Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO VIỆN ðẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh thăm dò khả kháng tế bào ung thư biểu mô Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hoài Hà KS Phạm Thị Bích ðào Sinh viên : Nguyễn Thị Thu Thủy Lớp : KSCNSH 06 – 02 Hà Nội - 2010 LỜI CẢM ƠN ðiều ñầu tiên, giử lời cảm ơn tới bố mẹ người thân gia ñình ñã sinh thành, dưỡng dục, giúp ñỡ, ñộng viên ñể có ñược kết ngày hôm Khóa luận này, quà nhỏ gửi tới bố mẹ, thay cho biết ơn chân thành Kế ñó, xin thành cảm ơn toàn thể Thầy, Cô giáo cán Khoa Công nghệ Sinh học – Viện ðại Học Mở Hà Nội ñã giảng dạy giúp ñỡ thời gian học trường Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Thị Hoài Hà KS Phạm Thị Bích ðào phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội ñã tận tình hướng dẫn, bảo, giúp ñỡ tạo ñiều kiện thuận lợi cho suốt trình nghiên cứu hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cám ơn người bạn lớp KSCNSH 06 – 02 ngày học tập mái trường thân yêu Hà Nội, tháng 05 năm 2010 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Thủy BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT RNM Rừng ngập mặn PUFA Polyunsaturated fatty acids EPA Ecosapentaenoic acid DHA Docosahexaenoic acid AA Arachidonic acid LA Linoleic acid rDNA Ribosomal Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid bp Base pair (cặp bazo) EDTA Ethylen Diamin tetra axetic dNTP Deoxyonucleotit triphosphat NCBI National Center for Biotechnology Information TE Tris – EDTA DO Dissolved Oxygen Taq Taq (Thermus aquaticus) polymerases tb/ml Tế bào/ml PCR Polymerase Chain Reaction KB Dòng tế bào ung thư biểu mô miệng người Humam epidermic carcinoma of the mouth DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG Danh mục hình Hình 1.1 Bản ñồ RNM Xuân Thuỷ nhìn từ vệ tinh Hình 1.2 Một vài hình ảnh ñộng, thực vật RNM Xuân Thuỷ .3 Hình 1.3 Mô hình cấu trúc hóa học acid béo omega-3 (acid oleic) 11 Hình 1.4 Mô hình cấu trúc hóa học acid béo omega-6 .11 Hình 2.1 Bản ñồ lấy mẫu RNM Xuân Thủy 16 Hình 3.1 Nuôi cấy chủng A lọ Pennicillin 29 Hình 3.2 Nuôi cấy môi trường thạch 29 Hình 3.3 Khả sinh trưởng chủng vi tảo A môi trường khác 31 Hình 3.4 Ngày ñầu thử ñộ pH .33 Hình 3.5 Ngày thu kết 33 Hình 3.6 Hình thái chủng A 34 Hình 3.7 Sục khí nuôi sinh khối 36 Hình 3.8 Thu sinh khối 36 Hình 3.9 Sơ ñồ sắc ký khí thành phần acid béo chủng Ankistrodesmus gracilis A 38 Hình 3.10 Mật ñộ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm 41 Hình 3.11 Kết chạy sắc ký mỏng 42 Danh mục bảng Bảng 3.1 Khả sinh trưởng môi trường khác chủng vi tảo A……………………………………………………………………………… 31 Bảng 3.2 Hàm lượng sinh khối vi tảo A thử ñộ pH……………………… 33 Bảng 3.3 Thành phần acid béo hàm lượng chủng Ankistrodesmus gracilis A………………………………………………………………………… 37, 38 Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính sinh học diệt ức chế tế bào ung thư biểu mô miệng………….……………………………………………………………… 40 MỤC LỤC CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN (RNM) XUÂN THỦY, NAM ðỊNH 1.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VI TẢO LỤC VÀ VI TẢO Ankistrodesmus 1.2.1 Vi tảo lục 1.2.2 Vi tảo Ankistrodesmus 1.2.2.1 Vị trí phân loại (taxon) vi tảo Ankistrodesmus 1.2.2.2.ðặc ñiểm sinh học vi tảo Ankistrodesmus 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng, phát triển vi tảo Ankistrodesmus 1.3 ACID BÉO TRONG VI TẢO 1.3.1 Khái niệm acid béo 1.3.2 Vai trò acid béo 10 1.4 KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA VI TẢO 10 CHƯƠNG ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP .16 NGHIÊN CỨU 16 2.1 NGUYÊN LIỆU 16 2.1.1 ðối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 ðịa ñiểm thời gian thu mẫu 16 2.1.3 Hóa chất .16 2.1.4 Máy móc dụng cụ thí nghiệm 17 2.2 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Phương pháp ñiều tra thu mẫu vi tảo lục Rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam ðịnh 18 2.3.2 Phương pháp phân lập, nuôi cấy vi tảo 18 2.3.2.1 Làm giàu mẫu 18 2.3.2.2 Phương pháp tách khiết ñĩa thạch 19 2.3.3 Phương pháp xác ñịnh khả sinh trưởng 19 2.3.4 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng pH tới tốc ñộ sinh trưởng.21 2.3.5 Phân loại vi tảo lục Ankistrodesmus 21 2.3.5.1 Phương pháp hình thái học .21 2.3.5.2 Phương pháp tách DNA 21 2.3.6 Phương pháp nhân nuôi thu sinh khối 25 2.3.7 Phương pháp xác ñịnh thành phần acid béo 26 2.3.8 Phương pháp thử ñộc tính tế bào – khả kháng tế bào ung thư 26 2.3.9 Phương pháp sắc kí mỏng (TLC) 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO .29 3.2 LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO CHỦNG VI TẢO A .30 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ðỘ PH ðẾN TỐC ðỘ SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VI TẢO A 32 3.4 PHÂN LOẠI VI TẢO CHỦNG A 33 3.4.1 Phân loại theo phương pháp hình thái học .33 3.4.2 Phân loại theo phương pháp sinh học phân tử 34 3.5 NHÂN NUÔI VÀ THU SINH KHỐI VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A 35 3.6 XÁC ðỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO CÓ TRONG VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A .37 3.7 XÁC ðỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A .39 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 49 PHỤ LỤC 52 Mở ñầu Vi tảo lục (Micro - green algae) phong phú thành phần loài ña dạng cấu trúc Chúng vi sinh vật có khả quang tự dưỡng, màu lục, ñơn bào, cộng ñơn bào dạng tập ñoàn Chúng có kích thước hiển vi, sống trôi nước, ñáy thuỷ vực, sống bám ao, hồ hồ chứa thuỷ vực nước ngọt, gặp thuỷ vực nước lợ nước biển Nhiều loài vi tảo lục có giá trị khoa học thực tiễn Ngày nay, nhiều loài vi tảo lục ñược nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu ñể ứng dụng vào số lĩnh vực như: sản xuất thực phẩm chức năng, nhiên liệu sinh học, chiết suất hợp chất sinh học, xử lý ô nhiễm môi trường, làm sinh vật thị sinh học… Rừng ngập mặn Xuân Thuỷ - (RNM Xuân Thuỷ) khu bảo tồn dự trữ sinh ñất rừng ngập mặn ðây rừng ngập mặn ñầu tiên Việt Nam ñược quốc tế công nhận theo công ước Ramsar, rừng ngập mặn thứ 50 giới RNM Xuân Thuỷ ñược nâng cấp từ khu bảo tồn ñất ngập nước Xuân Thuỷ theo ñịnh số 01/2003/Qð-TTg Thủ tướng Chính phủ Cộng hoà xã hội chủ nghĩa Việt Nam ngày tháng năm 2003 [6] Nhưng nay, RNM Xuân Thuỷ có tượng bị ô nhiễm môi trường tác ñộng mật ñộ dân cư vùng ñệm cao, nhiều người dân sống chủ yếu nghề khai thác nuôi trồng thuỷ sản ðiều ảnh hưởng nghiêm trọng ñến ña dạng loài thuỷ sinh vật nói chung vi tảo lục nói riêng Ngày mưu cầu mưu sinh mà nhiều người dân quanh khu vực rừng ñã khai thác ñánh bắt cách bừa bãi, làm tăng nguy cân sinh thái nơi ñây Mặt khác, ung thư bệnh chiếm tỉ lệ tử vong cao Trên giới ñã có nhiều nghiên cứu bệnh ung thư, phương thuốc ñiều trị chúng Và vi tảo phương thuốc hữu hiệu ñó ðã có nhiều nghiên cứu khả kháng chữa số bệnh ung thư vi tảo, tạo nên bước ñột phá công nghệ ngành y dược Vì lý trên, thực ñề tài: “Nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học vi tảo Ankistrodesmus phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh thăm dò khả kháng tế bào ung thư biểu mô” với mục ñích sau: Nghiên cứu, phân tích thành phần dinh dưỡng vi tảo Ankistrodesmus khu rừng ngập mặn Xuân Thuỷ, Nam ðịnh Bảo tồn nguồn gen chủng tảo Ankistrodesmus Nghiên cứu, tách chiết ứng dụng thành phần acid béo có vi tảo Ankistrodesmus Thăm dò khả kháng tế bào ung thư biểu mô chủng vi tảo nghiên cứu Công việc ý nghĩa mặt kinh tế, xã hội, khoa học mà có ý nghĩa tiền ñề cho nghiên cứu ứng dụng khác sau Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN (RNM) XUÂN THỦY, NAM ðỊNH Hình 1.1 Bản ñồ RNM Xuân Thuỷ nhìn từ vệ tinh [22] RNM Xuân Thuỷ nằm phía ñông nam huyện Giao Thuỷ tỉnh Nam ðịnh, có toạ ñộ 20o13’48’’Bắc 106o31’00’’ ðông, cửa Ba Lạt sông Hồng Diện tích toàn vườn khoảng 7100 ha, gồm 3100 diện tích ñất có rừng 4000 ñất rừng ngập nước, bao gồm phần bãi Cồn Ngạn, Cồn Lu Cồn Xanh ðất ngập nước là: “Các vùng ñầm lầy, than bùn vùng nước tự nhiên hay nhân tạo, có nước thường xuyên hay tạm thời, nước ñứng hay nước chảy, nước ngọt, nước lợ hay nước mặn, kể vùng nước ven biển có ñộ sâu không mét thuỷ triều thấp ñều vùng ñất ngập nước” [19] Vùng ñệm RNM Xuân Thuỷ có diện tích 8000 ha, gồm phần diện tích lại Cồn Ngạn (ranh giới tính từ phía ñê biển ñến lạch sông Vọp), ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 13 20: Eicosanoic acid Arachidic 32.09 2.553 14 20: 1n-9 11-Eicosaenoic acid Eicosenoic acid 32.78 0.602 15 20: 4n-6 5,8,11,14- Arachidonic eicosatetraenoic acid acid (AA) 39.11 0.025 16 20: 4n-3 8,11,14,17- Eicosatetraenoic eicosatetraenoic acid acid (ETA) 40.32 0.053 17 22: 4n-6 Docosatetraenoic Adrenic acid 48.32 0.212 18 24: 52.62 0.277 acid Tetracosanoic acid Lignoceric Bảng 3.3 Thành phần acid béo hàm lượng chủng Ankistrodesmus gracilis A Hình 3.9 Sơ ñồ sắc kí khí thành phần acid béo chủng Ankistrodesmus gracilis A ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 38 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Từ bảng 3.3 hình 3.9 cho thấy chủng Ankistrodesmus gracilis A có thành phần acid béo cao, gồm 18 loại acid ñó có 11 loại acid béo không no, chiếm 59.93% tổng số acid Tỷ lệ acid béo khác nhau, acid palmitic (16: 0) chiếm tỷ lệ cao 21.533% tổng số acid béo, tiếp ñến octadecatetraenoic acid (acid omega-3 ña nối ñôi) (18: 4n-3) với tỷ lệ 18.175%, có asclepic (18: 1n-7) 14.919%, tỷ lệ palmitoleic (16: 1n-7) 10.329%, thấp tỷ lệ arachidonic acid (20: 4n-6) 0.025% Trong thành phần acid béo , có nhiều acid béo có giá trị dinh dưỡng cao ñặc biệt quan trọng ñối với người như: arachidonic acid (AA) (20: 4n-6) 0.025%, anpha-linoleic acid (18: 3n-3) 0.851% ñặc biệt palmitoleic (16: 1n-7) 10.329% Nhìn chung thành phần acid béo không no chủng vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có thành phần ña dạng thuộc hai nhóm acid béo không no omega-3 omega-6, acid quan trọng ñối với thể người Qua bảng thấy hàm lượng acid béo không no có hàm lượng cao palmitic hàm lượng acid béo AA, EPA không cao, ñặc trưng cho vi tảo lục trái ngược hoàn toàn với tảo silic [9,18] 3.7 XÁC ðỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA VI TẢO Ankistrodesmus gracilis A Qua nghiên cứu ứng dụng thực tiễn thấy hợp chất có vi tảo lục ñã có ñóng góp ñáng kể ñời sống người Chúng giúp tăng cường trí tuệ, tăng sức ñề kháng, cải thiện hệ miễn dịch người Chúng có khả sửa chữa tế bào bị tổn thương tái tạo tế bào mới, chống lão hóa tế bào làm chậm trình lão hóa ðặc biệt khả chữa tiêu diệt số tế bào bệnh ung thư ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư ruột, ung thư tủy… người [34,37] Sinh khối vi tảo tươi ñược chiết dung môi methanol/ chloroform (1:1, v/v) ñem cô quay chân không thu cặn chiết khô ñem thực phép thử ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 39 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ hoạt tính sinh học diệt ức chế tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) Kết ño ñược bước sóng 540 nm máy spectrophotometer Genios TECAN tính toán, mẫu ño có nồng ñộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) nhỏ 128 µg/ml có tác dụng phòng ñiều trị ung thư mức tế bào Kết thu ñược bảng 3.4 hình 3.10 IC50 IC50 (µg/ml) (µg/ml) STT Tên loài Amphiprora alata 84.17 Ankistrodesmus gracilis A 26.50 Chaetoceros muelleri 67.24 Chlorella vulgaris 78.98 Gyrosigma limosum >128 Merosira nummuloides >128 Navicula radiosa >128 Navicula tuscula 67.24 Scenedesmus sp >128 10 Scenedesmus quadricauda >128 28.57 Bảng 3.4 Kết thử hoạt tính sinh học diệt ức chế tế bào ung thư biểu mô miệng Kết cho thấy nồng ñộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) vi tảo Ankistrodesmus gracilis A 26.5 µg/ ml lần thử 28.57 µg/ ml lần thử Trong số 10 loài vi tảo ñem ñi thăm dò khả kháng tế bào ung thư, vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có tác dụng ức chế khả tăng sinh tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) mô hình thực nghiệm mức cao Vi tảo ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 40 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Ankistrodesmus gracilis A thể tiềm kháng tế bào ung thư có tác dụng phòng ñiều trị ung thư mức tế bào (a) (b) Hình 3.10 Mật ñộ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm (a) Mẫu ñối chứng (b) Mẫu thử nghiệm với cặn chiết Ankistrodesmus gracilis A Cũng từ hình 3.10, nhận thấy mật ñộ tế bào ung thư biểu mô miệng khả liên kết, tế bào bị phá vỡ, số lượng tế bào giảm ñáng kể Vậy hợp chất vi tảo lục thể kháng tế bào ung thư biểu mô miệng, thành phần acid béo hay chlorophyll hợp phần cấu tử ñó ðể tìm hiểu rõ tiếp tục tiến hành phân tích mẫu sinh khối vi tảo Ankistrodesmus gracilis A sắc ký mỏng nhằm xác ñịnh khả phân tách cấu tử tương ứng chất có thành phần ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 41 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ A A Hình 3.11 Kết chạy sắc ký mỏng Kết sắc ký mỏng cho thấy cấu tử thành phần hoàn toàn tách biệt, thể vệt màu mỏng ðặc biệt ñối vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có hoạt tính kháng tế bào ung thư mạnh ñược chạy sắc ký lần 2, vệt mầu lên rõ rệt, gồm có: vệt cao màu xanh, vệt thấp hơn, vệt hoàn toàn tách biệt nên có khả cạo tách cấu tử ðiều mở khả nghiên cứu tách chiết xác ñịnh cụ thể thành phần cấu tử ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 42 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ KẾT LUẬN Chủng vi tảo lục Ankistrodesmus gracilis A ñều phát triển tốt bốn môi trường C, BBM, BG 11, Bold 3N Trong ñó phát triển tốt môi trường BBM mật ñộ tế bào ñạt 62.8 x 106/ml, pH tối ưu cho sinh trưởng chủng vi tảo Ankistrodesmus gracilis A – 8, hàm lượng vi tảo ñạt 0.054 0.056 mg/ml Dựa vào phương pháp phân loại truyền thống phương pháp phân loại ñại dựa phân tích giải trình tự gen rDNA 18S, chủng vi tảo lục Ankistrodesmus A ñược xác ñịnh thuộc loài Ankistrodesmus gracilis có kí kiệu Y16937 Hàm lượng acid béo ñối với chủng cao, ñặc biệt chủng có chứa thành phần acid béo không no quan trọng arachidonic acid (AA) (20: 4n-6) 0.025%, anpha-linoleic acid (18: 3n-3) 0.851% ñặc biệt palmitoleic (16: 1n-7) 10.329% Với nồng ñộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) vi tảo Ankistrodesmus gracilis A 28.57 µg/ml Vi tảo Ankistrodesmus gracilis A có tác dụng ức chế khả tăng sinh tế bào ung thư biểu mô miệng (KB) mô hình thực nghiệm mức cao ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 43 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu khả kháng tế bào ung thư biểu mô vi tảo chủng Ankistrodesmus gracilis A, phân tích rõ thành phần cấu tử có khả ức chế tế bào ung thư biểu mô Cần phải tiếp tục nghiên cứu, phân tích thành phần sinh hóa khác như: protein, vitamin, hydrate, carbon… Do ñiều kiện nghiên cứu chưa cho phép, chưa tiến hành nuôi thử quy mô công nghiệp chủng Ankistrodesmus gracilis ñể dùng cho nuôi trồng thủy sản Vì cần tiếp tục nghiên cứu ñánh giá tác ñộng chủng tới sinh trưởng, phát triển thủy sản ñể sớm ñưa vào nuôi trồng thủy sản, nhằm tăng chất lượng, tăng suất giảm giá thành nuôi trồng thủy sản ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 44 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Ban quản lý vườn quốc gia Xuân Thủy (2004), “Quy hoạch quản lý bảo vệ phát triển vườn quốc gia Xuân Thủy, giai ñoạn 2004 – 2020”, Nam ðịnh Dương ðức Tiến, Võ Hạnh (1997), Tảo nước Việt Nam, Phân loại tảo lục (chlorococcales), NXB Nông Nghiệp, Hà Nội Lê Ngọc Tú, Lê Văn Chứ, ðặng Thị Thu, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi ðức Lợi, Lê Doãn Diên, Hóa sinh công nghiệp, NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thị Hoài Hà (2006), Vi tảo, Viện vi sinh vật công nghệ sinh học Phan Nguyên Hồng, Lê Xuân Tuấn, Phan Thị ðào (2007), “Báo cáo: ða dạng sinh học vườn quốc gia Xuân Thủy” MERC-MCD, Hà Nội Quyết ñịnh số 01/2003/Qð-TTg ngày 02/01/2003 Thủ tướng phủ V/v: chuyển khu bảo tồn ñất ngập nước Xuân Thủy thành vườn quốc gia Xuân Thủy, tỉnh Nam ðịnh Robert Edward Lee (1999), Tảo học (Phycology), Cambridge University Press (tài liệu ñã dịch) Tại ñiều 8-Qð số 08/2001/Qð-TTg ngày 11/01/2001 Thủ tướng phủ V/v: ban hành quy chế quản lý rừng ñặc dụng, rừng phòng hộ, rừng sản xuất rừng tự nhiên Tài liệu tiếng Anh: Anders S Carlasson, Jan B van Beilen, Ralf Moller and David Clayton (2007), “Micro- and Macro- algae: untility for industrial applications”, Realising the Economic Potential of Sustainable Resources_Bioproducts from Non-food Crops, University of York ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 45 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 10 Dr Akihiko Shirota, “The Plankton of south Vietnam – Fresh water and Marine Plankton”, Overseas technical cooperation agency, p:225-416 11 Makoto Shirai, Katsumi Matumaru, Akio Ohotake, Yoshichika Takamura, Tokujiro Adia and Masayasu Nakano, 1989, Development of a solid medium for growth and isolation of asenic microsytis strains (Cyanobacteria) Appl environ microbial 55 (10): p2569 – 2571 12 Michael T art Bruce C wainman Editor, Lipids in Fesh water Ecosytem, page 23 13 Miller L.T (1982), “Single derivatization method for routine analasyis of bacterial whole cell fatty acid metyl esters, including hydroxyl acid”, Journal of Clinical Microbiology, Vol.16, pp 584 – 586 14 Munoz R., Guieysse B (2006), “Algal-Bacterial processes for the treatment of hazondous contaminants”, A review Water Research 40: 2799 – 2815 15 Perales – Vela HV., Pena – Castro JM., Canizares – Villanueva RO (2006), “Heavy metal detoxification in eukaryotic microalgae”, Chemosphere 64: – 10 16 Pulz O., Gross W (2004), “Valuable products from biotechnology of microalgae”, Applied Microbiology and Biotechnology 65: 635 – 648 17 Safarova K., Kvitko P., Kuschk M., Murder W (2005), “Biodegradation of Phenanthrene by the green alga Scenedesmus obliquus ES-55”, Enginneering in Life Sciences, 5(3), pp 234 – 239 18 Shirora A (1966), “The plankton of south Viet Nam Fresh Water and Marine Plankton”, Overseas Technical Cooperation Agency Japan 19 The Ramsar Convention Secretariat (2007), “The Ramsar Information Pack”, Rue Mauverney 28, CH – 1196 Gland, Switzerland, Information Papper No.1 20 Watanabe M.M., and Kasai F (1985), NIES-collection list of strains, st ed., The National Institute for Environmental Studies, The Environmental Agency, Tsukuba, Japan Pp 97 ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 46 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 21 Wilde EW., Benemanann JR (1993), “Bioremoval of Heavy – Metals by the Use of Microalgae”, Biotechnology Advances 11: 781 – 812 Trang Web tham khảo: 22 http://vuonquocgiaxuanthuy.org.vn/? 23 http://en.wikipedia.org/wiki/Ankistrodesmus 24.http://siklicasechidick.conncoll.edu/Lucidkeys/Carolina_Key/html/Ak_Main html 25 http://www.thucphamvadoisong.vn 26 http://www.zenithinternational.com 27 http://vietnamnet.vn/khoahoc/xuhuong/2004/09/264668 28 http://dactrung.net/phorum/tm.asp 29 http://www.thuocbietduoc.com.vn/home/newdt8749tt1ev5.aspx 30 http://wikipedia.org/wiki/Ung_thu 31 http://www.tinsuckhoe.com 32 http://www.parkwaycancercentre.com/vietnam 33 http://www.lifecare.vn/news.aspx?tab0=4&tab1=4&id=2 34 Nguồn tài liệu: Rong biển dược liệu Việt Nam trang 52, 80 http://www.lifecare.vn/news.aspx?tab0=3&tab1=4&id=15 35 http://thuysan.kiengiang.gov.vn/index2.jsp?menuId=453&articleId=3258 36 http://online.tvu.edu.vn/ (TT ñào tạo trực tuyến từ xa ðH VinhChương 1: ðặc ñiểm sinh học số ngành tảo thường gặp.) 37 http://www.yduocngaynay.com/8-8TK_TrVHung_Omega3_UngThu.htm 38.http://www.3dchem.com/moremolecules.asp?ID=238&othername=omega3%20essential%20fatty%20acid 39.http://www.nutifood.com.vn/Default.aspx?pageid=142&mid=320&breadcru mb=265&intSetItemId=265&action=docdetailview&intDocId=4108 ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 47 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ 40.http://vietbao.vn/suc-khoe/omega-3-ngua-ung-thu-tien-liettuyen/30114539/248/ 41 http://drviet.com.vn/nha-khoa-cong-dong/ung-thu-vung-mieng.html 42.http://nhakhoathammy.com.vn/nha-khoa-cong-dong/ung-thu-vungmieng/313-ung-thu-bieu-mo-vung-mieng.html 43.http://www.hanoimoi.com.vn/newsdetail/doi_song/306235/ti-le-mac-ung-thugan-viet-nam-dung-thu-3-the-gioi.htm ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 48 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ PHỤ LỤC Môi trường nuôi cấy (*) Môi trường BBM Tên hóa chất Số lượng Tên hóa chất Số lượng NaNO3 25 mg H3BO3 1.142 mg MgSO4 7H2O 7.5 mg ZnSO4 7H2O 0.882 mg NaCl 2.5 mg MgCl2 7H2O 0.144 mg K2HPO4 7.5 mg MoO3 0.071 mg KH2PO4 17.5 mg Na2MoO4 2H2O 0.1144 mg CaCl2.2H2O 2.5 mg CuSO4 0.157 mg KOH 3.1 mg Co(NO3)2 6H2O 0.049 mg FeSO4.7H2O 0.498 mg Na2 EDTA mg Nước cất 100 ml ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 49 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Môi trường C PIV metals Hóa chất Số lượng Ca(NO3)2 4H2O 15 mg FeCl3 6H2O 19.6 mg KNO3 10 mg MnCl2 4H2O 3.6 mg β-Na2 mg ZnSO4 7H2O 2.2 mg CoCl2 6H2O 0.4 mg glycerophosphate MgSO4 7H2O mg Na2MoO4 2H2O 0.25 mg PIV metals 0.3 ml Na2 EDTA 2H2O 100 mg Tris hydroxymethyl 50 mg Nước cất 100 ml aminoethane Vitamin B12 0.01 µg Vitamin H 0.01 µg Vitamin B1 µg Nước cất 99.7 ml ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 50 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ Môi trường BG 11 Hóa chất Số lượng Vi lượng A5 cho BG 11 K2HPO4 3H2O 0.04 g/l H3BO3 2.86 g/l NaNO3 1.5 g/l MnCl2 1.81 g/l MgSO4 7H2O 0.075 g/l ZnSO4 0.222 g/l Acid citric 0.006 g/l Na2MoO4 0.39 g/l CaCl2.2H2O 0.036 g/l CuSO4 0.097 g/l Na2 EDTA 0.001 g/l Co(NO3)2 0.049 g/l Na2CO3 0.02 g/l Ferric amoni citrat 0.006 g/l Vi lượng A5 ml Môi trường Bold 3N PIV metals cho Bold 3N Hóa chất Số lượng NaNO3 75 mg FeCl3 6H2O 97 mg CaCl2.2H2O 2.5 mg MnCl2 4H2O 41.0 mg MgSO4 7H2O 7.5 mg ZnCl2 6H2O 5.0 mg K2HPO4 7.5 mg CoCl2 6H2O 2.0 mg KH2PO4 17.5 mg Na2MoO4 2H2O 4.0 mg NaCl 2.5 mg Na2 EDTA 0.75 g Vitamin B12 0.015 µl PIV metals 0.6 ml Soil extract ml Nước cất 95.4 ml (*)NIES – Collection List of Strains, 8th Edition, 2009, The Japanese society of phycology, pp: 212 – 229 ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 51 Nguyễn Thị Thu Thủy Khóa luận tốt nghiệp 2010 ═════════════════════════════════════════════════════ PHỤ LỤC Một số hình ảnh trình làm khóa luận Nhân nuôi sinh khối Cấy chuyển mẫu tủ cấy Soi kiểm tra mẫu kính hiển vi Kiểm tra mẫu nuôi ═════════════════════════════════════════════════════ KSCNSH 06.02 52 [...]... bệnh ung thư ñã nêu thì ung thư biểu mô là một bệnh rất hay gặp như ung thư biểu mô nhú, ung thư biểu mô tủy, ung thư biểu mô gan, ung thư biểu mô da, ung thư biểu mô vòm họng [43] Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (ví dụ như ở ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hóa), thông thư ng là ñột biến ñiểm, nó tạo ra bất ổn về di truyền trong tế bào [30] Ung thư biểu mô bắt nguồn từ bên... trong vi tảo phục vụ cho khả năng kháng tế bào ung thư, chữa một số bệnh ở người Các loại acid béo omega-3, omega-6 có ứng dụng rất lớn trong khả năng ngăn ngừa, chữa một số loại bệnh ung thư như ung thư tuyến tiền liệt, ung thư ruột kết, ung thư vú [34] 1.2.2 Vi tảo Ankistrodesmus 1.2.2.1 Vị trí phân loại (taxon) của vi tảo Ankistrodesmus Theo tài liệu Tảo nước ngọt Vi t Nam - Phân loại bộ tảo lục... CHUNG VỀ VI TẢO LỤC VÀ VI TẢO Ankistrodesmus 1.2.1 Vi tảo lục Vi tảo lục gồm các tế bào sống ñơn ñộc, các tế bào sống thành tập ñoàn, ña dạng Cấu trúc tế bào vi tảo lục có tốc ñộ tiến hóa khác nhau Tế bào ở dạng amip ñến dạng phân hóa ra các mô Vi tảo lục phân bố rộng khắp, từ nước ngọt nghèo dinh dưỡng ñến nước lợ, nước biển, hay trên vật ẩm hoặc sống ngay dưới mặt ñất Hình dạng cấu trúc chung của tế. .. nghiên cứu Vi tảo ñược nghiên cứu là vi tảo lục Ankistrodesmus phân lập từ các mẫu thu ñược ở RNM Xuân Thủy, Nam ðịnh 2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian thu mẫu ðịa ñiểm thu mẫu: Rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam ðịnh (các ñiểm khoanh tròn trên hình 2.1) Thời gian tiến hành nghiên cứu: Từ tháng 07/ 2009 ñến tháng 06/ 2010 tại phòng Sinh học tảo, Vi n Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội Hình 2.1... thử ñộc tế bào in vitro ñược vi n Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử ñộc tố tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở ñiều kiện in vitro Dòng tế bào ung thư ở người KB (Humanepidermic carcinoma) ñược cung cấp bởi ATCC là dòng luôn ñược sử dụng trong các phép thử ñộ ñộc tế bào Tế bào ung thư ñược nuôi cấy trong môi trường... sinh tế bào với sự gia tăng peroxyl hóa lipid; 11 nghiên cứu chú trọng ñến khả năng của omega-3 ngăn cản ñược suy mòn (cachexia); 6 nghiên cứu ghi nhận acid béo omega-3 có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư bằng các cơ chế tác ñộng loại ức chế sự tạo sinh các mạch máu nuôi tế bào ung thư (angiogenesis), ức chế hoạt ñộng của ras-protein hay ức chế các men giúp tế bào ung thư xâm lấn vào... và omega-6 ñều có hoạt tính diệt bào ñối với các tế bào ung thư vú, phổi và tuyến nhiếp hộ, và không tác ñộng trên các tế bào bình thư ng Trên thực tế, các acid béo chưa no lại có nhiều nối ñôi có hoạt tính diệt bào (in vitro) ít nhất là ñối với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các cơ quan khác nhau [37] Ngoài acid béo omega-3 và omega-6, trong tế bào vi tảo còn có Chlorophyll (diệp lục) a và. .. chặn khả năng xâm nhập hay gây ra sự phân nhiễm của các tế bào ung thư [37] Có khá nhiều nghiên cứu in vitro và trên thú vật ñã ñược thực hiện và công bố Cho ñến ñầu thập niên 2000, có ít nhất là 57 nghiên cứu in vitro ñược công bố và trong số này có 47 bản ghi nhận là các acid béo omega-3 có tác dụng ức chế sự phát triển, ngăn chặn khả năng xâm nhập hay gây ra sự phân nhiễm của các tế bào ung thư [37]... mẫu tảo và dịch môi trường ở các môi trường nuôi cấy là ñồng nhất, dựa vào kết quả ñếm tế bào ñể tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp: mật ñộ tế bào ở môi trường nào là nhiều nhất thì ñó là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo nghiên cứu 2.3.4 Phương pháp xác ñịnh sự ảnh hưởng của pH tới tốc ñộ sinh trưởng ðể xác ñịnh mức ñộ ảnh hưởng và tối ưu của pH tới tốc ñộ sinh trưởng của. .. Ankistrodesmaceae Chi: Ankistrodesmus 1.2.2.2.ðặc ñiểm sinh học của vi tảo Ankistrodesmus Tế bào vi tảo Ankistrodesmus thư ng dài – có hình kim, hình con suốt, hoặc cong – dạng hình lưỡi liềm Chúng có thể ñứng riêng lẻ, hoặc thành ñám xoắn lại với nhau, ñôi khi nó tạo thành chùm xung quanh những tảo khác [23] Các tế bào liên kết với nhau thành từng cụm từ 4 – 32 tế bào, tế bào dài, vót nhọn ra hai ñầu Tế bào này ... 5’-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’ 404 F:(40 4-4 23) 5’-GCTACCACATCCAAGGAAGG-3’ 934 F:(93 4-9 45) 5’-CTGCGAAAGCATTTGCCAAGG-3’ 1315 F:(131 5-1 333) 5’-CGATAACGAACGAGACCTT-3’ Mồi ngược U1:(58 6-5 63) 5’-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACC-3’... 5’-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACC-3’ U2:(114 8-1 124) 5’-CCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCC-3’ U3:(164 3-1 619) 5’-GACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAG-3’ 1794R:(179 4-1 775) 5’-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3’ 2.3.6 Phương pháp nhân nuôi... PCR ñoạn rDNA 18S: Mồi xuôi 2F: ( 2-2 1) 5’-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’ Hoặc 1315 F 5’-CGATAAGGAACGAGACCTT-3’ Mồi ngược 1794R: (179 4-1 775) 5’-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3’ Chương trình chạy PCR + Biến tính