleotide khác ñó ñây sở cho tiến hóa Giải mã trình tự gen công cụ quan trọng ñể giải nhiều vấn ñề thuộc phân loại học Do vậy, tiến hành phân tích giải trình tự rDNA 18S vi tảo Ankistrodesmus A sau: ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 34 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ • Ankistrodesmus A GTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCAGTCTAAGTATAAAC TGCTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACCTC TACACGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACGTGCGCAAATCCCGACTTCTGGAAGGGA CGTATTTATTAGATAAAAGGCCGACCGGGCTCTGCCCGACCCGCGGTGAATCATGATAACTTC ACGAATCGCATAGCCTTGTGCTGGCGATGTTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGAT GGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGA GGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCT GATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCATTCAATGTCTGGTAATTGGAATG AGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGG TAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTTATAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTT CGGGTGGGTTCCAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTGGCCTTCC Kết phân tích máy ñọc trình tự tự ñộng 3100 Avant, dùng chương trình Blastn ñoạn gen ñược gửi so sánh với trình tự gen mã hóa cho rDNA ñã ñược ñăng ký ngân hàng liệu gen quốc tế (NCBI) ðây công việc ñơn giản máy tính giúp ta hoàn thành tính toán cần thiết ñể tối thiểu hóa số khoảng trống lỗi bắt cặp sai trật tự ñược so sánh Nhận thấy trình tự chủng A có ñộ dài 676 bp, có ñộ tương ñồng ñạt 99% so với loài Ankistrodesmus gracilis có ký hiệu Y16937 3.5 NHÂN NUÔI VÀ THU SINH KHỐI VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A Qua nghiên cứu khả sinh trưởng môi trường dinh dưỡng tìm môi trường thích hợp cho sinh trưởng vi tảo Ankistrodesmus gracilis A môi trường BBM, ñộ pH tối ưu cho sinh trưởng phát triển khoảng – 8, tiến hành nhân nuôi sinh khối chủng vi tảo Ankistrodesmus gracilis A qua cấp nhân giống quy mô phòng thí nghiệm Nuôi giữ nhiệt ñộ phòng ánh sáng ñèn neon với cường ñộ sáng 10000 – 20000 Lux theo quang chu kì 10h chiếu sáng 14h tối ñể thu sinh khối cho thí nghiệm Mẫu tảo sau ñã phân lập khiết ñược chuyển sang bình tam giác ñể nhân nuôi sinh khối theo quy trình sau: ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 35 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Mẫu giống lọ Pennicillin Nhân vào bình tam giác 250 ml Bình tam giác 500 ml Cấy chuyển Bình nhựa lít Bổ sung MT, sục khí (24/24), ánh sáng Bình nhựa lít Bổ sung MT, sục khí (24/24), ánh sáng Bình nhựa 20 lít Làm lắng Thu sinh khối Hình 3.7 Sục khí nuôi sinh khối Hình 3.8 Thu sinh khối Sinh khối tảo ñược thu vào lúc kết thúc pha log, vào giai ñoạn sớm pha cân Thu sinh khối vi tảo sau ngày nuôi cấy thứ 12 Lượng sinh ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 36 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ khối vi tảo tươi ñược xử lý qua trình chiết vi tảo, thu ñược cặn chiết sử dụng cho nghiên cứu 3.6 XÁC ðỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO CÓ TRONG VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A Các acid béo chủ yếu tồn màng tế bào ñây ñặc ñiểm ñể phân loại vi tảo Trong nghiên cứu tiến hành phân tích thành phần acid béo chủng tảo Ankistrodesmus gracilis A Kết ñược trình bày bảng 3.3 hình 3.9 STT Acid béo Danh pháp Tên thường gọi Thời Hàm gian lưu lượng (Rt) (%) 14: Tetradecanoic acid Myristic 12.08 0.535 15: Pentadecanoic acid Convolvulinolic 13.09 0.159 15: 1n-5 Pentadecenoic acid Hormelic 13.45 0.074 16: Hexadecanoic acid Palmitic 17.20 21.533 16: 1n-7 9-hexadecenoic acid Palmitoleic 18.09 10.329 16: 1n-9 11-hexadecenoic Ambrettolic 19.40 2.059 17: Heptadecanoic acid 21.85 3.036 17: 1n-7 Heptadecenoic acid 22.82 10.647 18: 1n-7 11-octadecenoic acid Asclepic 25.17 14.919 10 19: Nonadecanoic acid Isoarachidic 27.40 10.646 11 18: 3n-3 9,12,15- Anpha-linoleic 29.26 0.851 12 18: 4n-3 30.83 18.175 acid Margric octadecatrienoic acid acid Octadecatetraenoic acid Moroctic acid ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 37 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 13 20: Eicosanoic acid Arachidic 32.09 2.553 14 20: 1n-9 11-Eicosaenoic acid Eicosenoic acid 32.78 0.602 15 20: 4n-6 5,8,11,14- Arachidonic eicosatetraenoic acid acid (AA) 39.11 0.025 16 20: 4n-3 8,11,14,17- Eicosatetraenoic eicosatetraenoic acid acid (ETA) 40.32 0.053 17 22: 4n-6 Docosatetraenoic Adrenic acid 48.32 0.212 18 24: 52.62 0.277 acid Tetracosanoic acid Lignoceric Bảng 3.3 Thành phần acid béo hàm lượng chủng Ankistrodesmus gracilis A Hình 3.9 Sơ ñồ sắc kí khí thành phần acid béo chủng Ankistrodesmus gracilis A ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 38 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Từ bảng 3.3 hình 3.9 cho thấy chủng Ankistrodesmus gracilis A có thành phần acid béo cao, gồm 18 loại acid ñó có 11 loại acid béo không no, chiếm 59.93% tổng số acid Tỷ lệ acid béo khác nhau, acid palmitic (16: 0) chiếm tỷ lệ cao 21.533% tổng số acid béo, tiếp ñến octadecatetraenoic acid (acid omega-3 ña nối ñôi) (18: 4n-3) với tỷ lệ 18.175%, có asclepic (18: 1n-7) 14.919%, tỷ lệ palmitoleic (16: 1n-7) 10.329%, thấp tỷ lệ arachidonic acid (20: 4n-6) 0.025% Trong thành phần acid béo , có nhiều acid béo có giá trị dinh dưỡng cao ñặc biệt quan trọng ñối với người như: arachidonic acid (AA) (20: 4n-6) 0.025%, anpha-linoleic acid (18: 3n-3) 0.851% ñặc biệt palmitoleic (16: 1n-7) 10.329% Nhìn chung thành phần acid béo không no chủng vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có thành phần ña dạng thuộc hai nhóm acid béo không no omega-3 omega-6, acid quan trọng ñối với thể người Qua bảng thấy hàm lượng acid béo không no có hàm lượng cao palmitic hàm lượng acid béo AA, EPA không cao, ñặc trưng cho vi tảo lục trái ngược hoàn toàn với tảo silic [9,18] 3.7 XÁC ðỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A Qua nghiên cứu ứng dụng thực tiễn thấy hợp chất có vi tảo lục ñã có ñóng góp ñáng kể ñời sống người Chúng giúp tăng cường trí tuệ, tăng sức ñề kháng, cải thiện hệ miễn dịch người Chúng có khả sửa chữa tế bào bị tổn thương tái tạo tế bào mới, chống lão hóa tế bào làm chậm trình lão hóa ðặc biệt khả chữa tiêu diệt số tế bào bệnh ung thư ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư ruột, ung thư tủy… người [34,37] Sinh khối vi tảo tươi ñược chiết dung môi methanol/ chloroform (1:1, v/v) ñem cô quay chân không thu cặn chiết khô ñem thực phép thử ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 39 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ hoạt tính sinh học diệt ức chế tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) Kết ño ñược bước sóng 540 nm máy spectrophotometer Genios TECAN tính toán, mẫu ño có nồng ñộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) nhỏ 128 µg/ml có tác dụng phòng ñiều trị ung thư mức tế bào Kết thu ñược bảng 3.4 hình 3.10 IC50 IC50 (µg/ml) (µg/ml) STT Tên loài Amphiprora alata 84.17 Ankistrodesmus gracilis A 26.50 Chaetoceros muelleri 67.24 Chlorella vulgaris 78.98 Gyrosigma limosum >128 Merosira nummuloides >128 Navicula radiosa >128 Navicula tuscula 67.24 Scenedesmus sp >128 10 Scenedesmus quadricauda >128 28.57 Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính sinh học diệt ức chế tế bào ung thư biểu mô miệng Kết cho thấy nồng ñộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) vi tảo Ankistrodesmus gracilis A 26.5 µg/ ml lần thử 28.57 µg/ ml lần thử Trong số 10 loài vi tảo ñem ñi thăm dò khả kháng tế bào ung thư, vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có tác dụng ức chế khả tăng sinh tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) mô hình thực nghiệm mức cao Vi tảo ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 40 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Ankistrodesmus gracilis A thể tiềm kháng tế bào ung thư có tác dụng phòng ñiều trị ung thư mức tế bào (a) (b) Hình 3.10 Mật ñộ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm (a) Mẫu ñối chứng (b) Mẫu thử nghiệm với cặn chiết Ankistrodesmus gracilis A Cũng từ hình 3.10, nhận thấy mật ñộ tế bào ung thư biểu mô miệng khả liên kết, tế bào bị phá vỡ, số lượng tế bào giảm ñáng kể Vậy hợp chất vi tảo lục thể kháng tế bào ung thư biểu mô miệng, thành phần acid béo hay chlorophyll hợp phần cấu tử ñó ðể tìm hiểu rõ tiếp tục tiến hành phân tích mẫu sinh khối vi tảo Ankistrodesmus gracilis A sắc ký mỏng nhằm xác ñịnh khả phân tách cấu tử tương ứng chất có thành phần ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 41 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ A A Hình 3.11 Kết chạy sắc ký mỏng Kết sắc ký mỏng cho thấy cấu tử thành phần hoàn toàn tách biệt, thể vệt màu mỏng ðặc biệt ñối vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh ñược chạy sắc ký lần 2, vệt mầu lên rõ rệt, gồm có: vệt cao màu xanh, vệt thấp hơn, vệt hoàn toàn tách biệt nên có khả cạo tách cấu tử ðiều mở khả nghiên cứu tách chiết xác ñịnh cụ thể thành phần cấu tử ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 42 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ KẾT LUẬN Chủng vi tảo lục Ankistrodesmus gracilis A ñều phát triển tốt bốn môi trường C, BBM, BG 11, Bold 3N Trong ñó phát triển tốt môi trường BBM mật ñộ tế bào ñạt 62.8 x 106/ml, pH tối ưu cho sinh trưởng chủng vi tảo Ankistrodesmus gracilis A – 8, hàm lượng vi tảo ñạt 0.054 0.056 mg/ml Dựa vào phương pháp phân loại truyền thống phương pháp phân loại ñại dựa phân tích giải trình tự gen rDNA 18S, chủng vi tảo lục Ankistrodesmus A ñược xác ñịnh thuộc loài Ankistrodesmus gracilis có kí kiệu Y16937 Hàm lượng acid béo ñối với chủng cao, ñặc biệt chủng có chứa thành phần acid béo không no quan trọng arachidonic acid (AA) (20: 4n-6) 0.025%, anpha-linoleic acid (18: 3n-3) 0.851% ñặc biệt palmitoleic (16: 1n-7) 10.329% Với nồng ñộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) vi tảo Ankistrodesmus gracilis A 28.57 µg/ml Vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có tác dụng ức chế khả tăng sinh tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) mô hình thực nghiệm mức cao ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 43 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả kháng tế bào ung thư biểu mô vi tảo chủng Ankistrodesmus gracilis A, phân tích rõ thành phần cấu tử có khả ức chế tế bào ung thư biểu mô Cần phải tiếp tục nghiên cứu, phân tích thành phần sinh hóa khác như: protein, vitamin, hydrate, carbon… Do ñiều kiện nghiên cứu chưa cho phép, chưa tiến hành nuôi thử quy mô công nghiệp chủng Ankistrodesmus gracilis ñể dùng cho nuôi trồng thủy sản Vì cần tiếp tục nghiên cứu ñánh giá tác ñộng chủng tới sinh trưởng, phát triển thủy sản ñể sớm ñưa vào nuôi trồng thủy sản, nhằm tăng chất lượng, tăng suất giảm giá thành nuôi trồng thủy sản ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 44 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Ban quản lý vườn quốc gia Xuân Thủy (2004), “Quy hoạch quản lý bảo vệ phát triển vườn quốc gia Xuân Thủy, giai ñoạn 2004 – 2020”, Nam ðịnh Dương ðức Tiến, Võ Hạnh (1997), Tảo nước Việt Nam, Phân loại tảo lục (chlorococcales), NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, ðặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi ðức Lợi, Lê Doãn Diên, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Hoài Hà (2006), Vi tảo, Viện vi sinh vật công nghệ sinh học Phan Nguyên Hồng, Lê Xuân Tuấn, Phan Thị ðào (2007), “Báo cáo: ða dạng sinh học vườn quốc gia Xuân Thủy” MERC-MCD, Hà Nội Quyết ñịnh số 01/2003/Qð-TTg ngày 02/01/2003 Thủ tướng phủ V/v: chuyển khu bảo tồn ñất ngập nước Xuân Thủy thành vườn quốc gia Xuân Thủy, tỉnh Nam ðịnh Robert Edward Lee (1999), Tảo học (Phycology), Cambridge University Press (tài liệu ñã dịch) Tại ñiều 8-Qð số 08/2001/Qð-TTg ngày 11/01/2001 Thủ tướng phủ V/v: ban hành quy chế quản lý rừng ñặc dụng, rừng phòng hộ, rừng sản xuất rừng tự nhiên Tài liệu tiếng Anh: Anders S Carlasson, Jan B van Beilen, Ralf Moller and David Clayton (2007), “Micro- and Macro- algae: untility for industrial applications”, Realising the Economic Potential of Sustainable Resources_Bioproducts from Non-food Crops, University of York ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 45 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 10 Dr Akihiko Shirota, “The Plankton of south Vietnam – Fresh water and Marine Plankton”, Overseas technical cooperation agency, p:225-416 11 Makoto Shirai, Katsumi Matumaru, Akio Ohotake, Yoshichika Takamura, Tokujiro Adia and Masayasu Nakano, 1989, Development of a solid medium for growth and isolation of asenic microsytis strains (Cyanobacteria) Appl environ microbial 55 (10): p2569 – 2571 12 Michael T art Bruce C wainman Editor, Lipids in Fesh water Ecosytem, page 23 13 Miller L.T (1982), “Single derivatization method for routine analasyis of bacterial whole cell fatty acid metyl esters, including hydroxyl acid”, Journal of Clinical Microbiology, Vol.16, pp 584 – 586 14 Munoz R., Guieysse B (2006), “Algal-Bacterial processes for the treatment of hazondous contaminants”, A review Water Research 40: 2799 – 2815 15 Perales – Vela HV., Pena – Castro JM., Canizares – Villanueva RO (2006), “Heavy metal detoxification in eukaryotic microalgae”, Chemosphere 64: – 10 16 Pulz O., Gross W (2004), “Valuable products from biotechnology of microalgae”, Applied Microbiology and Biotechnology 65: 635 – 648 17 Safarova K., Kvitko P., Kuschk M., Murder W (2005), “Biodegradation of Phenanthrene by the green alga Scenedesmus obliquus ES-55”, Enginneering in Life Sciences, 5(3), pp 234 – 239 18 Shirora A (1966), “The plankton of south Viet Nam Fresh Water and Marine Plankton”, Overseas Technical Cooperation Agency Japan 19 The Ramsar Convention Secretariat (2007), “The Ramsar Information Pack”, Rue Mauverney 28, CH – 1196 Gland, Switzerland, Information Papper No.1 20 Watanabe M.M., and Kasai F (1985), NIES-collection list of strains, st ed., The National Institute for Environmental Studies, The Environmental Agency, Tsukuba, Japan Pp 97 ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 46 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 21 Wilde EW., Benemanann JR (1993), “Bioremoval of Heavy – Metals by the Use of Microalgae”, Biotechnology Advances 11: 781 – 812 Trang Web tham khảo: 22 http://vuonquocgiaxuanthuy.org.vn/? 23 http://en.wikipedia.org/wiki/Ankistrodesmus 24.http://siklicasechidick.conncoll.edu/Lucidkeys/Carolina_Key/html/Ak_Main html 25 http://www.thucphamvadoisong.vn 26 http://www.zenithinternational.com 27 http://vietnamnet.vn/khoahoc/xuhuong/2004/09/264668 28 http://dactrung.net/phorum/tm.asp 29 http://www.thuocbietduoc.com.vn/home/newdt8749tt1ev5.aspx 30 http://wikipedia.org/wiki/Ung_thu 31 http://www.tinsuckhoe.com 32 http://www.parkwaycancercentre.com/vietnam 33 http://www.lifecare.vn/news.aspx?tab0=4&tab1=4&id=2 34 Nguồn tài liệu: Rong biển dược liệu Việt Nam trang 52, 80 http://www.lifecare.vn/news.aspx?tab0=3&tab1=4&id=15 35 http://thuysan.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=453&articleId=3258 36 http://online.tvu.edu.vn/ (TT ñào tạo trực tuyến từ xa ðH VinhChương 1: ðặc ñiểm sinh học số ngành tảo thường gặp.) 37 http://www.yduocngaynay.com/8-8TK_TrVHung_Omega3_UngThu.htm 38.http://www.3dchem.com/moremolecules.asp?ID=238&othername=omega3%20essential%20fatty%20acid 39.http://www.nutifood.com.vn/Default.aspx?pageid=142&mid=320&breadcru mb=265&intSetItemId=265&action=docdetailview&intDocId=4108 ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 47 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 40.http://vietbao.vn/suc-khoe/omega-3-ngua-ung-thu-tien-liettuyen/30114539/248/ 41 http://drviet.com.vn/nha-khoa-cong-dong/ung-thu-vung-mieng.html 42.http://nhakhoathammy.com.vn/nha-khoa-cong-dong/ung-thu-vungmieng/313-ung-thu-bieu-mo-vung-mieng.html 43.http://www.hanoimoi.com.vn/newsdetail/doi_song/306235/ti-le-mac-ung-thugan-viet-nam-dung-thu-3-the-gioi.htm ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 48 [...]... bệnh ung thư ñã nêu thì ung thư biểu mô là một bệnh rất hay gặp như ung thư biểu mô nhú, ung thư biểu mô tủy, ung thư biểu mô gan, ung thư biểu mô da, ung thư biểu mô vòm họng [43] Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (ví dụ như ở ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hóa), thông thư ng là ñột biến ñiểm, nó tạo ra bất ổn về di truyền trong tế bào [30] Ung thư biểu mô bắt nguồn từ bên... nghiên cứu Vi tảo ñược nghiên cứu là vi tảo lục Ankistrodesmus phân lập từ các mẫu thu ñược ở RNM Xuân Thủy, Nam ðịnh 2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian thu mẫu ðịa ñiểm thu mẫu: Rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam ðịnh (các ñiểm khoanh tròn trên hình 2.1) Thời gian tiến hành nghiên cứu: Từ tháng 07/ 2009 ñến tháng 06/ 2010 tại phòng Sinh học tảo, Vi n Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội Hình 2.1... thử ñộc tế bào in vitro ñược vi n Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử ñộc tố tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở ñiều kiện in vitro Dòng tế bào ung thư ở người KB (Humanepidermic carcinoma) ñược cung cấp bởi ATCC là dòng luôn ñược sử dụng trong các phép thử ñộ ñộc tế bào Tế bào ung thư ñược nuôi cấy trong môi trường... sinh tế bào với sự gia tăng peroxyl hóa lipid; 11 nghiên cứu chú trọng ñến khả năng của omega-3 ngăn cản ñược suy mòn (cachexia); 6 nghiên cứu ghi nhận acid béo omega-3 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư bằng các cơ chế tác ñộng loại ức chế sự tạo sinh các mạch máu nuôi tế bào ung thư (angiogenesis), ức chế hoạt ñộng của ras-protein hay ức chế các men giúp tế bào ung thư xâm lấn vào... và omega-6 ñều có hoạt tính diệt bào ñối với các tế bào ung thư vú, phổi và tuyến nhiếp hộ, và không tác ñộng trên các tế bào bình thư ng Trên thực tế, các acid béo chưa no lại có nhiều nối ñôi có hoạt tính diệt bào (in vitro) ít nhất là ñối với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các cơ quan khác nhau [37] Ngoài acid béo omega-3 và omega-6, trong tế bào vi tảo còn có Chlorophyll (diệp lục) a và. .. mẫu tảo và dịch môi trường ở các môi trường nuôi cấy là ñồng nhất, dựa vào kết quả ñếm tế bào ñể tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp: mật ñộ tế bào ở môi trường nào là nhiều nhất thì ñó là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo nghiên cứu 2.3.4 Phương pháp xác ñịnh sự ảnh hưởng của pH tới tốc ñộ sinh trưởng ðể xác ñịnh mức ñộ ảnh hưởng và tối ưu của pH tới tốc ñộ sinh trưởng của. .. chặn khả năng xâm nhập hay gây ra sự phân nhiễm của các tế bào ung thư [37] Có khá nhiều nghiên cứu in vitro và trên thú vật ñã ñược thực hiện và công bố Cho ñến ñầu thập niên 2000, có ít nhất là 57 nghiên cứu in vitro ñược công bố và trong số này có 47 bản ghi nhận là các acid béo omega-3 có tác dụng ức chế sự phát triển, ngăn chặn khả năng xâm nhập hay gây ra sự phân nhiễm của các tế bào ung thư [37]... 3.1 Khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau của chủng vi tảo A x 106 tb/ml 70 Số lượng tế bào 60 50 C 40 BBM 30 BG 11 Bold 3N 20 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Ngày nuôi cấy Hình 3.3 Khả năng sinh trưởng của chủng vi tảo A trên các môi trường khác nhau Từ kết quả bảng 3.1 và hình 3.3 cho thấy chủng vi tảo A sinh trưởng tốt nhất trên môi trường BBM, sau ñó là môi trường BG 11, môi trường Bold 3N và. .. xác ñịnh bằng cách so sánh thời gian lưu (retention time) của mẫu với thời gian lưu của dung dịch chuẩn và ñược ñịnh lượng bằng so sánh các peak với chuẩn 2.3.8 Phương pháp thử ñộc tính tế bào – khả năng kháng tế bào ung thư Dịch chiết tảo ñược gửi ñi phân tích tại Phòng Thử hoạt tính Sinh học, Vi n Hóa học, Vi n Khoa học và Công nghệ Vi t Nam theo phương pháp sau: ═════════════════════════════════════════════════════... của mẫu vi tảo phân lập 2.3.3 Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng ðể xác ñịnh khả năng sinh trưởng của loài vi tảo nghiên cứu chúng tôi tiến hành nuôi trực tiếp tảo trên các môi trường ñược trình bày trong phụ lục 1, sau ñó tiến hành ñếm tế bào ñịnh kì 2 ngày/lần trên các môi trường nuôi cấy ñể tìm ra thời gian sinh trưởng tối ña và môi trường nuôi cấy tối ưu nhất *Phương pháp ñếm tế bào bằng buồng