phân tích thành phần dinh dưỡng của vi tảo chaetoceros phân lập từ rừng ngập mặn xuân thủy-nam định và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô.

Vì những lý do trên, cùng với mong muốn phát triển ngành nuôi trồng thủy sản và tìm ra một nguồn nguyên liệu có hiệu quả góp phần trong ñiều trị ung thư, chúng tôi thực hiện khóa luận :

VIỆN đẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -
  -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Phân tắch thành phần dinh dưỡng của vi tảo Chaetoceros phân lập

từ rừng ngập mặn Xuân Thủy-Nam định và thăm dò khả năng

kháng tế bào ung thư biểu mô

Người hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Hoài Hà

KS Phạm Thị Bắch đào

Sinh viên : Nguyễn Ngọc Tuyền

Hà Nội - 2010

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Hoài Hà, trưởng phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, đại học Quốc Gia Hà Nội ựã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu ựể thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn KS Phạm Thị Bắch đào, phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, đại học Quốc Gia Hà Nội ựã góp

ý, giúp ựỡ tôi hoàn thành khóa luận

đồng thời, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tập thể các Thầy, Cô giáo và cán bộ của Khoa Công nghệ Sinh học Ờ Viện đại học Mở Hà Nội ựã giảng dạy, giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn gia ựình, bạn bè ựã ựộng viên và giúp ựỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 05 năm 2010

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Tuyền

Chữ viết tắt Chữ viết ñầy ñủ

kDa Kilo Dalton (khối lượng phân tử)

Taq Taq (Thermus aquaticus) polymerases

PUFA Polyunsaturated fatty acid

MT F/2 ko Si Môi trường F/2 không silic

Danh mục hình

Hình 1.1 Rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam ðịnh 1

Hình 1.2 Bản ñồ khu hệ Rừng ngập mặn Xuân Thủy 2

Hinh 1.3 Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu ñược ở mùa khô năm 1996 tại RNM Xuân Thủy-Nam ðịnh 4

Hình 1.4 Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu ñược ở mùa mưa năm 1996 tại RNM Xuân Thủy-Nam ðịnh 5

Hình 1.5 Cấu trúc tế bào ở tảo silic 8

Hình 1.6 Một số loài tảo silic thường gặp 9

Hình 1.7 Hình ảnh một số loài trong chi tảo Chaetoceros 12

Hình 2.1 Các ñiểm lấy mẫu ñược ñịnh vị trên bản ñồ 19

Hình 3.1 Phân lập tảo trên các ñĩa thạch 34

Hình 3.2 Nuôi tảo trong các lọ Penicillin 34

Hình 3.3 Nuôi giữ giống vi tảo trong các bình tam giác dung tích 250 ml 35

Hình 3.4 Khả năng sinh trưởng của vi tảo chủng TC1 trên các môi trường khác nhau 37

Hình 3.5 Khả năng sinh trưởng của vi tảo chủng TC1 trên các thang ñộ mặn 40

Hình 3.6 Nuôi sinh khối vi tảo trong bình 5 lít có sục khí 24/24 và chiếu sáng.43 Hình 3.7 Hình ảnh vi tảo chủng TC1 trên kýnh hiển vi quang học Olympus CX41 44

Hình 3.8 Sắc ký ñồ thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1.49 Hình 3.9 Mật ñộ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm 54

Hình 3.10 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng 55

Danh mục bảng

Bảng 1.1 Thành phần loài thực vật nổi ven biển Xuân Thủy 6 Bảng 3.1 Số lượng tế bào chủng TC1 nuôi cấy trên sáu môi trường 36 Bảng 3.2 Mật ñộ tế bào chủng TC1 trên môi trường ASW với ñộ mặn khác nhau 40

Bảng 3.3 Thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 46 Bảng 3.4 Kết quả so sánh tỉ lệ acid béo trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1

và tỉ lệ acid béo trong vi tảo Amphiprora alata 50

Bảng 3.5 Kết quả thử khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô 53

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1

1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY – NAM ðỊNH 1

1.2 GIỚI THIỆU VỀ TẢO SILIC VÀ CHI Chaetoceros 7

1.2.1 Giới thiệu về tảo silic (Bacillariophyta) 7

1.2.1.1 ðặc ñiểm và cấu tạo tảo silic 7

1.2.1.2 Phân bố và vai trò tảo silic 8

1.2.2 Chi tảo Chaetoceros 9

1.2.2.1 Vị trí phân loại 9

1.2.2.2 ðặc ñiểm sinh học 10

Hình 1.7 Hình ảnh một số loài trong chi tảo Chaetoceros 12

1.2 3 Tình hình nghiên cứu tảo và chi Chaetoceros 12

1.3 TẾ BÀO BIỂU MÔ VÀ UNG THƯ BIỂU MÔ TẾ BÀO 14

1.3.1 Tế bào biểu mô 14

1.3.2 Ung thư biểu mô tế bào 15

1.4 KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA ACID BÉO TRONG VI TẢO 16

1.4.1 Giới thiệu chung về acid béo và vai trò 16

1.4.2 Khả năng kháng tế bào ung thư của acid béo 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 NGUYÊN LIỆU 20

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20

2.1.3 Hóa chất 21

2.1.4 Máy móc và dụng cụ 21

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi tảo biển 23

2.2.2.1 Làm giàu mẫu 23

2.2.2.2 Phương pháp tách và thuần khiết trên ñĩa thạch 23

2.2.3 Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng của vi tảo biển 24

2.2.5 Phương pháp phân loại vi tảo biển 26

2.2.5.1 Phương pháp hình thái học 26

2.2.5.2 Phương pháp ñịnh loài bằng sinh học phân tử 26

2.2.6 Phương pháp nhân nuôi và thu sinh khối 30

2.2.7 Phương pháp xác ñịnh thành phần acid béo 32

2.2.8 Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC) 32

2.2.9 Phương pháp thử khả năng kháng tế bào ung thư của acid béo 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI TẢO BIỂN 35

3.2 LỰA CHỌN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO VI TẢO CHỦNG TC1 ðà TUYỂN CHỌN ðƯỢC 36

3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA ðỘ MẶN LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO CHỦNG TC1 40

3.4 NHÂN NUÔI SINH KHỐI 42

3.5 PHÂN LOẠI VI TẢO CHỦNG TC1 ðà TUYỂN CHỌN 44

3.5.1 Phân loại theo hình thái học 44

3.5.2 Phân loại dựa theo sinh học phân tử 46

3.6 XÁC ðỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO CỦA VI TẢO Chaetoceros muelleri TC1 47

3.7 XÁC ðỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ 53

KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

Trên thế giới mỗi năm cĩ 10.9 triệu người được chẩn đốn là mắc ung thư, trong đĩ cĩ 6.7 triệu người sẽ chết vì căn bệnh này Ung thư đang gia tăng một cách nhanh chĩng và điều này là nguyên nhân chính làm thay đổi nhân khẩu của dân số thế giới Ung thư gan, phổi, vú, ruột, dạ dày, tuyến tiền liệt, cổ và thực quản là những căn bệnh ung thư phổ biến nhất, trong đĩ ung thư phổi và ung thư

dạ dày gây tử vong cao nhất Giáo sư John Toy, giám đốc của tổ chức từ thiện chuyên nghiên cứu về ung thư ở Anh cho biết ung thư vẫn là căn bệnh lớn trong thế giới phát triển [43]

Ở Việt Nam, số người mắc bệnh ung thư cũng khá cao, đặc biệt là ung thư gan Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam cĩ đến 10000 ca mắc mới,

và trở thành quốc gia cĩ tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan đứng thứ 3 trên thế giới Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn trễ nên việc chữa trị khơng cịn hiệu quả Chỉ khoảng 30% - 40% bệnh nhân sống được thêm 5

năm sau khi phát hiện bệnh [44]

Chính vì vậy, việc tìm ra liệu pháp điều trị bệnh ung thư đạt hiệu quả cao

và chi phí vừa phải đang là vấn đề cần được quan tâm

Mặt khác, với địa hình thuận lợi: đường bờ biển kéo dài, nhiều sơng, suối,

ao, hồ… ngành nuơi trồng thủy sản ở nước ta trong những năm gần đây đang rất phát triển, song mới chỉ tập trung vào đánh bắt, nuơi các lồi thủy hải sản, nên chưa phát huy được hết tiềm năng của ngành

Trong các tiềm năng đĩ, việc nuơi trồng các lồi vi tảo cũng đang là một hướng được nhiều nước trên thế giới đặc biệt quan tâm Bởi vi tảo khơng những đem lại nguồn thức ăn cho các lồi thủy hải sản, mà cịn là nguồn cung cấp dược

tính cao, giá thành vừa phải, mà nổi bật là các acid béo ñược chiết xuất từ vi tảo Hiện nay, các nhà khoa học ñã tìm ra rất nhiều loại acid béo trong vi tảo có khả năng ngăn ngừa và ức chế tế bào ung thư, trong ñó có thể kể ñến các acid béo thuộc nhóm omega 3, omega 6… ñều có hoạt tính diệt bào ñối với các tế bào ung thư như ung thư vú, phổi và tuyến nhiếp hộ, và không tác ñộng trên các tế bào bình thường Trên thực tế, các acid béo chưa no loại có nhiều nối ñôi có hoạt tính

diệt bào (in vitro) ít nhất là ñối với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các

cơ quan khác nhau [41]

Vì những lý do trên, cùng với mong muốn phát triển ngành nuôi trồng thủy sản và tìm ra một nguồn nguyên liệu có hiệu quả góp phần trong ñiều trị

ung thư, chúng tôi thực hiện khóa luận : “Phân tích thành phần dinh dưỡng

của vi tảo Chaetoceros phân lập từ rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam ðịnh

và thăm dò khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô” Với mục tiêu như sau:

• Phân lập chủng vi tảo Chaetoceros từ các mẫu lấy từ rừng ngập mặn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ RỪNG NGẬP MẶN XUÂN THỦY Ờ NAM đỊNH

Rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam định là một vùng ựất có lịch sử phát triển trên 150 năm, bao gồm các cồn bãi tự nhiên xen kẽ các sông lạch chằng chịt, tạo nên hệ sinh thái ựất ngập nước tiêu biểu của vùng cửa sông ven biển của miền Bắc Việt Nam địa hình và thổ nhưỡng của khu vực ựược tạo bởi phù sa của sông Hồng và Biển đông Từ ựây hình thành các bãi bồi lớn với những cánh rừng ngập mặn xanh tốt trải dài trên khắp vùng ngập triều ở phắa ựông nam huyện Giao Thủy, tỉnh Nam định

Hình 1.1 Rừng ngập mặn Xuân Thủy Ờ Nam định [17,48]

Rừng ngập mặn Xuân Thủy là vùng rừng ngập mặn ựầu tiên ở Việt Nam ựược công nhận theo công ước quốc tế Ramsar (công ước về những vùng ựất ngập mặn có tầm quan trọng quốc tế) Vườn thuộc ựịa giới huyện Giao Thủy, tỉnh Nam định với tổng diện tắch tự nhiên lên tới 7100 ha (trong ựó có 3100 ha diện tắch ựất nối có rừng và 4000 ha ựất rừng ngập mặn), bao gồm 1 phần cồn Ngạn, toàn bộ cồn Lu và cồn Xanh Vùng ựệm còn lại bao gồm một phần cồn

Ngạn (ở trong vành lược), toàn bộ bãi trong và diện tích của 5 xã: Giao Thiện, Giao An, Giao Lạc, Giao Xuân, Giao Hải với tổng diện tích tự nhiên lên tới 8000

ha

Hình 1.2 Bản ñồ khu hệ rừng ngập mặn Xuân Thủy [23]

-Về ñịa hình: ðịa hình tự nhiên của rừng ngập mặn Xuân Thủy ñược kiến tạo bởi quy luật bồi lắng phù sa của vùng cửa sông ven biển Các bãi bồi lớn xen kẽ với các dòng sông tạo nên cảnh quan ñặc thù của khu vực

-Về khí hậu: Rừng ngập mặn Xuân Thủy nằm trong khu vực khí hậu nhiệt ñới gió mùa chịu ảnh hưởng trực tiếp của biển Do nằm trong vùng vĩ ñộ thấp nên khu vực này chịu sự chi phối của chế ñộ nội chí tuyến, nhiệt ñộ của vùng khá cao

-Về thổ nhưỡng: Rừng ngập mặn Xuân Thủy là vùng ñất ñược bồi tụ bởi phù

sa sông Hồng, ñất chưa phân hóa rõ rệt, còn giữ nguyên tính chất của lớp ñất mới bồi tụ, có nhiều lớp xen kẽ, nền ñáy gồm bùn lẫn sét và cát mịn Phía trong rừng

nền ñáy còn ñược phủ một lớp xác thực vật tạo nên lớp mùn hữa cơ giàu dinh dưỡng

-Về sinh thái: Rừng ngập mặn Xuân Thủy là nơi có ña dạng sinh học cao, thể hiện qua số lượng lớn các loài ñộng vật, thực vật, vi sinh vật Theo số liệu của các cuộc ñiều tra, ở rừng ngập mặn Xuân Thủy hiện có [17]:

105 loài thực vật bậc cao có mạch trong ñó có 20 loài thích nghi với ñiều kiện sống ngập nước, hình thành hệ thống rừng ngập mặn rộng trên 3000

ha, ñem lại những lợi ích quý giá và phong phú cho cho toàn khu vực

Trên 200 loài chim, trong ñó có trên 100 loài chim di trú, 50 loài chim nước Có 9 loài ghi vào sách ñỏ quốc tế Số lượng cá thể chim di trú lúc ñông ñúc lên tới 40 000 con Ở Việt Nam hầu như chỉ có thể bắt gặp cò thìa và Choi Choi mỏ thìa ở rừng ngập mặn Xuân Thuỷ (có lúc cò thìa tại ñây chiếm tới 20% số lượng cá thể hiện có của Thế giới) Những loại chim quý hiếm nay ñã thành biểu trưng sinh ñộng của rừng ngập mặn Xuân Thuỷ

Trên 10 loài thú, trong ñó có 3 loại thú quý hiếm ở nước (như cá heo, rái cá ) cùng với hàng trăm loại bò sát, côn trùng và lưỡng cư khác ñã tạo lên bức tranh về ña dạng sinh học rất ñộc ñáo và vô giá ở rừng ngập mặn Xuân Thuỷ

Trên 500 loài ñộng vật thuỷ sinh

104 loài thực vật nổi

* Theo số liệu của Sở thủy sản Nam ðịnh, mùa khô năm 1996 có kết quả thu mẫu của 37 loài thuộc 4 ngành tảo:

 Ngành tảo silic (Bacillariophyta) 15 chi, 27 loài, chiếm 73%

 Ngành tảo giáp (Pyrrophyta) 2 chi, 4 loài, chiếm 10.8%

 Ngành tảo lam (Cyanophyta) 2 chi, 3 loài, chiếm 8.1%

 Ngành tảo lục (Chlorophyta) 3 chi, 3 loài, chiếm 8.1%

Hình 1.3 Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu ñược ở mùa khô năm 1996

tại RNM Xuân Thủy-Nam ðịnh

Hai chi có số loài cao thuộc ngành tảo silic, các chi còn lại chiếm từ 1-2 loài

* Kết quả thu mẫu mùa mưa năm 1996 ñược 40 loài theo tỷ lệ:

 Ngành tảo silic (Bacillariophyta) 15 chi, 30 loài, chiếm 75%

 Ngành tảo giáp (Pyrrophyta) 1 chi, 5 loài, chiếm 12.5%

 Ngành tảo lam (Cyanophyta) 2 chi, 2 loài, chiếm 5%

 Ngành tảo lục (Chlorophyta) 3 chi, 3 loài, chiếm 7.5%

Hình 1.4 Cơ cấu các ngành tảo trong mẫu thu ñược ở mùa mưa năm 1996

tại RNM Xuân Thủy-Nam ðịnh

Số tảo giáp, tảo lam, tảo lục không có giá trị làm thức ăn cho thủy hải sản chiếm 25% tổng số loài Mặc dù số loài phát hiện ở trên còn thấp nhưng lại có mặt nhiều loài ưu thế ở vùng cửa sông ven biển, ngành tảo silic chiếm tỷ lệ lớn tạo sinh khối lớn làm thức ăn phong phú cho các loài ñộng vật thủy sinh

*Hay như kết quả khảo sát tại cửa Ba Lạt và ven biển Xuân Thủy năm

2004 ñã thống kê ñược 112 loài thuộc 43 chi, 20 họ của 5 ngành vi tảo lớn:

 Ngành tảo silic (Bacillariophyta)

 Ngành tảo giáp (Pyrrophyta)

 Ngành tảo lam (Cyanophyta)

 Ngành tảo lục (Chlorophyta)

 Ngành tảo mắt (Euglenophyta)

Bảng 1.1 Thành phần loài thực vật nổi ven biển Xuân Thủy

Trong ñó tảo silic bao giờ cũng là ngành chiếm ưu thế về cả số lượng họ,

chi và loài Những họ Chaetoceraceae, Rhizosoleniaceae, Naviculaceae, Fragillariaceae là thành phần cấu trúc cơ bản không chỉ của ngành tảo silic mà

còn cho toàn khu hệ thực vật nổi bởi sự ña dạng về chi và loài Hơn nữa, rất nhiều trong chúng phát triển ñông về số lượng, là nguồn thức ăn có giá trị và oxy hòa tan cho giáp xác và những loài ăn thực vật nổi [7]

Giá trị bảo tồn ña dạng sinh học của vườn quốc gia thể hiện qua các mặt sau:

o Là nơi dự trữ nguồn gen, là di sản thiên nhiên cho hậu thế

o Là hiện trường nghiên cứu khoa học trong nước và quốc tế

o Là cơ sở giáo dục môi trường cho cộng ñồng về bảo tồn thiên nhiên

và phát triển bền vững

Ngoài giá trị bảo tồn cao, rừng ngập mặn Xuân Thủy có vai trò cố ñịnh phù sa ñể tạo nên các cồn bãi mới, tạo nguồn năng lượng sơ cấp, làm vườn ươm

và cung cấp thức ăn dồi dào cho các lồi thủy sinh Giá trị về thuỷ sản ở khu vực hàng năm ước đạt tới 50 tỷ đồng, phần lớn là nhờ vào khu dự trữ thiên nhiên quan trọng này

1.2 GIỚI THIỆU VỀ TẢO SILIC VÀ CHI Chaetoceros

1.2.1 Giới thiệu về tảo silic (Bacillariophyta)

1.2.1.1 ðặc điểm và cấu tạo tảo silic

Tảo silic là những tảo nhỏ, cĩ kích thước hiển vi, bao gồm những tảo đơn bào đơn độc hay sống tập đồn Tế bào cĩ cấu trúc màng độc đáo gọi là vơ giáp

Vỏ gồm hai lớp, lớp trong bằng chất pectin và lớp ngồi bằng oxit silic tinh khiết

Tảo silic cĩ nhiều hình dạng khác nhau: hình hộp trịn, hình trụ, hình trứng, hình hộp nhọn hai đầu, hình que Khái quát chung vỏ tế bào chúng tựa như một cái hộp gồm hai nắp úp lồng vào nhau: vỏ trên (epitheca) lớn, vỏ dưới (hypotheca) nhỏ Mặt của vỏ trên và dưới là mặt vỏ (valve) Phần vỏ thân của hộp là vịng vỏ (girdle), phần vỏ trên và vỏ dưới lồng vào nhau là đai nối (connecting band) hoặc đai vịng Ngồi ra nắp vỏ cịn cĩ những phần đặc biệt như: vân (stria) hay vạch đai thường song song, sườn (costa) là những vân dài xếp thành hình song song hay xuyên tâm [1]

Chất tế bào trong suốt, thường chiếm lớp sát vỏ hay nắm cách xa vỏ thành cục nhỏ và nối liền với vỏ bằng các sợi chất tế bào Nhân tế bào cĩ hình dạng biến thiên tùy theo hình dạng tế bào: hình trịn, thoi hay bầu dục, tế bào chứa 1 nhân và ở đa số lồi nhân nằm trên chất tế bào, nhưng ở một số lồi nhân nằm ở giữa tế bào trên các sợi chất tế bào.Thể màu nằm trong chất tế bào, áp sát vỏ dưới dạng bản lớn hình chữ H như ở tảo silic lơng chim, hoặc dưới dạng đĩa và

hạt như ở tảo silic trung tâm Chất dự trữ là dầu dưới dạng giọt da cam sáng, ngoài ra còn có các hạt volutin màu xanh da trời [3]

Tảo silic sinh sản chủ yếu bằng hình thức phân cắt tế bào Ngoài ra, chúng còn có hình thức sinh sản bằng bào tử tự thân và khi gặp ñiều kiện bất lợi chúng

có thể hình thành bào tử nghỉ [3]

Hình 1.5 Cấu trúc tế bào ở tảo silic [29]

1.2.1.2 Phân bố và vai trò tảo silic

Tảo silic có số loài nhiều thứ hai sau tảo lục Chúng phân bố hết sức rộng rãi trên trái ñất: trên thân cây ở ñỉnh núi cao, trên ñất, ñá ẩm, mọi thủy vực nước ngọt, nước lợ, nước mặn Có thể gặp tảo silic ở ñáy biển sâu hàng nghìn mét Trong nước hàm lượng tảo silic phong phú nhất ở ñộ sâu 5-30m nhưng sinh khối lại thường ñạt mức cao nhất ở ñộ sâu 20-50m Trong thực vật phù du, tảo silic chiếm 60-70%, có khi lên tới 84% về số loài cũng như sinh vật lượng Tuy tảo silic không phải là những ñối tượng có giá trị kinh tế có thể khai thác phục vụ ngay cho ñời sống con

người nhưng nếu thiếu chúng sẽ không có nguồn thức ăn hữu cơ ban ñầu, mọi nguồn lợi hải sản ñều không có cơ sở ñể tồn tại Như vậy có thể nói tảo silic là thành phần chính của năng suất sơ cấp, hàng năm thực vật phù du (chủ yếu là tảo silic) tạo ra 19 tỷ tấn chất hữu cơ nuôi sống 5 tỷ tấn ñộng vật không xương sống Qua nhiều năm xác của tảo silic tạo nên các mỏ “diatomid” lớn do cấu trúc silic của nắp vỏ không bị phân hủy “Diatomid” có tính chất nhẹ, xốp, trơ với acid nên ñược

sử dụng rộng rãi ñể chế tạo các sản phẩm cách ñiện, cách nhiệt, chất ñệm trong thuốc nhuộm… Các tầng “diatomid” còn là cơ sở ñể xác ñịnh tuổi của các ñịa tầng

và lịch sử vỏ trái ñất từ cuối kỷ Jura cho ñến nay [2,3]

Hình 1.6 Một số loài tảo silic thường gặp: Chaetoceros, Navicula,

Cocconeis, Asterionella [3]

1.2.2 Chi tảo Chaetoceros

1.2.2.1 Vị trí phân loại

Theo hệ thống phân loại thì vị trí phân loại về mặt hệ thống của chi

Chaetoceros như sau [25]:

Ngành: Bacillariophyta

Lớp: Coscinodiscophyceae

Bộ: Chaetocerotales

Họ: Chaetocerotaceae

Chi: Chaetoceros

1.2.2.2 ðặc ñiểm sinh học

Chi tảo Chaetoceros (hay còn gọi là tảo lông gai) là một chi có nhiều loài

nhất trong tảo silic phù du biển, chúng phân bố rất rộng từ các vùng biển lạnh ñến vùng nhiệt ñới, từ vùng biển xa ñến vùng ven bờ Sinh vật lượng của chi

Chaetoceros (tảo lông gai) ở các vùng biển Việt Nam thường chiếm tới 40%

trong tảo silic, vì vậy trong chừng mực nhất ñịnh chúng có thể ñại diện cho ñặc ñiểm sinh thái và tình hình phân bố của tảo silic

Ngoài một số loài phân bố rộng trên thế giới như: Chaetoceros affinis, C.didymus, C.peruvianus…, hầu hết các loài tảo lông gai ở vùng biển Việt Nam thuộc loại gần bờ nhiệt ñới như: Chaetoceros pseudocurvisetus, C.lorenzianus, C.distans, C.brevis…, một số thuộc loài biển khơi nhiệt ñới như: Chaetoceros messanensis, C.coarctatus…, một số thuộc loài á nhiệt ñới hoặc ôn ñới như: Chaetoceros constrictus, C.compressus… Từ tính chất sinh thái nói trên nên bức

tranh chung về phân bố của chi tảo này thường thấy chúng tập trung nhiều ở vùng ven bờ [2]

Chaetoceros có hình dạng rất ñặc trưng Tế bào hình hộp bầu dục, vỏ

mỏng, nối với nhau bằng gốc lông gai hoặc mặt vỏ thành chuỗi dài, một số ít loài sống riêng lẻ từng tế bào Mặt vỏ tế bào hình bầu dục, có một số ít loài là gần tròn Mặt vỏ thường bằng phẳng, cũng có khi lõm xuống hoặc chính giữa lại lồi lên Do ñó cắt ngang tế bào hình bầu dục nên mặt vòng vỏ ở phía trước và phía sau rộng là mặt vòng vỏ rộng (broad girdle), ở bên trái và bên phải hẹp là mặt vòng vỏ hẹp (narrow girdle) Mặt vòng vỏ rộng có dạng chữ nhật, mặt vòng vỏ

hẹp có dạng lục lăng dài Trên mặt vòng vỏ có ñai nối, chỗ vòng vỏ tiếp giáp với ñai nối có khi hình thành rãnh lớn, tùy loại có thể thấy rõ hoặc không

Ở hai cực của mặt vỏ tế bào có hai lông gai dài vươn ra, phần gốc các lông gai của hai tế bào cạnh nhau giao chéo với nhau nối thành chuỗi dài thẳng hoặc cong, xoắn Lông gai ở mặt vỏ của tế bào ñầu hoặc cuối chuỗi có khi khác nhau

và khác với lông gai trong chuỗi Lông gai trong chuỗi cũng có khi có những dạng ñặc biệt Trên mặt vỏ tế bào và trên lông gai có khi có gai nhỏ hoặc u lồi nhỏ

Khe tế bào của các loài cũng có hình dạng rộng hẹp khác nhau, ở một số loài không có khe tế bào

Thể sắc tố dạng hạt nhỏ, dạng ñĩa hoặc dạng tấm, nhiều hoặc ít, phân bố trong thân tế bào hoặc có khi ở cả trong lông gai tùy theo loài Hình thái tế bào của một số loài thuộc chi này rất giống nhau, ñể ñịnh loại chính xác ñối với những loài ấy cần quan sát bào tử nghỉ của chúng, hình dạng của vỏ trên, vỏ dưới, có gai hoặc không, cấu tạo hoặc phân bố của chúng ở hai mặt vỏ

Căn cứ vào số lượng và sự phân bố của thể sắc tố chia chi tảo này thành 3 chi phụ (Subgenus), ngoài ra còn căn cứ vào hình thái chung của chuỗi tế bào và tính sinh thái riêng của từng loại ñể chia thành các nhóm (Section):

 Chi phụ tảo lông gai nhiều thể sắc tố có trong gai polychromatophorus)

(Phaeoceros- Chi phụ tảo lông gai nhiều thể sắc tố, không có trong lông gai (Hyalochaeto- polychromatophorus)

 Chi phụ tảo lông gai ít thể sắc tố (Oligochromatophorus) [2]

(a) (b) (c)

Hình 1.7 Hình ảnh một số lồi trong chi tảo Chaetoceros

(a) Chaetoceros gracilis, (b) Chaetoceros concavicarnus, (c) Chaetoceros

decipiens [18,24]

1.2.3 Tình hình nghiên cứu tảo và chi Chaetoceros

Trên thế giới hiện nay đã phát hiện được khoảng 40000 lồi tảo (theo dự đốn chiếm khoảng 11% số lồi thực vật) phân bố rộng rãi khắp nơi từ đỉnh núi cao đến đáy biển sâu, ngay cả trong đất sa mạc và băng tuyết vĩnh cửu người ta vẫn thấy khá nhiều lồi tảo sinh sống Ở Việt Nam đã phát hiện được trên 2000 lồi tảo Dù sống ở bất kỳ nơi nào, tảo luơn đĩng vai trị là sinh vật sản xuất trong mọi chuỗi thức ăn do chúng cĩ khả năng quang tự dưỡng hay dị dưỡng kiểu hoại sinh, các chất vơ cơ, hữu cơ cĩ thể hấp thụ sẽ được tảo đồng hĩa Vi tảo được coi là một trong bẩy nhĩm sinh vật được dùng làm chỉ thị sinh học trong nghiên cứu đánh giá chất lượng nước (vi khuẩn, nguyên sinh vật, vi tảo, giáp xác nhỏ, động vật khơng xương sống lớn, thực vật thủy sinh và cá) [3]

Vi tảo được sử dụng rộng rãi trong nuơi trồng các loại thủy hải sản cĩ giá trị kinh tế cao, trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ các lĩnh vực: thẩm

Mỹ, chữa bệnh, xử lí chất thải, đặc biệt việc sản xuất nhiên liệu sạch từ tảo đang

là một hướng đi tiềm năng cho ngành năng lượng Các loại thực phẩm dinh

dưỡng ña chức năng sản xuất từ vi tảo ngày càng ñược ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới: Nhật Bản, Mỹ …

Hiện nay, một số loài vi tảo silic như: Chaetoceros, Nitzschia, Skeletonema, Navicula… ñược sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản có giá

trị kinh tế cao như: nhum sọ, hầu, tu hài, ngao, vẹm sanh, bào ngư, cá măng … Các loài vi tảo trên có thể ñược nuôi trên môi trường nhân tạo tinh khiết hoặc môi trường tự nhiên có bổ sung thêm các thành phần khoáng [22,35]

Ở nước ta quá trình nghiên cứu về vi tảo diễn ra khá muộn so với thế giới (cách ñây 20 năm trên thế giới ñã có những nghiên cứu về tảo silic ở biển) Maurice Rose là người ñầu tiên nghiên cứu về sinh vật phù du ở các vùng biển Việt Nam Năm 1926, ông công bố danh mục 13 chi, 20 loài tảo ở vịnh Nha Trang Sau ñó Dawindoff C, Serene R, Yamashita M, Hàn Quốc Trương cũng ñã xác ñịnh trên 200 loài tảo silic ở vịnh Nha Trang, ven bờ biển Trung và Nam Bộ [2] Nhìn chung, các nghiên cứu ở giai ñoạn này mới chỉ dừng ở việc xác ñịnh sự

ña dạng về thành phần loài Những nghiên cứu sau này ngày càng tập trung sâu vào việc nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học, cơ sở sinh lí, hóa sinh của các loài vi tảo

có khả năng ứng dụng cao trong thực tiễn sản xuất

Nguyễn Thị Hương và các cộng sự ñã thu thập, phân lập và lưu giữ ñược

17 loài vi tảo biển thuộc ngành: tảo khuê, tảo lục, tảo vàng ánh trong ñó có trên

10 loài tảo là của Trung Quốc, ðan Mạch, Úc, Philippines như: Isochrysis galbana, Tetraselmis suecica, Nannochloropsis oculata,… và những loài tảo silic ở Việt Nam như: Chaetoceros muelleri, Nitzchia closterium, Navicula sp., Amphora sp., Skeletonema costatum [36]

Viện Công nghệ Sinh học Việt Nam ñã có ñề tài nghiên cứu về vi tảo trong ñó có các dự án ñang triển khai như: nhiên liệu sinh học từ tảo biển của

Việt Nam (từ sinh khối tảo biển, vi tảo quang tự dưỡng và dị dưỡng); nghiên cứu xây dựng tập đồn giống vi tảo biển quang tự dưỡng, dị dưỡng của Việt Nam và nuơi sinh khối một số lồi tảo dị dưỡng làm thức ăn trong nuơi trồng thủy sản; nghiên cứu đánh giá và khai thác các hoạt chất từ tảo biển Việt Nam; sàng lọc, phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi tảo biển dị dưỡng

giàu DHA (Labyrithula, Schizochytrium…) từ các vùng bờ biển Việt Nam; đa

dạng sinh học tảo nĩi chung và định tên các lồi tảo độc hại nĩi riêng bằng kĩ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, đọc trình tự các đoạn gen 16S, 18S, ITS1-5, 8S-ITS2 rRNA, D1-D3 của gen 28S rRNA; nghiên cứu tính kháng với một số hợp chất gây ơ nhiễm mơi trường nuơi trồng thủy sản và đào thải chúng bằng việc sử dụng vi tảo [37]

Tại phịng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Cơng nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội cũng đã cĩ rất nhiều nghiên cứu về ứng dụng của vi tảo, đặc

biệt là các chủng vi tảo thuộc chi Chaetoceros Chaetoceros mang những đặc

trưng cơ bản và nổi trội của ngành tảo silic, đặc biệt chứa hàm lượng lớn các acid béo cần thiết cho con người như: EPA, DHA, AA… Chính vì vậy,

Chaetoceros được ứng dụng rất nhiều trong nuơi trồng thủy hải sản, nhằm tăng

năng suất chất lượng con giống thủy hải sản Bên cạnh đĩ, các cán bộ khoa học

tại phịng cũng đang triển khai hướng nghiên cứu mới để ứng dụng Chaetoceros

vào điều chế các chế phẩm sinh học cĩ hoạt tính cao nhằm phục vụ đời sống con người

1.3 TẾ BÀO BIỂU MƠ VÀ UNG THƯ BIỂU MƠ TẾ BÀO

1.3.1 Tế bào biểu mơ

Trong ngành Sinh học và Y học, biểu mơ được định nghĩa là một loại mơ bao gồm các tế bào nằm lĩt trong các khoang trống và các bề mặt của các cấu

trúc trong cơ thể, liên kết chặt chẽ với nhau và không có bất kỳ cấu trúc gian bào nào Nhiều tuyến của cơ thể cũng ñược cấu tạo chủ yếu bằng biểu mô Nó luôn nằm tựa lên mô liên kết, và nằm giữa hai lớp mô này là màng ñáy [45,46]

Trong cơ thể người, biểu mô ñược phân loại là một trong những mô căn bản, cùng với các mô khác như mô liên kết, mô cơ, mô thần kinh

Chức năng của các tế bào biểu mô bao gồm chế tiết, thẩm thấu chọn lọc, bảo vệ, vận chuyển giữa các tế bào và cảm thụ xúc giác

Trong biểu mô không có mạch máu và mạch bạch huyết nên biểu mô ñược nuôi dưỡng nhờ những chất dinh dưỡng khuếch tán từ mô liên kết qua màng ñáy

Biểu mô có nguồn gốc từ cả ba lá phôi:

+ Ngoại bì (lá phôi ngoài): là nguồn gốc của biểu mô da, biểu mô của các khoang mũi, miệng, hậu môn…

+ Trung bì (lá phôi giữa): là nguồn gốc của biểu mô hệ hô hấp, ống và các tuyến tiêu hóa…

+ Nội bì (lá phôi trong): là nguồn gốc của biểu mô lót trong mạch máu và mạch bạch huyết, biểu mô của các thành mạch…[46]

Biểu mô ñược chia làm hai loại là:

+ Biểu mô phủ: là loại biểu mô lót mặt trong của một khoang cơ thể hoặc mặt ngoài của một cơ quan

+ Biểu mô tuyến: là tập hợp các tế bào có chức phận chế tiết và bài xuất các chất

1.3.2 Ung thư biểu mô tế bào

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan ñến việc phân chia tế bào một cách vô tổ chức và những tế bào ñó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng

cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển ñến nơi xa (di căn) [47]

Ung thư biểu mô là loại ung thư rất phổ biến Ung thư biểu mô

(carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô Nguyên nhân gây ung thư nói

chung hay ung thư biểu mô nói riêng là sự sai hỏng của DNA, tạo nên các ñột biến ở các gene thiết yếu ñiều khiển quá trình phân bào cũng như các cơ chế quan trọng khác Một hoặc nhiều ñột biến ñược tích lũy lại sẽ gây ra sự tăng sinh không kiểm soát và tạo thành khối u [47]

Có thể kể ñến một số loại ung thư biểu mô thường gặp như: ung thư biểu

mô nhú, ung thư biểu mô tủy, ung thư biểu mô gan, ung thư biểu mô da, ung thư biểu mô vòm họng… trong ñó ung thư biểu mô gan và ung thư biểu mô da ñang ngày càng xuất hiện nhiều ở nước ta [44]

1.4 KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA ACID BÉO TRONG

VI TẢO

1.4.1 Giới thiệu chung về acid béo và vai trò

Acid béo là các chuỗi nguyên tử cacbon thẳng hàng và dài, chứa khoảng 12-22 nguyên tử (C12-C22) Chúng có một ñầu hòa tan trong nước và một ñầu methyl hòa tan trong dầu Dọc theo chuỗi cacbon là các nguyên tử hydro Những chuỗi này là thành phần quan trọng trong màng của mọi sinh vật sống

Mỗi ngành tảo có một tỉ lệ thành phần các loại acid béo riêng Thành phần các loại acid béo của vi tảo biển chủ yếu là các acid béo: 16:0, 16:1n-7, 18:1n-9

và 20:5n-3 Trong khi ñó, ở các tảo nước ngọt, tỉ lệ các acid béo loại 16:0 và 18:1 chiếm ưu thế [28]

Các acid béo không no ñặc biệt là các acid béo thuộc nhóm omega 3 (ω3)

và omega 6 (ω6) rất có lợi cho cơ thể: ngăn ngừa xơ vữa ñộng mạch bằng cách kết hợp với cholesterol tạo các este cơ ñộng không bền vững và dễ bài xuất ra khỏi cơ thể, ñiều hòa tính bền vững của thành mạch nâng cao tính ñàn hồi và hạ thấp tính thấm của thành mạch, liên quan ñến cơ chế chống ung thư, cần thiết cho các chuyển hóa vitamin nhóm B Một số tổ chức như gan, não, tim, tuyến sinh dục có nhu cầu cao về các acid béo chưa no nên khi không ñược cung cấp

ñủ từ thức ăn thì các rối loạn sẽ xuất hiện ở các cơ quan này trước tiên Trong các loại acid béo thì acid omega 3 và omega 6 là hai acid quan trọng mà cơ thể không tự tổng hợp ñược [30]

1.4.2 Khả năng kháng tế bào ung thư của acid béo

Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học ñã tìm ra rất nhiều loại hợp chất sinh học có khả năng ngăn ngừa và ức chế tế bào ung thư, trong ñó có thể kể ñến các acid béo thuộc nhóm omega 3, omega 6… Có thể kể ñến một vài công bố về khả năng kháng tế bào ung thư của acid béo như sau:

Tại trường ñại học Indian, nhóm nghiên cứu của giáo sư Rafat Siddiqui ñã nghiên cứu tác ñộng của hai acid béo omega 3: docosahesaenoic acid (DHA) và eicosapentaenoic acid (EPA) ñối với bệnh ung thư vú Cả hai ñều có tác ñộng nhỏ lên các tế bào ung thư khi ứng dụng ñơn lẻ Nhưng khi kết hợp chúng với propofol, các nhà nghiên cứu nhận thấy chúng có khả năng ngăn chặn sự lây lan của tế bào ung thư ở một chừng mực nào ñó Họ ghi nhận cả hai sự kết hợp propofol-DHA và propofol-EPA ñều cho nhiều hiệu quả rõ rệt hơn Chúng không chỉ ngăn chặn sự lây lan của tế bào ung thư, kìm hãm các khối u mới tiềm

ẩn mà còn có thể giết chết một số tế bào ung thư [39]

Tại ñại học Kuopio, nhóm nghiên cứu của tiến sĩ David E Laaksonen cũng công bố kết quả trong việc ứng dụng các acid béo nhóm omega 6 trong ñiều trị ung thư tiền liệt tuyến Kết quả cho thấy, ở những người hấp thu acid linoleic nhiều nhất, nguy cơ phát triển ung thư tuyến tiền liệt thấp hơn 45% so với những trường hợp hấp thụ ít hơn Loại acid hữu ích này còn có khả năng phòng chống một số bệnh ung thư khác, song không ñáng kể như ñối với ung thư tuyến tiền liệt Bên cạnh acid linoleic, những người có thêm lượng acid béo thuộc nhóm omega 6 và các acid béo không sinh cholesterol trong máu cao cũng khó bị ung thư tuyến tiền liệt Kết quả này không thay ñổi ngay cả khi có sự can thiệp của những yếu tố như béo phì và mức vận ñộng cơ thể [38]

Tiến sĩ Rashida A Karmali của viện ðại học Rutgers và trung tâm nghiên cứu ung thư Memorial Sloan-Kettering ñã nghiên cứu thấy rằng acid béo omega

3 ñã có những ñặc tính ñáng ñược nghiên cứu và phát huy ñể nó có thể trở thành loại thuốc ngừa chống vài loại ung thư như ung thư vú và ung thư ruột già [42]

Cũng theo hãng tin AFP, các nhà khoa học Mỹ ñã ñưa ra và công bố kết luận về việc bổ sung acid béo omega 3 có thể giảm nguy cơ bị khối u nguy hiểm

ở những người dễ có nguy cơ mắc ung thư ruột ðể có ñược kết quả trên, họ ñã tiến hành thực nghiệm trên 55 người có nguy cơ nhiễm ung thư ruột cao Cụ thể,

28 người ñược chọn vào nhóm bổ sung 2 gam chất acid béo omega 3 mỗi ngày trong khi 27 người còn lại dùng giả dược Sau 6 tháng, số khối u ñã tăng lên khoảng 10% ở những người dùng giả dược và giảm 12% ở những người dùng viên bổ sung acid béo omega 3 Ngoài ra, kích cỡ khối u cũng tăng lên 17% ở nhóm dùng giả dược trong khi ñó, kích cỡ khối u lại giảm 12,5% ở những người dùng viên bổ sung acid béo omega 3 [40]

Tiến sĩ dược khoa Trần Việt Hưng cũng cho rằng, cả 2 acid béo omega 3

và omega 6 ñều có hoạt tính diệt bào ñối với các tế bào ung thư vú, phổi và tuyến nhiếp hộ, và không tác ñộng trên các tế bào bình thường Trên thực tế, các

acid béo chưa no loại có nhiều nối ñôi có hoạt tính diệt bào (in vitro) ít nhất là

ñối với 16 dòng tế bào ung thư nơi người lấy từ các cơ quan khác nhau [41]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Các loài vi tảo silic thuộc chi Chaetoceros ñược phân lập ở rừng ngập mặn

Xuân Thủy – Nam ðịnh

2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

ðịa ñiểm thu mẫu: rừng ngập mặn Xuân Thủy – Nam ðịnh

Thời gian tiến hành nghiên cứu: từ tháng 07/2009 tới tháng 06/2010 tại phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia

Hà Nội

Hình 2.1 Các ñiểm lấy mẫu ñược ñịnh vị trên bản ñồ

2.1.3 Hóa chất

NaH2PO4 Merk, ðức Mn_EDTA Merk, ðức

MgSO4 Merk, ðức VitaminB12,H,B1 Sigma, Mỹ

2.1.4 Máy móc và dụng cụ

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các máy móc, dụng cụ có tại phòng Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật và các phòng khác thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội:

- Kính hiển vi quang học (Olympus, Zeiss)

- Kính lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)

- Máy sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, HPLC 1100, ðức)

- Máy ly tâm Sigma, Mỹ

- Máy ño pH (Osi, Pháp)

- Máy nhân gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ)

- Máy Sequencer ABM Prism 3100-Avant (ABI, Mỹ)

- Chlorolab2, Hansatech Intruments Ltd., Anh

- Bộ ñiện di nằm (Bio-Rad, Mỹ)

2.1.5 Môi trường nuôi cấy

Trong nghiên cứu lựu chọn môi trường nuôi vi tảo, chúng tôi sử dụng các môi trường nuôi tảo có thể là môi trường nước biển tự nhiên, môi trường nhân tạo (nước cất, các chất dinh dưỡng bổ sung) như: F/2, ESM, ASW, Walne…

ñược trình bày trong phần Phụ lục 1 Nước biển ñể dùng pha các môi trường lấy

từ rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam ðịnh Chất lượng nước không thay ñổi trong các lần thí nghiệm

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Dụng cụ lấy mẫu: Vợt lấy mẫu, panh, kẹp, dao cạo…

Dụng cụ ñựng mẫu: Mẫu ñược ñể trong các chai, ống falcon có nắp nhựa

ñậy kín, có ghi rõ thời gian và ñịa ñiểm lấy mẫu

Cách lấy mẫu: Lấy mẫu cách mặt nước 20 cm, tầng này ñại diện cho tầng

hiếu khí

Cách thu mẫu nước: Tại ñiểm thu mẫu, cần tiến hành ño pH ðối với mẫu

ño hàm lượng oxy hòa tan, mẫu nước ñược lấy vào các chai nhựa PE 0.5 lít, mỗi

vị trí lấy 2 chai, một chai ñựng ñầy cố ñịnh mẫu ñể ño DO

Cố ñịnh mẫu: Dùng pipet 1 ml hút 1 ml MnSO4 và 1 ml dung dịch KI + KOH (Lắc ñều cho ñến khi có xuất hiện kết tủa bông)

Bảo quản mẫu: Trong quá trình vận chuyển từ Xuân Thủy, Nam ðịnh về

phòng thí nghiệm, mẫu ñược bảo quản trong hộp xốp chứa ñá, sau khi về ñược

bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ñộ 4oC tại phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, ðại học Quốc Gia Hà Nội

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi tảo biển

2.2.2.1 Làm giàu mẫu

Hút 1000 µl mẫu nước cho vào ống Eppendorf, ly tâm ở tốc ñộ 7000 vòng/phút trong 10 phút và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0,05% nhằm mục ñích giữ vững ñặc tính sinh lý của vi tảo Sau ñó hút 100 µl dịch huyền phù tảo cho vào nuôi cấy trong lọ Penicillin dung tích 20 ml chứa môi trường F/2 Nuôi giữ ở nhiệt ñộ phòng với ánh sáng ñèn neon với cường ñộ sáng là 10000-

20000 Lux theo quang chu kì là 10h chiếu sáng và 14h tối Sau thời gian 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát khả năng sinh trưởng của mẫu vi tảo ñã ñược làm giàu

bằng kính hiển vi quang học ở ñộ phóng ñại 400-1000 lần

2.2.2.2 Phương pháp tách và thuần khiết trên ñĩa thạch

Quá trình phân lập ñược tiến hành theo phương pháp của Shirai có cải tiến [13] Các vi tảo sau khi làm giàu ñược xác ñịnh dưới kính hiển vi quang học, qua quan sát hình thái và sự sinh trưởng của tảo thì tiến hành phân lập

Nhỏ 100 µl dịch mẫu vi tảo trên ñĩa thạch chứa môi trường F/2 có bổ sung khoáng và vitamin Sau 5-7 ngày nuôi ở nhiệt ñộ phòng với cường ñộ sáng là 10000-20000 Lux theo quang chu kì là 10h chiếu sáng và 14h tối Khuẩn lạc sẽ phát triển trên ñĩa thạch

Sau ñó các khuẩn lạc ñược tách riêng rẽ và quan sát dưới kính lúp Olympus Các khuẩn lạc thuần khiết ñược cấy truyền sang ống thạch nghiêng và bảo quản ở 4°C ñược dùng trong các nghiên cứu tiếp theo

2.2.3 Phương pháp xác ñịnh khả năng sinh trưởng của vi tảo biển

ðể xác ñịnh khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo nghiên cứu, chúng tôi

tiến hành nuôi trực tiếp vi tảo trên các môi trường ñược trình bày trong Phụ lục

1, sau ñó tiến hành ñếm tế bào ñịnh kì 2 ngày/lần trên các môi trường nuôi cấy

ñể tìm ra thời gian sinh trưởng tối ña và môi trường nuôi cấy tối ưu nhất

• Phương pháp ñếm tế bào bằng buồng ñếm Neubauer

Cấu tạo buồng ñếm Neubauer:

Buồng ñếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3 mm, ñược chia làm ba phần Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh dọc Phần giữa ñược chia ñôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0,1 mm, tạo ra hai ngăn ñếm giống nhau Mỗi ngăn ñếm hình vuông, ñược chia thành 16 ô lớn, mỗi

ô lớn lại chia thành 16 ô nhỏ Vậy tổng số ô nhỏ trong một ngăn ñếm là 16×16=256 ô nhỏ

Mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm², và chiều cao là 1/10 mm

Như vậy thể tích mỗi ô là: 1/400×1/10 = 25× mm³

Thể tích một ngăn ñếm là: 25× ×256 = 64× mm³ = 64× ml

Mật ñộ tế bào ñược tính theo công thức: D = (a/64) ×

Trong ñó: D: mật ñộ tế bào (số tế bào/ml)

a: số tế bào trung bình trong một buồng ñếm

Thao tác ñếm và lập ñường cong sinh trưởng:

+ Buồng ñếm và lamen ñược lau sạch bằng cồn 70°, thấm khô trước khi cho dịch tảo vào Lamen ñược ñặt trên buồng ñếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy

sự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng ñếm và lamen Sau ñó dùng pipet Pasteur hút một ít dịch tảo ñã ñược lắc ñều và chấm vào cạnh của lamen Dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng ñếm

+ Buồng ñếm có chứa tảo ñược ñưa lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính

40, thị kính 10 ðối với những mẫu ñếm quá ñặc không thể ñếm chính xác ñược thì pha loãng trước khi ñếm và nhân hệ số pha loãng khi tính kết quả

Trên cơ sở dữ liệu thu ñược qua các ngày ñếm, lập ñường cong sinh trưởng bằng cách ñặt trên trục tung chỉ số mật ñộ tế bào, ñặt trên trục hoành chỉ

số thời gian (ngày) nuôi tảo

• Xác ñịnh môi trường thích hợp ñể nuôi vi tảo

Trong ñiều kiện tiến hành nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm

nuôi tảo thuộc chi Chaetoceros trong sáu môi trường nuôi cấy là: F/2, F/2 không

silic, ESM, Walne, BBM, ASW (môi trường nước biển nhân tạo) Dịch mẫu tảo

và dịch môi trường ở các môi trường nuôi cấy là ñồng nhất, dựa vào kết quả ñếm

tế bào ñể tìm ra môi trường nuôi cấy thích hợp: mật ñộ tế bào ở môi trường nào tốt nhất thì ñó là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo nghiên cứu

2.2.4 Phương pháp xác ñịnh ảnh hưởng của ñộ mặn tới tốc ñộ sinh trưởng

ðể xác ñịnh ñộ mặn tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi tảo chủng TC1, tiến hành nuôi vi tảo chủng TC1 trong môi trường F/2 có ñộ mặn lần lượt là:

0‰ 10‰ 20‰ 25‰ 30‰ 35‰ 40‰

ðo tốc ñộ sinh trưởng của vi tảo chủng TC1, sẽ xác ñịnh ñược mức ñộ thích nghi của vi tảo với các nồng ñộ muối và xác ñịnh ñược ñộ mặn tối ưu cho vi tảo chủng TC1 phát triển

2.2.5 Phương pháp phân loại vi tảo biển

2.2.5.1 Phương pháp hình thái học

Các chủng vi tảo biển sau khi ñược thuần khiết ñược quan sát dưới kính hiển vi quang học Zeiss ở ñộ phóng ñại 400 - 1000 lần ñể quan sát các ñặc ñiểm hình thái và kích thước tế bào của chúng ðể ñịnh loại chúng tôi sử dụng các tài liệu sau:

Khóa phân loại sinh vật phù du (plankton) miền Nam -Việt Nam [12]

Khóa phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam [6]

2.2.5.2 Phương pháp ñịnh loài bằng sinh học phân tử

*Phương pháp tách chiết DNA

Theo phương pháp của Giovannoni et al (1990) và có sự thay ñổi của Van Mooy et al (2004)

• Nguyên tắc:

Màng của tế bào vi tảo ñược phá vỡ bởi lyzozyme và các chất tẩy mạnh như: SDS-Tris-HCl giúp DNA ñược giải phóng Protein và RNA ñược tách khỏi DNA nhờ các enzyme xúc tác RNaza A, Proteaza K và các dung môi chloroform: isoamyl alcohol (24:1)

Cuối cùng DNA ñược tủa bằng etanol lạnh 100% và xác ñịnh nồng ñộ DNA trong dung dịch mẫu

• Hóa chất:

+ Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1)

+ Chloroform : isoamyl alcohol (24:1)

Na2EDTA, 0.15 NaCl) Sau ñó tạo dịch huyền phù trở lại trong 300 µl ñệm 10 x

TE (10 nM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, tỷ lệ mẫu : ñệm là 1 : 2) Sau ñó bổ sung tiếp 500 µl dịch pha tế bào (Triston-X100 2% (v/v), 1% SDS,100 mM NaCl, 1 mM EDTA 8.0, 10 mM Tris 8.0), và hạt thủy tinh (tỉ lệ 1 : 2 mg/v), trộn ñều cho tan Tiếp tục bổ sung choloroform : iso amyl alcohol (tỉ lệ 24 : 1, v/v) với thể tích bằng 1/3 thể tích mẫu, trộn ñều trong 5 - 10 phút bằng tay Cuối cùng

bổ sung protein K (Sigma, 20 mg/ml proteinase K trong 1/10xTE), ủ mẫu ở 56°C trong 10 - 15 phút Sự tan tế bào ñược xác ñịnh bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự tăng ñộ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước ñá 10 phút Tiếp theo, ly tâm mẫu ở 15000 vòng/phút trong 15 - 20 phút ñể phân lớp Sau ñó chuyển phần nhớt pha dầu sang Eppendof (cỡ 1.5 ml) mới và DNA ñược tách ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95.5% giữ ở 22°C) với thể tích gấp ñôi thể tích mẫu và 2 µl của 3M Na acetate (pH = 4.5) Ngâm DNA trong 100 µl ethanol 70% trong 30 phút và sau ñó ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho

mỗi nồng ñộ trong 5 phút Sợi DNA làm khô bằng nhiệt ñộ phòng trong 10 phút

và ñược làm tan trở lại trong 50 µl ñệm 0.1xTE (của 10xTE) ở 4°C qua ñêm

Dịch ñem phân tích bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260 và 280

nm DNA hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260 nm, ở bước sóng 280 nm chứng tỏ

sự có mặt của protein Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất ñệm, các muối như EDTA và của RNA Các tỉ lệ chuẩn về hấp thụ của DNA ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 0.1 : 0.45 : 0.515 Hàm lượng DNA ñược tính như sau: 1 ñơn vị OD (mật ñộ quang, Optical Durity) ở 260 nm tương ứng với 50 µl/mg DNA

• Cách tính:

ðơn vị mẫu × ñộ pha loãng × chỉ số/1000 = DNA µg/µl

Nếu DNA chưa sạch cần khử protein và RNA bằng enzyme proteaza K và RnazaA

* Chạy PRC và ñiện di

• Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR

Mồi cho phản ứng PCR ñoạn rDNA 18S:

+Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 94°C→ 1 phút, 50°C→ 1 phút, 72°C→ 90 giây Hết một chu kỳ

+Tổng hợp: 72°C→ 2 phút

+Kết thúc chương trình→ 4°C nhiệt ñộ bảo quản

+Kiểm tra sản phẩm PCR bằng ñiện di trên gel agaroza

+Pha ñệm: pha dung dịch ñệm 10 × TAE

O.5M EDTA.Na2 pH=8.0 100ml Pha với một lít

Trong quá trình chạy ñiện di dung dung dịch ñệm 1×TAE (của 10×TAE pha loãng dịch 10 trong 100 ml nước cất ñã khử trùng)

• ðổ gel

+Cân 0.8 – 1.2g agaroza cho vào 100 ml dung dịch ñệm 1×TAE, ñun sôi cho ñến khi agaroza tan hết

+Lắc ñều ñể nguội ñến 40 - 50°C

+ðổ gel vào khay ñã cài sẵn lược

+ðể 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và ñặt khay gel vào máy ñiện di

• Tra mẫu

+Dùng pipet hút 2 µl dung dịch DNA trộn với 2µl 6 × loading buffer

+Tra 1µl của 1kb DNA ladder (Takara) trộn với 2µl của 6 × loading buffer dùng như DNA chuẩn

+Tra mẫu vào từng giếng

• Chạy ñiện di

+Chạy ñiện di với dòng ñiện 100V trong thời gian 20 - 30 phút cho tới khi vạch màu ñến 2/3 bản gel

+Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad

Kết quả của DNA mới ñược nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình với những vạch ñỏ màu da cam

Kết quả sản phẩm PCR của mẫu ñược phân tích giải trình tự trên Sequencer ABM Prism 3100-Avant

Mồi cho xác ñịnh trình tự rDNA 18S:

Mồi xuôi 2F:(2-21) 5’-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’