Nguyên tắc:
Màng của tế bào vi tảo ựược phá vỡ bởi lyzozyme và các chất tẩy mạnh như: SDS Ờ Tris Ờ HCl giúp DNA ựược giải phóng. Protein và RNA ựược tách khỏi DNA nhờ các enzyme xúc tác RNazaA, proteaza K và các dung môi chloroform : isoamyl alcohol (24: 1).
Cuối cùng DNA ựược tủa bằng etanol lạnh 100% và xác ựịnh nồng ựộ DNA trong dung dịch mẫụ
Hóa chất:
Ớ Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1)
Ớ Chloform: isoamyl alcohol (24: 1)
Ớ Ethanol lạnh 100% và 70%
Ớ đệm phá tế bào: 40 mM EDTA, 50 mM Tris, 750 mM sucrose, pH = 8.0. (Bảo quản ở 4oC trong 1 năm)
Tiến hành:
DNA ựược tách chiết từ sinh khối ướt theo phương pháp của Giovannoni et al (1990) và có sự thay ựổi của Van Mooy et al (2004b).
Lấy vào khoảng 5 Ờ 10 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm lạnh ở 4oC với tốc ựộ 8000 Ờ 9000 vòng/ phút trong 15 phút và rửa hai lần bằng 300 ộl dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5 M Na2EDTA, 0.15 M NaCl). Sau ựó tạo dịch huyền phù trở lại trong 200 ộl ựệm 10 x TE (10 mM Tris Ờ HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, tỷ lệ mẫu : ựệm = 1: 2). Sau ựó bổ sung tiếp 500 ộl dịch phá tế bào (Triston - X100 2% (v/v), 1% SDS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 8.0, 10 mM Tris 8.0), và hạt thủy tinh ( tỉ lệ 1: 2 mg/v), trộn ựều cho tan. Tiếp tục bổ sung choloroform : isoamyl alcohol ( tỷ lệ 24: 1, v/v) với thể tắch bằng 1/3 thể tắch mẫu, trộn ựều trong 5 Ờ 10 phút bằng taỵ Cuối cùng bổ sung protein K (Sigma, 20 mg/ml protease K trong 1/10 x TE), ủ mẫu ở 56oC trong 10 Ờ 15 phút. Sự tan tế bào ựược xác ựịnh bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự
tăng ựộ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước ựá 10 phút. Tiếp theo, ly tâm mẫu ở 15000 vòng/phút thời gian 15 Ờ 20 phút ựể phân lớp. Sau ựó chuyển phần nhớt pha dầu sang Eppendorf mới (cỡ 1.5 ml) và DNA ựược tách ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95.5% giữ ở 22oC) với thể tắch gấp ựôi thể tắch mẫu và 2 ộl của 3M Na acetate (pH = 4.5). Ngâm DNA trong 100 ộl ethanol 70% trong 30 phút và sau ựó ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho mỗi nồng ựộ trong 5 phút. Sợi DNA làm khô bằng nhiệt ựộ phòng trong 10 phút và ựược làm tan trở lại trong 50 ộl ựệm 0.1 x TE (của 10 x TE) ở 4oC qua ựêm.
Dịch ựem phân tắch bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260, và 280 nm. DNA hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260 nm, ở bước sóng 280 nm chứng tỏ sự có mặt của protein. Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất ựệm, các muối như EDTA và của RNẠ Các tỉ lệ chuẩn về hấp thụ của DNA ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 1.0 : 0.45 : 0.515. Hàm lượng DNA ựược tắnh như sau: 1 ựơn vị OD (mật ựộ quang, Optical Durity) ở 260 nm tương ựương với 50 ộl/mg DNẠ
Cách tắnh:
đơn vị mẫu x ựộ loãng x chỉ số/1000 = DNA ộg/ộl.
Nếu DNA chưa sạch cần khử protein và RNA bằng enzyme proteaza K và RNazaẠ
*Chạy PCR (Polymerase Chain Reaction) và ựiện di
Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Ớ Mồi cho phản ứng PCR ựoạn rDNA 18S:
Mồi xuôi 2F: (2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ
Hoặc 1315 F 5Ỗ-CGATAAGGAACGAGACCTT-3Ỗ
Mồi ngược 1794R: (1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ
Chương trình chạy PCR
+ Chạy nhắc lại 30 chu kì tại: 94oC → 30 giâỵ 48oC → 30 giâỵ 72oC → 1 phút 20 giâỵ Hết một chu kì.
+ Tổng hợp: 72oC → 10 phút.
+ Kết thúc chương trình → 4oC nhiệt ựộ bảo quản. + Kiểm tra sản phẩm PCR bằng ựiện di trên gel agaroza + Pha ựệm: chúng tôi tiến hành pha dung dịch ựệm 10 x TAE
Tris 242 g Axit axetic 57,1 ml
0.5 M EDTẠNa2 pH = 8.0 100ml Pha với một lắt
Trong quá trình chạy ựiện di dùng dung dịch ựệm 1 x TAE (của 10 x TAE pha loãng dịch 10 lần trong 100 ml nước cất ựã khử trùng).
đổ gel
+ Cân 0.8 Ờ 1.2 g agaroza cho vào 100 ml dung dịch ựệm 1 x TAE, ựun sôi cho ựến khi agaroza tan hết.
+ Lắc ựều ựể nguội ựến 40 Ờ 50oC. + đổ gel vào khay ựã cài sẵn lược.
+ để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và ựặt khay gel vào máy ựiện dị
Tra mẫu
+ Dùng pipet hút 2 ộl dung dịch DNA trộn với 2 ộl 6x loading buffer. + Tra 1 ộl của 1 kb DNA lađer (Takara) trộn với 2 ộl của 6x loading buffer dùng như DNA chuẩn.
+ Tra mẫu vào từng giếng.
Chạy ựiện di: với dòng ựiện 100 V trong thời gian 20 Ờ 30 phút cho tới khi vạch màu ựến 2/3 bản gel.
Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad
Kết quả của DNA mới ựược nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình với những vạch ựỏ màu da cam.
Kết quả sản phẩm PCR của mẫu ựược phân tắch giải trình tự trên Sequencer ABM Prism 3100-Avant. Trình tự DNA thu ựược ựược so sánh với cơ sở dữ liệu quốc tế NCBI bằng công cụ BLASTn ựể xác ựịnh chủng vi tảo có ựộ tương ựồng cao nhất.
Ớ Mồi cho xác ựịnh trình tự rDNA 18S
Mồi xuôi 2F:(2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ 404 F:(404-423) 5Ỗ-GCTACCACATCCAAGGAAGG-3Ỗ 934 F:(934-945) 5Ỗ-CTGCGAAAGCATTTGCCAAGG-3Ỗ 1315 F:(1315-1333) 5Ỗ-CGATAACGAACGAGACCTT-3Ỗ
Mồi ngược U1:(586-563) 5Ỗ-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACC-3Ỗ U2:(1148-1124) 5Ỗ-CCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCC-3Ỗ U3:(1643-1619) 5Ỗ-GACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAG-3Ỗ 1794R:(1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ
2.3.6. Phương pháp nhân nuôi và thu sinh khối
Từ mẫu gốc lưu giữ ở môi trường thạch nghiêng cấy chuyển ra bình tam giác 250 ml làm giống nuôi sinh khốị Mẫu vi tảo giống ựã lên ựược cấy chuyển ra bình 500 ml nuôi sinh khối, quá trình nuôi sinh khối cấy chuyển liên tục và tăng dần thể tắch nuôi cấy: từ bình thủy tinh 500 ml lên 2 lắt, 5 lắt và tiếp tục lên bình nhựa 20 lắt. đối với bình nuôi sinh khối có dung tắch lớn 5 lắt và 20 lắt ựược chiếu sáng ánh sáng ựèn neon với cường ựộ sáng là 10000 Ờ 20000 Lux và sục khắ liên tục 24/24, còn các bình dung tắch nhỏ hơn ựược chiếu sáng theo quang chu kì là 10h chiếu sáng và 14h tối và sục khắ nhỏ.
Sinh khối vi tảo ựược thu vào giai ựoạn sớm của pha cân bằng và ựược xử lý theo quy trình chiết tảo sau:
Mẫu nuôi sinh khối tảo với nồng ựộ cao
Li tâm 10.000 vòng/ phút, 15 phút, 2oC Sinh khối tươi
Methanol/ Chloroform (1:1, v/v) Dịch chiết
Cô quay chân không Cặn chiết
2.3.7. Phương pháp xác ựịnh thành phần acid béo
Lấy khoảng 20 ộg vi tảo tươi cho vào ống nhựa và sấy khô mẫụ Sau ựó cho 5 ml chloroform/methanol (2 : 1, v/v) và chiết rút lipit bằng máy siêu âm trong 90 phút. Lọc lấy dịch chiết và rửa hai lần bằng dung dịch mới chiết. Sau ựó mẫu ựược cô cạn (làm bay hơi dung môi) và cặn chiết ựược hòa tan bằng methanol : acid sulfuric (95 : 5, v/v), ựun ở 80ồC trong 4h ựể este hóa các acid béọ Cho thêm 100 ml nước. Các acid béo sau khi ựược metyl este hóa ựược chiết hai lần với 2 ml n-hexanẹ Các acid béo này ựược phân tắch bằng máy sắc ký khắ (gas chromatography, GC) Finnigan Trace GC ultra, cột BPX70 (50MẦ). Các acid béo ựược xác ựịnh bằng cách so sánh thời gian lưu (retention time) của mẫu với thời gian lưu của dung dịch chuẩn và ựược ựịnh lượng bằng so sánh các peak với chuẩn.
2.3.8. Phương pháp thử ựộc tắnh tế bào Ờ khả năng kháng tế bào ung thư
Dịch chiết tảo ựược gửi ựi phân tắch tại Phòng Thử hoạt tắnh Sinh học, Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo phương pháp sau:
Xác ựịnh thành phần acid béo
Thử hoạt tắnh kháng tế bào ung thư
Phương pháp thử ựộc tế bào in vitro ựược viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (NCI) xác nhận là phép thử ựộc tố tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở ựiều kiện in vitro. Dòng tế bào ung thư ở người KB (Humanepidermic carcinoma) ựược cung cấp bởi ATCC là dòng luôn ựược sử dụng trong các phép thử ựộ ựộc tế bàọ Tế bào ung thư ựược nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) ở ựiều kiện chuẩn (5% CO2; 37oC; ựộ ẩm 98%; vô trùng tuyệt ựối), tế bào phát triển ở pha log sẽ ựược sử dụng ựể thử ựộc tắnh.
Cho 200 ộl dung tắch tế bào ở các pha log nồng ựộ 3 x 104 tb/ml vào mỗi giếng (ựĩa 96 giếng) của môi trường RPMI 1640. Dịch chiết tảo ựược xử lý với tế bào ở các nồng ựộ pha loãng khác nhau sao cho ựạt ựến nồng ựộ cuối cùng là 128 ộg/ml; 32 ộg/ml; 8 ộg/ml; 2 ộg/ml; 0.5 ộg/ml và ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 3 ngàỵ Giếng ựiều khiển (ựối chứng) gồm 200 ộl dung dịch tế bào (3 x 104 tb/ml) ủ ở 37oC, 5% CO2 trong 3 ngàỵ Cuối cùng thêm 50 ộl MTT (1 mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37oC, 5% CO2 trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 ộl DMSO, lắc ựều và ựọc kết quả ở các bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometer Genios TECAN.
Cách tắnh:
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) = (ODựiều khiển - ODmẫu) / ODựiều khiển
Giá trị IC50 ựược tắnh dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tắnh table curve [14,16].
2.3.9. Phương pháp sắc kắ bản mỏng (TLC)
Là phương pháp hiệu quả cho việc ựịnh tắnh, ựịnh lượng và tinh sạch các hợp chất hữu cơ.
lấy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh. Pha tĩnh chứa chất rắn hoặc lỏng gọi là các chất hấp thụ có khả năng chứa các chất hòa tan. Mẫu phân tắch chứa một hay nhiều cấu tử khi tiếp xúc với pha tĩnh và pha ựộng các cấu tử khác tách nhau ra do chúng có ái lực khác nhau với cả hai phạ
Việc tách các chất trong sắc kắ bản mỏng [20] dựa trên sự phân tách các chất giữa hai pha:
- Pha cố ựịnh là chất hấp thụ ựược trải rộng trên một phiến kắnh tạo thành lớp mỏng.
- Pha ựộng là dung môi thắch hợp ựựng trong bình có nắp ựậy kắn.
Trong quá trình sắc ký dung môi di chuyển làm dịch chuyển các thành phần trong mẫu (ựã ựược chấm thành từng vết trên phiến kắnh trải chất hấp phụ).
Tiến hành thắ nghiệm:
Pha mẫu sau cô quay thành 1 ml bằng hỗn hợp dung môi CHCl3/MeOH (1/1) 0.1 Ờ 10 mg/ml, chấm toàn bộ mẫu lên trên bản silicagel. đặt bản mỏng trong bồn thủy tinh chứa 50 ml hỗn hợp dung môi ethyl acetat : isopropanol : nước = 8 : 5 : 3 (v/v), trong 45 Ờ 60 phút. Sau khi làm khô tới nhiệt ựộ phòng, nhuộm TLC bằng nyhydrin 2% trong butanol bão hòạ Sấy khô, quan sát các vết xuất hiện trên nền TLC. Sau ựó ựánh dấu, cạo các vết lên cùng với microcystin chuẩn. Tái chiết rút ựộc tố này bằng hỗn hợp dung môi methanol : nước (80 : 20). đem dịch này ly tâm ở tốc ựộ 8000 vòng/phút, trong 15 phút. Sau ựó lọc qua cột C 18.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO
Các mẫu nước ựược lấy từ rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam định. Vi tảo ựược nuôi cấy làm giàu trên môi trường dịch thể BBM (phụ lục 1) trong các bình dung tắch 100 ml. Sau ựó, tiến hành cấy trải trên ựĩa thạch. Nuôi ở nhiệt ựộ phòng, với cường ựộ chiếu sáng 10000 Ờ 20000 Lux, soi và kiểm tra mẫụ Sau 5 Ờ 7 ngày, trên ựĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ, tách riêng từng khuẩn lạc cho vào lọ Penicillin dung tắch 20 ml. Tiếp ựó tiến hành quan sát ựộ tinh sạch của vi tảọ Lặp lại quy trình trên cho tới khi thu ựược các chủng vi tảo thuần khiết. Kết quả trình bày ở hình 3.1 và hình 3.2.
Hình 3.1. Nuôi cấy chủng A trong lọ Penicillin
Hình 3.2. Nuôi cấy trên môi trường thạch
Kết quả thực nghiệm ở hình 3.1 cho thấy nuôi và làm giàu vi tảo trong lọ Penicillin nhỏ là thắch hợp cho quá trình sinh trưởng của vi tảọ Sau 5 Ờ 7 ngày, trên ựĩa thạch ựã thấy khuẩn lạc vi tảo xuất hiện. Chủng vi tảo phân lập và ựược thuần khiết có ký hiệu là Ạ Sau ựó ựược giữ trong thạch nghiêng và bảo quản ở 4oC ựể dùng cho các nghiên cứu tiếp theọ
3.2. LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO CHỦNG VI TẢO A VI TẢO A
Một trong những yếu tố hàng ựầu tác ựộng trực tiếp ựến sinh trưởng và phát triển của vi tảo ựó là môi trường dinh dưỡng. Mặc dù là sinh vật quang tự dưỡng, nhu cầu chất dinh dưỡng không phải là quá khắt khe, ựặc biệt là dinh dưỡng hữu cơ, song do ựặc tắnh sinh lý của vi tảo dễ thay ựổi theo sự thay ựổi của môi trường, cho nên trong nuôi cấy việc lựa chọn môi trường dinh dưỡng thắch hợp là cần thiết.
đối với mỗi chủng vi tảo khác nhau phù hợp với môi trường dinh dưỡng cho sự sinh trưởng tối ưu là khác nhaụ Sự khác nhau ở ựây có thể là số loại chất hay cũng có thể là hàm lượng các chất dinh dưỡng, với việc nuôi cấy một chủng nào ựó thì cả hai vấn ựề này phải ựược quan tâm. Với tắnh chất là một nghiên cứu khởi ựầu cho một chủng tảo mới ựược phân lập, trong ựiều kiện khuôn khổ của một khóa luận tốt nghiệp, chúng tôi ựã lựa chọn bốn môi trường là C, BBM, BG 11, Bold 3N ựể tìm hiểu tác ựộng của môi trường dinh dưỡng lên sinh trưởng của chủng vi tảo Ạ
Trong nghiên cứu này, tiến hành nuôi tĩnh chủng vi tảo A trên bốn môi trường: C, BBM, BG 11, Bold 3N. Với mật ựộ tế bào ban ựầu nuôi cấy là 3.2 x 106/ml. Kết quả thu ựược ở bảng 3.1 và hình 3.3.
Số lượng tế bào nuôi trên bốn môi trường (x 106 tb/ml) Thời gian (ngày) C BBM BG 11 Bold 3N 0 3.2 3.2 3.2 3.2 2 7.2 10.6 10.2 5.3 4 13 16.5 14.3 10.6 6 14 28.2 26.5 17.3 8 20.1 37.1 35.2 31.2
10 28.2 52.6 48.7 46.8
12 24.3 62.8 40.5 32.4
14 20.1 58.6 35.1 28.1
Bảng 3.1. Khả năng sinh trưởng trên các môi trường khác nhau của chủng vi tảo A 0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 8 10 12 14
Ngày nuôi cấy
S ố l ư ợ ng tế b à o C BBM BG 11 Bold 3N
Hình 3.3. Khả năng sinh trưởng của chủng vi tảo A trên các môi trường khác nhau
Từ kết quả bảng 3.1 và hình 3.3 cho thấy chủng vi tảo A sinh trưởng tốt nhất trên môi trường BBM, sau ựó là môi trường BG 11, môi trường Bold 3N và cuối cùng là môi trường C. Tại ngày nuôi cấy thứ 12, mật ựộ tế bào ở môi trường BBM ựạt cao nhất là 62.8 x 106/ml. Còn ở môi trường BG 11, mật ựộ tế bào ựạt cao nhất chỉ là 48.7 x 106/ml, môi trường Bold 3N thấp hơn ựạt 46.8 x 106/ml, còn ở môi trường C, mật ựộ tế bào ựạt thấp nhất 28.2 x 106/ml. Vi tảo ở cả bốn môi trường ựều sinh trưởng mạnh khi bước vào ngày nuôi cấy thứ 6, ở ựó có sự phân biệt rõ rệt của vi tảo ở các môi trường. Chủng vi tảo A nuôi ở môi trường
BBM sinh trưởng mạnh từ ngày nuôi cấy thứ 6 ựến ngày nuôi cấy thứ 12 ựạt mật ựộ cao nhất sau ựó bắt ựầu suy giảm. Vào ngày kết thúc thắ nghiệm thì mật ựộ tế bào ở môi trường BBM vẫn ựạt cao nhất 58.6 x 106/ml, trong khi các môi trường kia giảm ựáng kể chỉ còn là 35.1 x 106 tb/ml ở môi trường BG11, 28.1 x 106 tb/ml ở môi trường Bold 3N, và thấp nhất là ở môi trường C chỉ còn 20.1 x 106 tb/ml.
Nhận thấy, môi trường BBM là môi trường dinh dưỡng tốt nhất cho chủng vi tảo A sinh trưởng và phát triển, ựồng thời quá trình suy tàn của chủng A trong môi trường này (sau khi mật ựộ tế bào ựạt cao nhất) chậm hơn nhiều so với các môi trường khác, nên mật ựộ cấy chuyển và nhân nuôi giữ giống thưa hơn, giúp tiết kiệm thời gian và kinh tế.
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA đỘ PH đẾN TỐC đỘ SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG VI TẢO A CHỦNG VI TẢO A
độ pH của môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh