Nghiên cứu đặc ñiểm sinh học của vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô

Ngày nay, nhiều lồi vi tảo lục được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu để ứng dụng vào một số lĩnh vực như: sản xuất thực phẩm chức năng, nhiên liệu sinh học, chiết suất các hợp chất

Vi tảo lục (Micro - green algae) phong phú về thành phần lồi và đa dạng

về cấu trúc Chúng là những vi sinh vật cĩ khả năng quang tự dưỡng, màu lục, đơn bào, cộng đơn bào và hiếm hơn là dạng tập đồn Chúng cĩ kích thước hiển

vi, sống trơi nổi trong nước, dưới đáy các thuỷ vực, sống bám trên các ao, hồ và các hồ chứa của thuỷ vực nước ngọt, hiếm gặp trong các thuỷ vực nước lợ và nước biển

Nhiều lồi vi tảo lục cĩ giá trị khoa học và thực tiễn Ngày nay, nhiều lồi

vi tảo lục được các nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu để ứng dụng vào một số lĩnh vực như: sản xuất thực phẩm chức năng, nhiên liệu sinh học, chiết suất các hợp chất sinh học, xử lý ơ nhiễm mơi trường, làm sinh vật chỉ thị sinh học…

Rừng ngập mặn Xuân Thuỷ - (RNM Xuân Thuỷ) là khu bảo tồn dự trữ sinh quyển đất rừng ngập mặn ðây là rừng ngập mặn đầu tiên ở Việt Nam được quốc tế cơng nhận theo cơng ước Ramsar, là rừng ngập mặn thứ 50 của thế giới RNM Xuân Thuỷ được nâng cấp từ khu bảo tồn đất ngập nước Xuân Thuỷ theo quyết định số 01/2003/Qð-TTg của Thủ tướng Chính phủ Cộng hồ xã hội chủ nghĩa Việt Nam ngày 2 tháng 1 năm 2003 [6]

Nhưng hiện nay, RNM Xuân Thuỷ cĩ hiện tượng bị ơ nhiễm mơi trường

do tác động của mật độ dân cư trong vùng đệm cao, nhiều người dân sống chủ yếu bằng nghề khai thác và nuơi trồng thuỷ sản ðiều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự đa dạng của các lồi thuỷ sinh vật nĩi chung và vi tảo lục nĩi riêng

Ngày nay do mưu cầu mưu sinh mà nhiều người dân quanh khu vực rừng

đã khai thác đánh bắt một cách bừa bãi, làm tăng nguy cơ mất cân bằng sinh thái nơi đây

Mặt khác, ung thư là căn bệnh chiếm tỉ lệ tử vong cao nhất hiện nay Trên thế giới đã cĩ rất nhiều nghiên cứu về bệnh ung thư, về những phương thuốc

rất nhiều nghiên cứu về khả năng kháng và chữa một số bệnh ung thư của vi tảo, tạo nên một bước ñột phá trong công nghệ ngành y dược

Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu ñặc ñiểm

sinh học của vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô” với mục ñích

sau:

1 Nghiên cứu, phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo

Ankistrodesmus trong khu rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh

2 Bảo tồn nguồn gen chủng tảo Ankistrodesmus

3 Nghiên cứu, tách chiết và ứng dụng thành phần acid béo có trong vi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN (RNM) XUÂN THỦY, NAM đỊNH

Hình 1.1 Bản ựồ RNM Xuân Thuỷ nhìn từ vệ tinh [22]

RNM Xuân Thuỷ nằm ở phắa ựông nam huyện Giao Thuỷ tỉnh Nam định,

có toạ ựộ 20o13Ỗ48ỖỖBắc và 106o31Ỗ00ỖỖ đông, ngay tại cửa Ba Lạt của sông Hồng

Diện tắch toàn bộ vườn khoảng 7100 ha, gồm 3100 ha diện tắch ựất nổi có rừng và 4000 ha ựất rừng ngập nước, bao gồm phần bãi trong của Cồn Ngạn, Cồn Lu và Cồn Xanh đất ngập nước là: ỘCác vùng ựầm lầy, than bùn hoặc vùng nước tự nhiên hay nhân tạo, có nước thường xuyên hay tạm thời, nước ựứng hay nước chảy, nước ngọt, nước lợ hay nước mặn, kể cả các vùng nước ven biển có

ựộ sâu không quá 6 mét khi thuỷ triều thấp ựều là các vùng ựất ngập nướcỢ [19]

Vùng ựệm RNM Xuân Thuỷ có diện tắch là 8000 ha, gồm phần diện tắch còn lại của Cồn Ngạn (ranh giới tắnh từ phắa trong ựê biển ựến lạch sông Vọp),

diện tích của bãi Trong và diện tích của 5 xã: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc, Giao Xuân và Giao Hải [6]

Vùng ñệm là vùng rừng, ñất hoặc vùng ñất có mặt nước nằm sát ranh giới với các vườn quốc gia và khu bảo tồn thiên nhiên; có tác dụng ngăn chặn hoặc giảm nhẹ sự xâm phạm khu rừng ñặc dụng [8]

Hệ sinh thái rừng ngập mặn có vai trò hết sức to lớn trong ñời sống con người và các hoạt ñộng kinh tế xã hội Rừng ngập mặn có vai trò rất to lớn, nó ñược coi là nguồn tài nguyên ven biển thật sự quý giá và hữu ích Các khu rừng ngập mặn ñóng vai trò như lá phổi không thể thiếu, ñảm bảo cho hệ sinh thái ven biển phát triển

Hàng năm vào tháng 11 tháng 12 âm lịch, từng ñàn chim từ Xibêri, Hàn Quốc, Trung Quốc di cư tránh rét ñến dừng chân tại ñây, tích luỹ năng lượng, ñẻ trứng rồi lại bay ñi Vào những ngày chim về cư, nếu bơi thuyền hay len lỏi trong rừng sú, vẹt có thể ngắm nhìn rất nhiều loài chim lạ ñi lại, kiếm ăn Tại vườn ước tính có 219 loài chim thuộc 41 họ, trong ñó có 9 loài có trong sách ñỏ quốc tế: rẽ mỏ thìa, cò thìa, choắt mỏ thìa, mòng biển mỏ ngắn, bồ nông choắt chân màng lớn, cò lao Ấn ðộ, choắt mỏ vàng, cò trắng Trung Quốc…

Trên vùng ñất ngập mặn này, dưới làn nước thuỷ triều có khoảng 165 loài ñộng vật nổi và 154 loài ñộng vật ñáy, tổng cộng khoảng 500 loài ñộng vật Về thực vật, vườn hiện có 120 loài thực vật bậc cao, trong ñó có nhiều loài rong tảo

có giá trị kinh tế cao, trong ñó có gần 20 loài thích nghi với ñiều kiện sống ngập nước nên ñã cấu thành khu rừng ngập mặn

Ngoài giá trị bảo tồn cao, rừng ngập mặn còn là một vườn ươm cho sự sống của biển Nơi ñây cung cấp nguồn lợi thuỷ sản phong phú cùng với 500 loài ñộng thực vật thuỷ sinh và cỏ biển cung cấp nhiều loài thuỷ hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá biển, vạng, trai, sò, cá tráp, rong câu chỉ vàng… Giá trị về thuỷ sản ở khu vực hàng năm ước ñạt tới 50 tỷ ñồng phần lớn là nhờ vào

khu dự trữ thiên nhiên quan trọng này Với những ưu ñãi mà thiên nhiên ñã ban tặng, nơi ñây ñang chứa ñựng những tiềm năng vô cùng quý giá về sinh thái biển, du lịch biển và là vùng ñất ñược ñánh giá có sự ña dạng sinh học cao Tuy nhiên vườn ñang gặp rất nhiều thách thức do mất cân bằng sinh thái, mà nguyên nhân chủ yếu là sự tác ñộng của con người [1,5,22]

Chim giang sen quý Cò mỏ thìa mặt ñen

Gà nước ñầu ñỏ Cò trắng lớn

Rừng ngập mặn Xuân Thủy Hình 1.2 Một vài hình ảnh về ñộng, thực vật trong RNM Xuân Thuỷ [22]

1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI TẢO LỤC VÀ VI TẢO Ankistrodesmus

1.2.1 Vi tảo lục

Vi tảo lục gồm các tế bào sống ựơn ựộc, các tế bào sống thành tập ựoàn,

ựa dạng Cấu trúc tế bào vi tảo lục có tốc ựộ tiến hóa khác nhau Tế bào ở dạng amip ựến dạng phân hóa ra các mô Vi tảo lục phân bố rộng khắp, từ nước ngọt nghèo dinh dưỡng ựến nước lợ, nước biển, hay trên vật ẩm hoặc sống ngay dưới mặt ựất

Hình dạng cấu trúc chung của tế bào vi tảo lục rất ựa dạng, có thể dạng

monas ựơn ựộc hay tập ựoàn: có dạng sợi (Fristchiella), dạng hạt, dạng màng, dạng ống,Ầ Phần lớn vi tảo lục có dạng hình cầu (Chlorella), hình bầu dục, hình vuông, hình chữ nhật hay hình lưỡi liềm (Ankistrodesmus)

Cấu tạo vách tế bào vi tảo lục rất ựơn giản, chỉ có hai loại: vách trần và vách xenluloza Trên vách có mấu lồi hoặc gai phân bố với chức năng bảo vệ cơ thể, giúp tế bào trôi nổi đôi khi một số loài vi tảo có gai phát triển thành sừng

gọi là tảo sừng (Golenkinia, Scenedesmus)

Ngoài ra còn một số loài khác có bao nhầy bao bọc ngoài vách tế bào Có chức năng bảo vệ cơ thể, tham gia quá trình dinh dưỡng của cơ thể nhờ lớp vi khuẩn sống cộng sinh với lớp nhầy

Phần lớn vi tảo lục có màu lục như cỏ Sắc lạp cấu tạo như thực vật gồm hai lớp màng bao bọc, bên trong có chất nền (stroma) cùng với các hệ thống các túi dẹt gọi là thylakoid Sắc lạp có thể hình phiến, hình lưới, hình dải, hình trụ, hình cốc, hình saoẦ Thường có 2 Ờ 6 thylakoid xếp chồng lên nhau Trên màng thylakoid có nhiều chất diệp lục chlorophyll a và b, xantophyl và các enzyme tham gia và quá trình quang hợp Có một hay nhiều pyranoid (nhân tinh bột hay nhân protein) Nhiệm vụ chủ yếu của pyraniod là tổng hợp tinh bột Sản phẩm dự trữ tinh bột, ngoài ra còn có dầu (lipit) Trên sắc lạp của tảo lục ựơn bào hay tế bào sinh sản di ựộng thường có ựiểm mắt màu ựỏ Phần lớn tế bào di ựộng của vi

tảo lục có sợi lông roi (tiên mao) dài bằng nhau và trơn nhẵn Một số loài lông roi ráp vì có lông nhỏ trên mặt Có loài trên bề mặt lông roi có một hay vài tầng vẩy nhỏ Các tế bào di ñộng ở tảo lục thường có 2 lông roi, một số ít có 4 lông roi, 8 lông roi hay nhiều hơn nằm ở trước tế bào Cũng có khi chỉ có 1 sợi lông roi Phần lớn tế bào tảo lục có một nhân nằm ở chính giữa nhưng cũng có một số

tế bào ña nhân Hệ thống không bào ở vi tảo lục chủ yếu làm nhiệm vụ bài tiết [2,4,36]

• Vai trò của vi tảo lục

Vi tảo nói chung và vi tảo lục nói riêng có vai trò rất quan trọng trong tự nhiên và ñời sống nhân loại

ðại dương chiếm 71% diện tích bề mặt trái ñất Hàng năm vi tảo có thể tổng hợp ra trong ñại dương 70 – 280 tỷ tấn chất hữu cơ Trong các thủy vực nước ngọt chúng cung cấp oxy và hầu hết thức ăn sơ cấp cho cá và các ñộng vật thủy sinh khác Vi tảo lục góp phần bảo vệ môi trường nuôi trồng thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khoáng dư thừa Như “phát triển nhóm vi tảo lục

Chlorella” một cách hợp lý có tác dụng khống chế sự phát triển của vi khuẩn

Vibrio harveyi (vi khuẩn phát sáng gây bệnh làm tôm chết ở ñáy ao), ngoài ra lợi ích của phiêu sinh thực vật trong quá trình hấp thụ ánh sáng mặt trời quang hợp

sẽ tạo ra oxy cho tôm, cá hấp thụ CO2 làm môi trường nước ñược cải thiện tốt hơn [35]

Nhiều tảo ñơn bào ñược nuôi công nghiệp ñể tạo ra những nguồn thức ăn cho ngành nuôi tôm, trong ngành nuôi trồng thủy sản cho các loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ, ñối với giai ñoạn ấu trùng của bào ngư, loài giáp xác, một số loài cá và cho sinh vật phù du

• Ứng dụng của vi tảo lục

Vi tảo lục có vai trò rất lớn trong hệ sinh thái, ngoài ra ñã có những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về ứng dụng của vi tảo và các sản phẩm vi tảo trong cuộc sống

Các chất thực phẩm và sản phẩm chức năng quan trọng trên thị trường từ

vi tảo bao gồm các hợp chất như β-caroten, acid béo không no (PUFA) như EPA

và DHA, polysaccarozo như β-glucan [16]

Chlorella, Ankistrodesmus hoặc Scenedesmus là loài vi tảo ñã ñược sử

dụng ñể xử lý nước thải ô nhiễm hữu cơ từ bột giấy và nghiền bột giấy và xay dầu oliu [14] Vi tảo ñã ñược sử dụng ñể loại bỏ kim loại nặng từ nước thải

[15,21] Chlorella, Scenedesmus còn có khả năng hấp thụ một số kim loại nặng

như: Hg, Cr, Cu, Se, As nhằm giảm bớt hàm lượng của chúng trong nước thải [19]

Nhóm các nhà khoa học Nga và ðức do E Safarova ñứng ñầu ñã nghiên

cứu khả năng sử dụng chủng tảo Scenedesmus obliquus ES-55 phân hủy sinh học

chất phenathrene (C14H10), ñây là một hợp chất thơm ña vòng ñược dùng ñể chế tạo thuốc nhuộm và dược phẩm Kết quả cho thấy, dưới ñiều kiện tế bào ñược chiếu sáng và sinh sản trong pha log, chất phenathrene bị phân hủy ở nồng ñộ 10 mg/l Khả năng phân hủy chất này trong môi trường BBM ñạt ñược tới 42%, trong khi ñối với môi trường Kuhl ñạt 24% [19]

Bước ñầu phát hiện một số acid béo trong vi tảo phục vụ cho khả năng kháng tế bào ung thư, chữa một số bệnh ở người Các loại acid béo omega-3, omega-6 có ứng dụng rất lớn trong khả năng ngăn ngừa, chữa một số loại bệnh ung thư như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ruột kết, ung thư vú [34]

1.2.2 Vi tảo Ankistrodesmus

1.2.2.1 Vị trí phân loại (taxon) của vi tảo Ankistrodesmus

Theo tài liệu “Tảo nước ngọt Việt Nam - Phân loại bộ tảo lục (Chlorococcales)” của Dương ðức Tiến, Võ Hành [2] và tài liệu “Vi tảo

(microaglae)” của Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Hoài Hà [4], vị trí của vi tảo

lục Ankistrodesmus trong hệ thống phân loại tảo ñược sắp xếp như sau:

1.2.2.2.ðặc ñiểm sinh học của vi tảo Ankistrodesmus

Tế bào vi tảo Ankistrodesmus

thường dài – có hình kim, hình con suốt, hoặc cong – dạng hình lưỡi liềm Chúng có thể ñứng riêng lẻ, hoặc thành ñám xoắn lại với nhau, ñôi khi nó tạo thành chùm xung quanh những tảo khác [23] Các tế bào liên kết với nhau thành từng cụm

từ 4 – 32 tế bào, tế bào dài, vót nhọn ra hai ñầu Tế bào này gắn với tế

bào khác ở trung tâm của cơ thể, nằm song song trên sự sắp xếp tỏa tròn

Tế bào không có lớp màng nhày bao bọc; có một lục lạp; không có hạt

tinh bột Vi tảo Ankistrodesmus sinh sản vô tính bằng bào tử gốc [24]

Vi tảo Ankistrodesmus rất phổ biến, chúng thường ñược tìm thấy

trong những ao và hồ nước ngọt, ñôi khi sống ở những vũng nước và

những thác nước [24]

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng, phát triển của vi tảo

Ankistrodesmus

Sự phát triển của vi tảo Ankistrodesmus phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố

như ñộ pH, nhiệt ñộ, ánh sáng, ñộ ẩm, chất lượng nước, môi trường dinh dưỡng

+ Ánh sáng

Giống như bao loài thực vật khác, vi tảo cũng phải quang hợp, tức là chúng hấp thụ carbon vô cơ ñể chuyển hoá thành các chất hữu cơ Trong khi ñó, ánh sáng chính là nguồn năng lượng cho quá trình quang hợp Vì vậy, ảnh hưởng của ánh sáng cần phải ñược xem xét ở các khía cạnh như: cường ñộ ánh sáng, phổ ánh sáng, và thời gian chiếu sáng Mặc dù, ánh sáng ban ngày ñủ cung cấp cho sự quang hợp Nhưng cường ñộ ánh sáng ban ngày lại phụ thuộc rất lớn vào ñiều kiện thời tiết, khí hậu ñịa phương, những thay ñổi ñột ngột về cường ñộ ánh sáng, thời gian chiếu sáng (do thời tiết thay ñổi) có thể làm ảnh hưởng ñến quá trình sinh trưởng của vi tảo, thậm chí làm cho vi tảo tàn lụi hàng loạt Vì thế mà

có nhiều nghiên cứu về ánh sáng nhân tạo ñể thích hợp cho việc nuôi cấy vi tảo

+ Nhiệt ñộ

Vi tảo Ankistrodesmus có thể sống trong khoảng nhiệt ñộ từ 16 – 30oC Nếu nhiệt ñộ cao hơn 30oC thì tảo có thể bị chết và nếu thấp hơn 16oC thì vi tảo chậm phát triển

+ ðộ pH

Sự biến ñộng về pH của môi trường ñều có ảnh hưởng tới sự phát triển của

vi tảo Ankistrodesmus Nếu pH quá cao hoặc quá thấp ñều làm chậm tốc ñộ tăng

trưởng của vi tảo Mức pH tốt nhất cho sự phát triển của vi tảo là từ 7.2 – 8.2 Trong quá trình quang hợp vi tảo hấp thụ rất mạnh CO2 làm cho pH tăng cao

+ Môi trường dinh dưỡng

Dinh dưỡng là yếu tố vô cùng quan trọng ảnh hưởng mạnh tới sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo Môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng cả trên phương diện số lượng và chất lượng Trong nuôi sinh khối, mật ñộ tảo sẽ cao hơn nhiều so với ngoài tự nhiên Chính vì vậy, sau một thời gian chất dinh dưỡng trong môi trường sẽ bị giảm sút và ta phải bổ sung dinh dưỡng cho sự phát triển của vi tảo

+ Nguyên tố vi lượng và vitamin

Ngoài những yếu tố trên, còn một yếu tố nữa ảnh hưởng ñến sự sinh trưởng của chúng là những nguyên tố vi lượng Các nguyên tố vi lượng gồm một

số các muối kim loại với nồng ñộ thấp như: CuSO4, CoCl2, ZnSO4… Vai trò của các nguyên tố vi lượng này hầu như ñều có tác dụng ñến quá trình trao ñổi chất của vi tảo

Vitamin cũng ñược sử dụng khá phổ biến ñể bổ sung vào môi trường nuôi cấy, dù chỉ với một lượng nhỏ nhưng có thể thúc ñẩy sự gia tăng sinh khối của vi tảo

1.3 ACID BÉO TRONG VI TẢO

1.3.1 Khái niệm về acid béo

Acid béo là các chuỗi nguyên tử carbon thẳng và dài, chứa khoảng 12-22 nguyên tử (C12-C22) Chúng có một ñầu hoà tan trong nước và ñầu metyl hoà tan trong dầu Dọc theo chuỗi carbon là các nguyên tử hydro Những chuỗi này

là thành phần quan trọng trong màng của mọi sinh vật sống [3,27]

Về mặt cấu trúc hoá học, acid béo thông thường chứa 3 loại nguyên tố: carbon, hydro và oxy Mạch thẳng (RCOOH)- trong ñó gốc R có nhiều carbon nối mạch có thể no (không có mạch nối ñôi) hay chưa no (có một hoặc nhiều nối ñôi) Acid béo bậc thấp có ít carbon, bậc cao có nhiều carbon ðầu là nhóm acid: -COOH (vì vậy mới gọi là acid béo) và ñuôi là nhóm metyl: -CH3

Acid béo là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào ñộng vật và thực vật, có thành phần hoá học và cấu tạo khác nhau, nhưng chúng có tính chất chung là không hoà tan trong nước mà hoà tan trong các dung môi hữu

cơ (ete, benzen, tuluen, ) Chất béo là hợp chất cấu tạo quan trọng của các màng sinh học, nguồn cung cấp năng lượng, các vitamin A, D, E, F và K cho cơ thể Chính vì những tác dụng không thể thiếu của chúng ñối với cơ thể con người mà ngày nay ñã có rất nhiều các nhà khoa học nghiên cứu về acid béo trên nhiều ñối tượng khác nhau, với mục ñích sản xuất ra một số lượng lớn acid béo phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khoẻ của con người [3,25]

1.3.2 Vai trò của acid béo

• Ngăn ngừa xơ vữa ñộng mạch, ñiều hoà tính bền vững của thành mạch: nâng cao tính ñàn hồi và hạ thấp tính thấm của thành mạch

• Có liên quan ñến cơ chế chống ung thư

• Cần thiết cho các chuyển hoá các vitamin nhóm B

• Một số tổ chức như: gan, não, tim, các tuyến sinh dục có nhu cầu cao về các acid béo chưa no, nên khi không ñược cung cấp ñủ từ thức ăn thì các rối loạn sẽ xuất hiện ở các cơ quan này trước tiên

• Chất béo tham gia vào cấu trúc tất cả các mô, là thành phần thiết yếu của tế bào, của các màng cơ thể và có vai trò ñiều hoà sinh học cao

• Trong cơ thể chất béo là nguồn dự trữ năng lượng lớn nhất

• Chất béo kéo dài thời gian thức ăn ở dạ dày và ñi qua ñường tiêu hoá, tạo cảm giác no sau khi ăn Mặt khác chất béo tạo cảm quan ngon lành cho thực phẩm

1.4 KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA VI TẢO

Trong các loại acid béo thì acid omega-3 và omega-6 là hai acid quan trọng có giá trị thực tiễn cao [12,25]

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hóa học

acid béo omega-3 (acid oleic)

[26,38]

Hình 1.4 Mô hình cấu trúc hóa học

acid béo omega-6

[26]

Acid béo omega-3 là tiền chất của DHA (docosahexaenoic acid) và EPA (eicosapentanoic acid) DHA là acid béo không no với chuỗi 22 carbon và chứa

6 nối ñôi, còn EPA là acid béo không no có 20 carbon và chứa 5 nối ñôi Trong

cơ thể EPA ñược xem là acid béo thiết yếu vì sẽ chuyển hoá thành các chất sinh học quan trọng như prostaglandin, leucotrien Còn DHA là acid béo quan trọng cho hoạt ñộng trí não [39]

Acid béo omega-3 có tác dụng ức chế sự sự phát triển, ngăn chặn khả năng xâm nhập hay gây ra sự phân nhiễm của các tế bào ung thư [37] Có khá

nhiều nghiên cứu in vitro và trên thú vật ñã ñược thực hiện và công bố Cho ñến ñầu thập niên 2000, có ít nhất là 57 nghiên cứu in vitro ñược công bố và trong số

này có 47 bản ghi nhận là các acid béo omega-3 có tác dụng ức chế sự phát triển, ngăn chặn khả năng xâm nhập hay gây ra sự phân nhiễm của các tế bào ung thư [37]

Trong số 66 thử nghiệm trên thú vật thì có 36 nghiên cứu ghi nhận acid béo omega-3 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư và chặn di căn bằng giai ñoạn tràn lan của tế bào ung thư (metastasis), khi thử nơi chuột,

bọ; 7 nghiên cứu ghi nhận có sự liên quan trực tiếp giữa hoạt tính chống bội sinh

tế bào với sự gia tăng peroxyl hóa lipid; 11 nghiên cứu chú trọng ñến khả năng của omega-3 ngăn cản ñược suy mòn (cachexia); 6 nghiên cứu ghi nhận acid béo omega-3 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư bằng các cơ chế tác ñộng loại ức chế sự tạo sinh các mạch máu nuôi tế bào ung thư (angiogenesis), ức chế hoạt ñộng của ras-protein hay ức chế các men giúp tế bào ung thư xâm lấn vào các tế bào lành mạnh khác; 5 nghiên cứu chứng minh là acid béo làm tăng sự hiệu nghiệm của các thuốc dùng trong hóa chất trị liệu

Khi nghiên cứu thử nghiệm trên người về hoạt tính chống ung thư của acid béo omega-3, thì có 7 nghiên cứu ghi nhận EPA có thể ngăn chặn cachexia (sự suy mòn) gây ra do bướu ung thư, và có 4 nghiên cứu về tác ñộng của acid béo omega-3 trên hoạt ñộng miễn nhiễm của người bị bệnh ung thư

Tóm lại, các thử nghiệm in vitro, trên thú vật và nơi người cho thấy acid

béo omega-3 có thể ức chế sự bội sinh của tế bào, ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư qua cơ chế hoạt ñộng ”trung gian ñiều hành các gốc tự do” Khi dùng liều trung bình, acid béo omega-3 có thể hữu hiệu qua các cơ chế hoạt ñộng khác như ức chế tiến trình sưng – viêm, ức chế angiogenesis, ức chế hoạt ñộng ras-protein Liều trung bình cũng có tác dụng ức chế Suy mòn do ung thư (Tumor cachexia) [37]

Ngoài tác dụng ngăn chặn các bệnh về tim mạch, chứng trầm cảm hay một vài căn bệnh ung thư ñã ñược nhắc tới nhiều, giờ ñây omega-3 còn có thêm công dụng ngăn chặn sự tiến triển căn bệnh ung thư tuyến tiền liệt Bác sĩ Mick Brown

và các cộng sự tại viện Paterson – thuộc bệnh viện Christie de Manchester ñã tìm hiểu và phát hiện acid béo omega-3 ngăn chặn sự sinh trưởng của các tế bào mầm bệnh ung thư tuyến tiền liệt [40]

Tiến sĩ Rashida A Karmali của viện ðại học Rutgers và trung tâm nghiên cứu ung thư Memorial Sloan-Kettering ñã nghiên cứu thấy rằng acid béo omega-

3 ñã có những ñặc tính ñáng ñược nghiên cứu và phát huy ñể nó có thể trở thành loại thuốc ngừa chống vài loại ung thư như ung thư vú và ung thư ruột già [28]

Khi bổ sung acid béo omega-3, có thể giúp giảm nguy cơ bị khối u nguy hiểm ở những người dễ có nguy cơ mắc bệnh ung thư ruột

Theo hãng tin AFP, ñể có kết luận trên, các nhà khoa học Mỹ ñã khảo sát

ở 55 người có nguy cơ mắc bệnh ung thư ruột cao Cụ thể, 28 người ñược chọn vào nhóm bổ sung 2 gam chất acid béo omega-3 mỗi ngày, trong khi 27 người còn lại dùng giả dược Sau 6 tháng, số khối u ñã tăng lên khoảng 10% ở những người dùng giả dược và giảm 12% ở những người dùng viên bổ sung acid béo omega-3 Ngoài ra kích cỡ khối u cũng tăng lên 17% ở nhóm dùng giả dược, trong khi ñó kích cỡ khối u lại giảm 12.5% ở nhóm người còn lại [29]

Tiến sĩ dược khoa Trần Việt Hưng cũng cho rằng, cả hai acid béo omega-3

và omega-6 ñều có hoạt tính diệt bào ñối với các tế bào ung thư vú, phổi và tuyến nhiếp hộ, và không tác ñộng trên các tế bào bình thường Trên thực tế, các

acid béo chưa no lại có nhiều nối ñôi có hoạt tính diệt bào (in vitro) ít nhất là ñối

với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các cơ quan khác nhau [37]

Ngoài acid béo omega-3 và omega-6, trong tế bào vi tảo còn có Chlorophyll (diệp lục) a và b cùng caroten và xanthophin, chứa chất dự trữ là tinh bột, chất béo [33] Chlorophyll có những ứng dụng khác nhau trong y học, công nghiệp Trong y học, chlorophyll ñược chú ý nhiều như một thành phần cơ bản cho khẩu phần ăn kiêng chữa bệnh và như là chất chữa bệnh Thí dụ chlorophyllin dẫn xuất kim loại của chlorophyll, có tiềm năng phòng chống các chất gây ung thư từ thức ăn bị thiu mốc như hydrocarbon mạch vòng, aflatoxin Chlorophyll và các dẫn xuất còn ñược sử dụng như chất thụ cảm ánh sáng ñể diệt các tế bào ung thư và chống virut, chất kháng bổ thể, chất chữa vết thương và khử mùi hôi [34]

Chlorophyll ức chế phát triển của vi khuẩn, kắch thắch việc phục hồi các

mô ựã bị hư hại và bảo vệ con người khỏi các chất gây ung thư Chlorophyll còn giúp tiêu hóa tốt và làm cho da thêm ựẹp

đã có những công trình nghiên cứu khả năng chữa bệnh của các hợp chất với chlorophyll ựể chữa, tiêu diệt tế bào ung thư tủy, virut leukemia ước tắnh (malignant melanoma) Chlorophyll còn có tác dụng giảm viêm khớp (arthritis)

xử lý các u xơ, giảm mùi hôi, giảm ựường máu của người bệnh già [34]

Ngoài những bệnh ung thư ựã nêu thì ung thư biểu mô là một bệnh rất hay gặp như ung thư biểu mô nhú, ung thư biểu mô tủy, ung thư biểu mô gan, ung thư biểu mô da, ung thư biểu mô vòm họng [43]

Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (vắ dụ như ở ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hóa), thông thường là ựột biến ựiểm, nó tạo ra bất

ổn về di truyền trong tế bào [30]

Ung thư biểu mô bắt nguồn từ bên trong da hay, trong các mô nằm trên hoặc bao phủ các cơ quan bên trong [32] Nguyên nhân gây ung thư biểu mô là

sự sai hỏng của DNA, tạo nên các ựột biến ở các gen thiết yếu ựiều khiển quá trình phân bào cũng như các cơ chế quan trọng khác Một hoặc nhiều ựột biến ựược tắch lũy lại sẽ gây ra sự tăng sinh không kiểm soát và tạo thành khối u [30]

Vị trắ này có liên quan ựến ung thư khoang miệng (mồm) và hầu họng (phần của họng) [31] Ung thư khoang miệng là một trong 10 bệnh ung thư thường gặp nhất ở Việt Nam Hàng năm, số lượng bệnh nhân mới ung thư khoang miệng tới

20000 người, chiếm từ 6 Ờ 15% tổng số các loại ung thư Tuy là loại ung thư dễ dàng quan sát ựược nhưng phần lớn bệnh nhân ung thư khoang miệng lại ựến khám ở giai ựoạn muộn, khi tổn thương ung thư ựã lan rộng Bệnh dễ bị bỏ qua bởi những tổn thương khiến người bệnh lầm tưởng họ chỉ bị những viêm nhiễm trùng ựơn giản [41] Phương pháp phòng bệnh ựược khuyến cáo ựối với ung thư khoang miệng là sử dụng các biện pháp vệ sinh răng miệng thật tốt, không nên

sử dụng vôi khi ăn trầu, không hút thuốc lá và có cuộc sống lành mạnh Khi nặng quá thì biện pháp phẫu thuật vẫn ñược xem là phương pháp tối ưu kéo dài tuổi thọ cho bệnh nhân [42] Ngoài ra việc bổ sung những acid béo không no có lợi cho cơ thể như acid béo omega-3 sẽ làm giảm các tế bào gây ung thư biểu mô [31]

CHƯƠNG 2 ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Vi tảo ñược nghiên cứu là vi tảo lục Ankistrodesmus phân lập từ các mẫu

thu ñược ở RNM Xuân Thủy, Nam ðịnh

2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian thu mẫu

ðịa ñiểm thu mẫu: Rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam ðịnh (các ñiểm

CH3COONa Merk, ðức Chlorofrom Merk, ðức

Protease K Merk, ðức Isoamyl alcohol Merk, ðức

FeSO4 7H2O Merk, ðức Ethanol Merk, ðức

EDTA Merk, ðức Agarose Merk, ðức

Tris (hydroxymethyl) Sigma, ðức Tricine buffer Merk, ðức

aminomethane

Na2SiO3 Merk, ðức Fe_EDTA Merk, ðức

Vitamin B12 Sigma, ðức ZnSO4 7H2O Merk, ðức

MgSO4 Merk, ðức NaNO3 Merk, ðức

Agarose Sigma, ðức Na2MoO4 2H2O Trung Quốc

NaCl 4H2O Trung Quốc Na2CO3 Trung Quốc

2.1.4 Máy móc và dụng cụ thí nghiệm

Sử dụng các dụng cụ có sẵn tại phòng Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn

Vi sinh vật và các phòng thí nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội

- Kính hiển vi quang học (Olympus, Zeiss)

- Kính lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)

- Máy sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, HPLC 1100, ðức)

- Máy ly tâm Sigma, Mỹ

- Máy ño pH (Osi, Pháp)

- Máy nhân gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ)

- Máy Sequencer ABM Prism 3100-Avant (ABI, Mĩ)

- Chlorolab2, Hansatech Intruments Ltd., Anh

- Bộ ñiện di nằm (Bio-Rad, Mĩ)

2.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Trong nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi vi tảo, các môi trường nuôi

tảo ñược sử dụng bao gồm: môi trường BBM, Bold 3N, C, BG 11 (Phụ lục 1)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp ñiều tra thu mẫu vi tảo lục ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam ðịnh

• Dụng cụ lấy mẫu: vợt lấy mẫu, panh, kẹp, dao cạo

• Dụng cụ ñựng mẫu: mẫu ñược ñựng trong các chai nhựa PE hoặc ống facon có nắp nhựa ñậy kín ghi rõ ñịa ñiểm và thời gian lấy mẫu Trước khi lấy mẫu dụng cụ và chai nhựa ñược rửa và tráng bằng chính nước cần lấy

Cách lấy mẫu: Lấy mẫu cách mặt nước 20 cm, tầng này ñại diện cho tầng

hiếu khí

Cách thu mẫu nước: Tại ñiểm thu mẫu, cần tiến hành ño pH ðối với mẫu

ño hàm lượng oxy hòa tan, mẫu nước ñược lấy vào các chai nhựa PE 0.5 lit, mỗi

vị trí lấy 2 chai, một chai ñựng ñầy cố ñịnh mẫu ñể ño DO

Cố ñịnh mẫu: Dùng pipet 1 ml hút 1 ml MnSO4 và 1 ml dung dịch KI + KOH (Lắc ñều cho ñến khi có xuất hiện kết tủa bông)

Bảo quản mẫu: Trong quá trình vận chuyển từ Xuân Thủy, Nam ðịnh về

phòng thí nghiệm, mẫu ñược bảo quản trong hộp xốp chứa ñá, sau khi về ñược bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ñộ 4oC tại phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội

2.3.2 Phương pháp phân lập, nuôi cấy vi tảo

2.3.2.1 Làm giàu mẫu

Hút 1000 µl mẫu nước cho vào ống Eppendorf, ly tâm ở tốc ñộ 7000 vòng/phút trong 10 phút và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0.05% nhằm mục ñích giữ vững ñặc tính của vi tảo Sau ñó hút 100 µl dịch huyền phù vi tảo

cho vào nuôi cấy trong lọ Penicillin dung tích 20 ml chứa môi trường BBM Nuôi giữ ở nhiệt ñộ phòng dưới ánh sáng ñèn neon với cường ñộ sáng là 10000 –

20000 Lux theo quang chu kì là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tối Sau thời gian 5 – 7 ngày nuôi cấy, quan sát khả năng sinh trưởng của mẫu vi tảo ñã ñược làm giàu bằng kính hiển vi quang học ở ñộ phóng ñại 400 – 1000 lần

2.3.2.2 Phương pháp tách và thuần khiết trên ñĩa thạch

Quá trình phân lập ñược tiến hành theo phương pháp của Shirai [11] có cải tiến Các vi tảo sau khi làm giàu ñược xác ñịnh dưới kính hiển vi là các chủng vi tảo cần phân lập Nhỏ 100 µl dịch mẫu vi tảo trên ñĩa thạch chứa môi trường thích hợp có bổ sung khoáng và vitamin Sau 7 – 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt ñộ phòng với cường ñộ ánh sáng từ 10000 – 20000 Lux theo quang chu kì 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tối, khuẩn lạc phát triển trên ñĩa thạch Khuẩn lạc sẽ ñược quan sát dưới kính hiển vi với ñộ phóng ñại 100, ñể xác ñịnh sơ bộ hình dạng của chủng vi tảo Sau ñó, chuyển sang ñộ phóng ñại 40, ñể tách khuẩn lạc của chủng vi tảo cần phân lập bằng tăm vô trùng Chuyển ñầu tăm có chứa khuẩn lạc chủng vi tảo vào trong lọ Penicillin có chứa dịch thể của môi trường nuôi cấy Nuôi trong thời gian 5 – 10 ngày, khi sinh khối vi tảo phát triển, tiến hành quan sát kiểm tra ñộ tinh sạch của mẫu vi tảo phân lập

2.3.3 Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng

ðể xác ñịnh khả năng sinh trưởng của loài vi tảo nghiên cứu chúng tôi tiến

hành nuôi trực tiếp tảo trên các môi trường ñược trình bày trong phụ lục 1, sau

ñó tiến hành ñếm tế bào ñịnh kì 2 ngày/lần trên các môi trường nuôi cấy ñể tìm

ra thời gian sinh trưởng tối ña và môi trường nuôi cấy tối ưu nhất

*Phương pháp ñếm tế bào bằng buồng ñếm Neubauer

Cấu tạo buồng ñếm Neubauer:

Buồng ñếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3 mm, ñược chia làm ba phần Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh dọc Phần giữa

ñược chia ñôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0.1 mm, tạo ra hai ngăn ñếm giống nhau Mỗi ngăn ñếm hình vuông, ñược chia thành 16 ô lớn, mỗi

ô lớn lại chia thành 16 ô nhỏ Vậy:

Tổng số ô nhỏ trong một ngăn ñếm là 16 x 16 = 256 ô nhỏ

Mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều cao là 1/10 mm

Như vậy thể tích của một ô nhỏ là 1/400 x 1/10 = 25.10-5 mm3

Thể tích của một ngăn ñếm là 25.10-5 x 256 = 64.10-3 mm3 (= 64.10-6ml) Mật ñộ tế bào ñược tính theo công thức:

D = (a/64).10 6

Trong ñó:

D: mật ñộ tế bào ( số tế bào/ml)

a: số tế bào trung bình trong một buồng ñếm

Thao tác ñếm và lập ñường cong sinh trưởng:

+ Buồng ñếm và lamen ñược lau sạch bằng cồn, thấm khô trước khi cho dịch tảo vào Lamen ñược ñặt trên buồng ñếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy có

sự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng ñếm và lamen Sau ñó dùng pipet Pasteur hút một ít dịch tảo ñã ñược lắc ñều và chấm vào cạnh của lamen Dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng ñếm

+ Buồng ñếm có chứa tảo ñược ñưa lên kính hiển và quan sát ở vật kính

40, thị kính 10 ðối với những mẫu ñếm quá ñặc không thể ñếm chính xác ñược thì pha loãng trước khi ñếm và nhân hệ số pha loãng khi tính kết quả

Trên cơ sở dữ liệu thu ñược qua các ngày ñếm, lập ñường cong sinh trưởng bằng cách ñặt trên trục tung chỉ số mật ñộ tế bào, ñặt trên trục hoành chỉ

số thời gian (ngày) nuôi tảo

*Xác ñịnh môi trường thích hợp ñể nuôi vi tảo:

Trong ñiều kiện tiến hành nghiên cứu chúng tôi tiến hành thử nghiệm

nuôi tảo thuộc chi Ankistrodesmus trong bốn môi trường nuôi cấy là: BBM, C,

BG 11, Bold 3N Dịch mẫu tảo và dịch môi trường ở các môi trường nuôi cấy là ñồng nhất, dựa vào kết quả ñếm tế bào ñể tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp: mật ñộ tế bào ở môi trường nào là nhiều nhất thì ñó là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo nghiên cứu

2.3.4 Phương pháp xác ñịnh sự ảnh hưởng của pH tới tốc ñộ sinh trưởng

ðể xác ñịnh mức ñộ ảnh hưởng và tối ưu của pH tới tốc ñộ sinh trưởng

của vi tảo Ankistrodesmus ta tiến hành nuôi cấy vi tảo Ankistrodesmus lần lượt

trong môi trường có pH lần lượt như sau:

Ta sử dụng môi trường gốc là môi trường BBM có pH = 7.2 làm mẫu ñối chứng ðể có các môi trường với các chỉ số pH còn lại ta chuẩn ñộ pH bằng dung dịch HCl hoặc NaOH

ðo tốc ñộ sinh trưởng và khối lượng của tảo thu ñược sau khi nuôi cấy ta

sẽ xác ñịnh ñược pH tối ưu

2.3.5 Phân loại vi tảo lục Ankistrodesmus

2.3.5.1 Phương pháp hình thái học

ðể phân loại các chủng vi tảo lục Ankistrodesmus phân lập ñược chúng tôi

sử dụng tài liệu:

• ”Tảo nước ngọt Việt Nam Phân loại bộ tảo lục (chlorococcales)” của tác

giả Dương ðức Tiến, Võ Hạnh (1997) [2]

• Khóa phân loại sinh vật phù du (plankton) miền Nam -Việt Nam [10] Các chủng vi tảo lục sau khi ñược thuần khiết ñược quan sát dưới kính hiển vi quang học Zeiss ở ñộ phóng ñại 400 – 1000 lần ñể quan sát các ñặc ñiểm hình thái và kích thước tế bào của chúng

2.3.5.2 Phương pháp tách DNA

Nguyên tắc:

Màng của tế bào vi tảo ñược phá vỡ bởi lyzozyme và các chất tẩy mạnh như: SDS – Tris – HCl giúp DNA ñược giải phóng Protein và RNA ñược tách khỏi DNA nhờ các enzyme xúc tác RNazaA, proteaza K và các dung môi

chloroform : isoamyl alcohol (24: 1)

Cuối cùng DNA ñược tủa bằng etanol lạnh 100% và xác ñịnh nồng ñộ DNA trong dung dịch mẫu

Hóa chất:

• Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1)

• Chloform: isoamyl alcohol (24: 1)

• Ethanol lạnh 100% và 70%

• ðệm phá tế bào: 40 mM EDTA, 50 mM Tris, 750 mM sucrose, pH = 8.0 (Bảo quản ở 4oC trong 1 năm)

Tiến hành:

DNA ñược tách chiết từ sinh khối ướt theo phương pháp của Giovannoni

et al (1990) và có sự thay ñổi của Van Mooy et al (2004b)

Lấy vào khoảng 5 – 10 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc ñộ 8000 – 9000 vòng/ phút trong 15 phút và rửa hai lần bằng

300 µl dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5 M Na2EDTA, 0.15 M NaCl) Sau ñó tạo dịch huyền phù trở lại trong 200 µl ñệm 10 x TE (10 mM Tris – HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, tỷ lệ mẫu : ñệm = 1: 2) Sau ñó bổ sung tiếp 500 µl dịch phá tế bào (Triston - X100 2% (v/v), 1% SDS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 8.0, 10

mM Tris 8.0), và hạt thủy tinh ( tỉ lệ 1: 2 mg/v), trộn ñều cho tan Tiếp tục bổ sung choloroform : isoamyl alcohol ( tỷ lệ 24: 1, v/v) với thể tích bằng 1/3 thể tích mẫu, trộn ñều trong 5 – 10 phút bằng tay Cuối cùng bổ sung protein K (Sigma, 20 mg/ml protease K trong 1/10 x TE), ủ mẫu ở 56oC trong 10 – 15 phút Sự tan tế bào ñược xác ñịnh bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự

tăng ñộ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước ñá 10 phút Tiếp theo, ly tâm mẫu ở 15000 vòng/phút thời gian 15 – 20 phút ñể phân lớp Sau ñó chuyển phần nhớt pha dầu sang Eppendorf mới (cỡ 1.5 ml) và DNA ñược tách ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95.5% giữ ở 22oC) với thể tích gấp ñôi thể tích mẫu và 2

µl của 3M Na acetate (pH = 4.5) Ngâm DNA trong 100 µl ethanol 70% trong 30 phút và sau ñó ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho mỗi nồng ñộ trong 5 phút Sợi DNA làm khô bằng nhiệt ñộ phòng trong 10 phút và ñược làm tan trở lại trong 50 µl ñệm 0.1 x TE (của 10 x TE) ở 4oC qua ñêm

Dịch ñem phân tích bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260, và

280 nm DNA hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260 nm, ở bước sóng 280 nm chứng tỏ sự có mặt của protein Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất ñệm, các muối như EDTA và của RNA Các tỉ lệ chuẩn về hấp thụ của DNA ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 1.0 : 0.45 : 0.515 Hàm lượng DNA ñược tính như sau: 1 ñơn vị OD (mật ñộ quang, Optical Durity) ở 260 nm tương ñương với

50 µl/mg DNA

Cách tính:

ðơn vị mẫu x ñộ loãng x chỉ số/1000 = DNA µg/µl

Nếu DNA chưa sạch cần khử protein và RNA bằng enzyme proteaza K và RNazaA

*Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) và ñiện di

Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR

• Mồi cho phản ứng PCR ñoạn rDNA 18S:

Mồi xuôi 2F: (2-21) 5’-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’

Hoặc 1315 F 5’-CGATAAGGAACGAGACCTT-3’ Mồi ngược 1794R: (1794-1775) 5’-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3’

Chương trình chạy PCR

+ Biến tính DNA ở 94oC trong 3 phút