Sử dụng các dụng cụ có sẵn tại phòng Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật và các phòng thắ nghiệm thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, đại học Quốc Gia Hà Nộị
- Kắnh hiển vi quang học (Olympus, Zeiss)
- Kắnh lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)
- Máy sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, HPLC 1100, đức)
- Máy ly tâm Sigma, Mỹ - Máy ựo pH (Osi, Pháp)
- Máy nhân gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ) - Máy Sequencer ABM Prism 3100-Avant (ABI, Mĩ) - Chlorolab2, Hansatech Intruments Ltd., Anh
2.2. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Trong nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi vi tảo, các môi trường nuôi tảo ựược sử dụng bao gồm: môi trường BBM, Bold 3N, C, BG 11 (Phụ lục 1).
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp ựiều tra thu mẫu vi tảo lục ở rừng ngập mặn Xuân Thủy, Nam định Thủy, Nam định
Ớ Dụng cụ lấy mẫu: vợt lấy mẫu, panh, kẹp, dao cạọ..
Ớ Dụng cụ ựựng mẫu: mẫu ựược ựựng trong các chai nhựa PE hoặc ống facon có nắp nhựa ựậy kắn ghi rõ ựịa ựiểm và thời gian lấy mẫụ Trước khi lấy mẫu dụng cụ và chai nhựa ựược rửa và tráng bằng chắnh nước cần lấỵ
Cách lấy mẫu: Lấy mẫu cách mặt nước 20 cm, tầng này ựại diện cho tầng hiếu khắ.
Cách thu mẫu nước: Tại ựiểm thu mẫu, cần tiến hành ựo pH. đối với mẫu ựo hàm lượng oxy hòa tan, mẫu nước ựược lấy vào các chai nhựa PE 0.5 lit, mỗi vị trắ lấy 2 chai, một chai ựựng ựầy cố ựịnh mẫu ựể ựo DỌ
Cố ựịnh mẫu: Dùng pipet 1 ml hút 1 ml MnSO4 và 1 ml dung dịch KI + KOH (Lắc ựều cho ựến khi có xuất hiện kết tủa bông).
Bảo quản mẫu: Trong quá trình vận chuyển từ Xuân Thủy, Nam định về phòng thắ nghiệm, mẫu ựược bảo quản trong hộp xốp chứa ựá, sau khi về ựược bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ 4oC tại phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, đại học Quốc Gia Hà Nộị
2.3.2. Phương pháp phân lập, nuôi cấy vi tảo
2.3.2.1. Làm giàu mẫu
Hút 1000 ộl mẫu nước cho vào ống Eppendorf, ly tâm ở tốc ựộ 7000 vòng/phút trong 10 phút và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0.05% nhằm mục ựắch giữ vững ựặc tắnh của vi tảọ Sau ựó hút 100 ộl dịch huyền phù vi tảo
cho vào nuôi cấy trong lọ Penicillin dung tắch 20 ml chứa môi trường BBM. Nuôi giữ ở nhiệt ựộ phòng dưới ánh sáng ựèn neon với cường ựộ sáng là 10000 Ờ 20000 Lux theo quang chu kì là 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tốị Sau thời gian 5 Ờ 7 ngày nuôi cấy, quan sát khả năng sinh trưởng của mẫu vi tảo ựã ựược làm giàu bằng kắnh hiển vi quang học ở ựộ phóng ựại 400 Ờ 1000 lần.
2.3.2.2. Phương pháp tách và thuần khiết trên ựĩa thạch
Quá trình phân lập ựược tiến hành theo phương pháp của Shirai [11] có cải tiến. Các vi tảo sau khi làm giàu ựược xác ựịnh dưới kắnh hiển vi là các chủng vi tảo cần phân lập. Nhỏ 100 ộl dịch mẫu vi tảo trên ựĩa thạch chứa môi trường thắch hợp có bổ sung khoáng và vitamin. Sau 7 Ờ 10 ngày nuôi cấy ở nhiệt ựộ phòng với cường ựộ ánh sáng từ 10000 Ờ 20000 Lux theo quang chu kì 10 giờ chiếu sáng và 14 giờ tối, khuẩn lạc phát triển trên ựĩa thạch. Khuẩn lạc sẽ ựược quan sát dưới kắnh hiển vi với ựộ phóng ựại 100, ựể xác ựịnh sơ bộ hình dạng của chủng vi tảọ Sau ựó, chuyển sang ựộ phóng ựại 40, ựể tách khuẩn lạc của chủng vi tảo cần phân lập bằng tăm vô trùng. Chuyển ựầu tăm có chứa khuẩn lạc chủng vi tảo vào trong lọ Penicillin có chứa dịch thể của môi trường nuôi cấỵ Nuôi trong thời gian 5 Ờ 10 ngày, khi sinh khối vi tảo phát triển, tiến hành quan sát kiểm tra ựộ tinh sạch của mẫu vi tảo phân lập.
2.3.3. Phương pháp xác ựịnh khả năng sinh trưởng
để xác ựịnh khả năng sinh trưởng của loài vi tảo nghiên cứu chúng tôi tiến hành nuôi trực tiếp tảo trên các môi trường ựược trình bày trong phụ lục 1, sau ựó tiến hành ựếm tế bào ựịnh kì 2 ngày/lần trên các môi trường nuôi cấy ựể tìm ra thời gian sinh trưởng tối ựa và môi trường nuôi cấy tối ưu nhất.
*Phương pháp ựếm tế bào bằng buồng ựếm Neubauer
Cấu tạo buồng ựếm Neubauer:
ựược chia ựôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0.1 mm, tạo ra hai ngăn ựếm giống nhaụ Mỗi ngăn ựếm hình vuông, ựược chia thành 16 ô lớn, mỗi ô lớn lại chia thành 16 ô nhỏ. Vậy:
Tổng số ô nhỏ trong một ngăn ựếm là 16 x 16 = 256 ô nhỏ. Mỗi ô nhỏ có diện tắch là 1/400 mm2, và chiều cao là 1/10 mm Như vậy thể tắch của một ô nhỏ là 1/400 x 1/10 = 25.10-5 mm3
Thể tắch của một ngăn ựếm là 25.10-5 x 256 = 64.10-3 mm3 (= 64.10-6ml) Mật ựộ tế bào ựược tắnh theo công thức:
D = (a/64).106
Trong ựó:
D: mật ựộ tế bào ( số tế bào/ml).
a: số tế bào trung bình trong một buồng ựếm
Thao tác ựếm và lập ựường cong sinh trưởng:
+ Buồng ựếm và lamen ựược lau sạch bằng cồn, thấm khô trước khi cho dịch tảo vàọ Lamen ựược ựặt trên buồng ựếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy có sự giao thoa ánh sáng ở vị trắ tiếp xúc giữa buồng ựếm và lamen. Sau ựó dùng pipet Pasteur hút một ắt dịch tảo ựã ựược lắc ựều và chấm vào cạnh của lamen. Dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng ựếm.
+ Buồng ựếm có chứa tảo ựược ựưa lên kắnh hiển và quan sát ở vật kắnh 40, thị kắnh 10. đối với những mẫu ựếm quá ựặc không thể ựếm chắnh xác ựược thì pha loãng trước khi ựếm và nhân hệ số pha loãng khi tắnh kết quả.
Trên cơ sở dữ liệu thu ựược qua các ngày ựếm, lập ựường cong sinh trưởng bằng cách ựặt trên trục tung chỉ số mật ựộ tế bào, ựặt trên trục hoành chỉ số thời gian (ngày) nuôi tảọ
*Xác ựịnh môi trường thắch hợp ựể nuôi vi tảo:
Trong ựiều kiện tiến hành nghiên cứu chúng tôi tiến hành thử nghiệm nuôi tảo thuộc chi Ankistrodesmus trong bốn môi trường nuôi cấy là: BBM, C,
BG 11, Bold 3N. Dịch mẫu tảo và dịch môi trường ở các môi trường nuôi cấy là ựồng nhất, dựa vào kết quả ựếm tế bào ựể tìm ra môi trường nuôi cấy thắch hợp: mật ựộ tế bào ở môi trường nào là nhiều nhất thì ựó là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo nghiên cứụ
2.3.4. Phương pháp xác ựịnh sự ảnh hưởng của pH tới tốc ựộ sinh trưởng
để xác ựịnh mức ựộ ảnh hưởng và tối ưu của pH tới tốc ựộ sinh trưởng của vi tảo Ankistrodesmus ta tiến hành nuôi cấy vi tảo Ankistrodesmus lần lượt trong môi trường có pH lần lượt như sau:
độ pH 4 5 6 7 8 9 10
Ta sử dụng môi trường gốc là môi trường BBM có pH = 7.2 làm mẫu ựối chứng. để có các môi trường với các chỉ số pH còn lại ta chuẩn ựộ pH bằng dung dịch HCl hoặc NaOH.
đo tốc ựộ sinh trưởng và khối lượng của tảo thu ựược sau khi nuôi cấy ta sẽ xác ựịnh ựược pH tối ưụ
2.3.5. Phân loại vi tảo lục Ankistrodesmus 2.3.5.1. Phương pháp hình thái học 2.3.5.1. Phương pháp hình thái học
để phân loại các chủng vi tảo lục Ankistrodesmus phân lập ựược chúng tôi sử dụng tài liệu:
Ớ ỢTảo nước ngọt Việt Nam. Phân loại bộ tảo lục (chlorococcales)Ợ của tác giả Dương đức Tiến, Võ Hạnh (1997) [2].
Ớ Khóa phân loại sinh vật phù du (plankton) miền Nam -Việt Nam [10]. Các chủng vi tảo lục sau khi ựược thuần khiết ựược quan sát dưới kắnh hiển vi quang học Zeiss ở ựộ phóng ựại 400 Ờ 1000 lần ựể quan sát các ựặc ựiểm hình thái và kắch thước tế bào của chúng.
Nguyên tắc:
Màng của tế bào vi tảo ựược phá vỡ bởi lyzozyme và các chất tẩy mạnh như: SDS Ờ Tris Ờ HCl giúp DNA ựược giải phóng. Protein và RNA ựược tách khỏi DNA nhờ các enzyme xúc tác RNazaA, proteaza K và các dung môi chloroform : isoamyl alcohol (24: 1).
Cuối cùng DNA ựược tủa bằng etanol lạnh 100% và xác ựịnh nồng ựộ DNA trong dung dịch mẫụ
Hóa chất:
Ớ Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1)
Ớ Chloform: isoamyl alcohol (24: 1)
Ớ Ethanol lạnh 100% và 70%
Ớ đệm phá tế bào: 40 mM EDTA, 50 mM Tris, 750 mM sucrose, pH = 8.0. (Bảo quản ở 4oC trong 1 năm)
Tiến hành:
DNA ựược tách chiết từ sinh khối ướt theo phương pháp của Giovannoni et al (1990) và có sự thay ựổi của Van Mooy et al (2004b).
Lấy vào khoảng 5 Ờ 10 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc ựộ 8000 Ờ 9000 vòng/ phút trong 15 phút và rửa hai lần bằng 300 ộl dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5 M Na2EDTA, 0.15 M NaCl). Sau ựó tạo dịch huyền phù trở lại trong 200 ộl ựệm 10 x TE (10 mM Tris Ờ HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, tỷ lệ mẫu : ựệm = 1: 2). Sau ựó bổ sung tiếp 500 ộl dịch phá tế bào (Triston - X100 2% (v/v), 1% SDS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 8.0, 10 mM Tris 8.0), và hạt thủy tinh ( tỉ lệ 1: 2 mg/v), trộn ựều cho tan. Tiếp tục bổ sung choloroform : isoamyl alcohol ( tỷ lệ 24: 1, v/v) với thể tắch bằng 1/3 thể tắch mẫu, trộn ựều trong 5 Ờ 10 phút bằng taỵ Cuối cùng bổ sung protein K (Sigma, 20 mg/ml protease K trong 1/10 x TE), ủ mẫu ở 56oC trong 10 Ờ 15 phút. Sự tan tế bào ựược xác ựịnh bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự
tăng ựộ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước ựá 10 phút. Tiếp theo, ly tâm mẫu ở 15000 vòng/phút thời gian 15 Ờ 20 phút ựể phân lớp. Sau ựó chuyển phần nhớt pha dầu sang Eppendorf mới (cỡ 1.5 ml) và DNA ựược tách ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95.5% giữ ở 22oC) với thể tắch gấp ựôi thể tắch mẫu và 2 ộl của 3M Na acetate (pH = 4.5). Ngâm DNA trong 100 ộl ethanol 70% trong 30 phút và sau ựó ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho mỗi nồng ựộ trong 5 phút. Sợi DNA làm khô bằng nhiệt ựộ phòng trong 10 phút và ựược làm tan trở lại trong 50 ộl ựệm 0.1 x TE (của 10 x TE) ở 4oC qua ựêm.
Dịch ựem phân tắch bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260, và 280 nm. DNA hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260 nm, ở bước sóng 280 nm chứng tỏ sự có mặt của protein. Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất ựệm, các muối như EDTA và của RNẠ Các tỉ lệ chuẩn về hấp thụ của DNA ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 1.0 : 0.45 : 0.515. Hàm lượng DNA ựược tắnh như sau: 1 ựơn vị OD (mật ựộ quang, Optical Durity) ở 260 nm tương ựương với 50 ộl/mg DNẠ
Cách tắnh:
đơn vị mẫu x ựộ loãng x chỉ số/1000 = DNA ộg/ộl.
Nếu DNA chưa sạch cần khử protein và RNA bằng enzyme proteaza K và RNazaẠ
*Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) và ựiện di
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Ớ Mồi cho phản ứng PCR ựoạn rDNA 18S:
Mồi xuôi 2F: (2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ
Hoặc 1315 F 5Ỗ-CGATAAGGAACGAGACCTT-3Ỗ
Mồi ngược 1794R: (1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ
Chương trình chạy PCR
+ Chạy nhắc lại 30 chu kì tại: 94oC → 30 giâỵ 48oC → 30 giâỵ 72oC → 1 phút 20 giâỵ Hết một chu kì.
+ Tổng hợp: 72oC → 10 phút.
+ Kết thúc chương trình → 4oC nhiệt ựộ bảo quản. + Kiểm tra sản phẩm PCR bằng ựiện di trên gel agaroza + Pha ựệm: chúng tôi tiến hành pha dung dịch ựệm 10 x TAE
Tris 242 g Axit axetic 57,1 ml
0.5 M EDTẠNa2 pH = 8.0 100ml Pha với một lắt
Trong quá trình chạy ựiện di dùng dung dịch ựệm 1 x TAE (của 10 x TAE pha loãng dịch 10 lần trong 100 ml nước cất ựã khử trùng).
đổ gel
+ Cân 0.8 Ờ 1.2 g agaroza cho vào 100 ml dung dịch ựệm 1 x TAE, ựun sôi cho ựến khi agaroza tan hết.
+ Lắc ựều ựể nguội ựến 40 Ờ 50oC. + đổ gel vào khay ựã cài sẵn lược.
+ để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và ựặt khay gel vào máy ựiện dị
Tra mẫu
+ Dùng pipet hút 2 ộl dung dịch DNA trộn với 2 ộl 6x loading buffer. + Tra 1 ộl của 1 kb DNA lađer (Takara) trộn với 2 ộl của 6x loading buffer dùng như DNA chuẩn.
+ Tra mẫu vào từng giếng.
Chạy ựiện di: với dòng ựiện 100 V trong thời gian 20 Ờ 30 phút cho tới khi vạch màu ựến 2/3 bản gel.
Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad
Kết quả của DNA mới ựược nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình với những vạch ựỏ màu da cam.
Kết quả sản phẩm PCR của mẫu ựược phân tắch giải trình tự trên Sequencer ABM Prism 3100-Avant. Trình tự DNA thu ựược ựược so sánh với cơ sở dữ liệu quốc tế NCBI bằng công cụ BLASTn ựể xác ựịnh chủng vi tảo có ựộ tương ựồng cao nhất.
Ớ Mồi cho xác ựịnh trình tự rDNA 18S
Mồi xuôi 2F:(2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ 404 F:(404-423) 5Ỗ-GCTACCACATCCAAGGAAGG-3Ỗ 934 F:(934-945) 5Ỗ-CTGCGAAAGCATTTGCCAAGG-3Ỗ 1315 F:(1315-1333) 5Ỗ-CGATAACGAACGAGACCTT-3Ỗ
Mồi ngược U1:(586-563) 5Ỗ-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACC-3Ỗ U2:(1148-1124) 5Ỗ-CCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCC-3Ỗ U3:(1643-1619) 5Ỗ-GACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAG-3Ỗ 1794R:(1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ
2.3.6. Phương pháp nhân nuôi và thu sinh khối
Từ mẫu gốc lưu giữ ở môi trường thạch nghiêng cấy chuyển ra bình tam giác 250 ml làm giống nuôi sinh khốị Mẫu vi tảo giống ựã lên ựược cấy chuyển ra bình 500 ml nuôi sinh khối, quá trình nuôi sinh khối cấy chuyển liên tục và tăng dần thể tắch nuôi cấy: từ bình thủy tinh 500 ml lên 2 lắt, 5 lắt và tiếp tục lên bình nhựa 20 lắt. đối với bình nuôi sinh khối có dung tắch lớn 5 lắt và 20 lắt ựược chiếu sáng ánh sáng ựèn neon với cường ựộ sáng là 10000 Ờ 20000 Lux và sục khắ liên tục 24/24, còn các bình dung tắch nhỏ hơn ựược chiếu sáng theo quang chu kì là 10h chiếu sáng và 14h tối và sục khắ nhỏ.
Sinh khối vi tảo ựược thu vào giai ựoạn sớm của pha cân bằng và ựược xử lý theo quy trình chiết tảo sau:
Mẫu nuôi sinh khối tảo với nồng ựộ cao
Li tâm 10.000 vòng/ phút, 15 phút, 2oC Sinh khối tươi
Methanol/ Chloroform (1:1, v/v) Dịch chiết
Cô quay chân không Cặn chiết
2.3.7. Phương pháp xác ựịnh thành phần acid béo
Lấy khoảng 20 ộg vi tảo tươi cho vào ống nhựa và sấy khô mẫụ Sau ựó cho 5 ml chloroform/methanol (2 : 1, v/v) và chiết rút lipit bằng máy siêu âm trong 90 phút. Lọc lấy dịch chiết và rửa hai lần bằng dung dịch mới chiết. Sau ựó mẫu ựược cô cạn (làm bay hơi dung môi) và cặn chiết ựược hòa tan bằng methanol : acid sulfuric (95 : 5, v/v), ựun ở 80ồC trong 4h ựể este hóa các acid béọ Cho thêm 100 ml nước. Các acid béo sau khi ựược metyl este hóa ựược chiết hai lần với 2 ml n-hexanẹ Các acid béo này ựược phân tắch bằng máy sắc ký khắ (gas chromatography, GC) Finnigan Trace GC ultra, cột BPX70 (50MẦ). Các acid béo ựược xác ựịnh bằng cách so sánh thời gian lưu (retention time) của mẫu với thời gian lưu của dung dịch chuẩn và ựược ựịnh lượng bằng so sánh các peak với chuẩn.
2.3.8. Phương pháp thử ựộc tắnh tế bào Ờ khả năng kháng tế bào ung thư
Dịch chiết tảo ựược gửi ựi phân tắch tại Phòng Thử hoạt tắnh Sinh học, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp sau:
Xác ựịnh thành phần acid béo
Thử hoạt tắnh kháng tế bào ung thư
Phương pháp thử ựộc tế bào in vitro ựược viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử ựộc tố tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở ựiều kiện in vitro. Dòng tế bào ung thư ở người KB (Humanepidermic carcinoma) ựược cung cấp bởi ATCC là dòng luôn ựược sử dụng trong các phép thử ựộ ựộc tế bàọ Tế bào ung thư ựược nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) ở ựiều kiện chuẩn (5% CO2; 37oC; ựộ ẩm 98%; vô trùng tuyệt ựối), tế bào phát triển ở pha log sẽ ựược sử dụng ựể thử ựộc tắnh.