*Phương pháp tách chiết DNA
Theo phương pháp của Giovannoni et al (1990) và có sự thay ựổi của Van Mooy et al (2004).
Ớ Nguyên tắc:
Màng của tế bào vi tảo ựược phá vỡ bởi lyzozyme và các chất tẩy mạnh như: SDS-Tris-HCl giúp DNA ựược giải phóng. Protein và RNA ựược tách khỏi DNA nhờ các enzyme xúc tác RNaza A, Proteaza K và các dung môi chloroform: isoamyl alcohol (24:1).
Cuối cùng DNA ựược tủa bằng etanol lạnh 100% và xác ựịnh nồng ựộ DNA trong dung dịch mẫụ
Ớ Hóa chất:
+ Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) + Chloroform : isoamyl alcohol (24:1)
+ Ethanol lạnh 100% và 70%
+ đệm phá tế bào: 40 mM EDTA, 50 mM Tris, 750 mM sucrose, pH=8.0 (Bảo quản ở 4oC trong 1 năm).
Ớ Tiến hành:
DNA ựược tách chiết từ sinh khối ướt. Lấy khoảng 5 Ờ 10 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm lạnh ở 40ồC với tốc ựộ 8000 - 9000 vòng/phút trong 15 phút và rửa hai lần bằng 300 ộl dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5M Na2EDTA, 0.15 NaCl). Sau ựó tạo dịch huyền phù trở lại trong 300 ộl ựệm 10 x TE (10 nM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, tỷ lệ mẫu : ựệm là 1 : 2). Sau ựó bổ sung tiếp 500 ộl dịch pha tế bào (Triston-X100 2% (v/v), 1% SDS,100 mM NaCl, 1 mM EDTA 8.0, 10 mM Tris 8.0), và hạt thủy tinh (tỉ lệ 1 : 2 mg/v), trộn ựều cho tan. Tiếp tục bổ sung choloroform : iso amyl alcohol (tỉ lệ 24 : 1, v/v) với thể tắch bằng 1/3 thể tắch mẫu, trộn ựều trong 5 - 10 phút bằng taỵ Cuối cùng bổ sung protein K (Sigma, 20 mg/ml proteinase K trong 1/10xTE), ủ mẫu ở 56ồC trong 10 - 15 phút. Sự tan tế bào ựược xác ựịnh bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự tăng ựộ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước ựá 10 phút. Tiếp theo, ly tâm mẫu ở 15000 vòng/phút trong 15 - 20 phút ựể phân lớp. Sau ựó chuyển phần nhớt pha dầu sang Eppendof (cỡ 1.5 ml) mới và DNA ựược tách ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95.5% giữ ở 22ồC) với thể tắch gấp ựôi thể tắch mẫu và 2 ộl của 3M Na acetate (pH = 4.5). Ngâm DNA trong 100 ộl ethanol 70% trong 30 phút và sau ựó ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho
mỗi nồng ựộ trong 5 phút. Sợi DNA làm khô bằng nhiệt ựộ phòng trong 10 phút và ựược làm tan trở lại trong 50 ộl ựệm 0.1xTE (của 10xTE) ở 4ồC qua ựêm.
Dịch ựem phân tắch bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260 và 280 nm. DNA hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260 nm, ở bước sóng 280 nm chứng tỏ sự có mặt của protein. Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất ựệm, các muối như EDTA và của RNẠ Các tỉ lệ chuẩn về hấp thụ của DNA ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 0.1 : 0.45 : 0.515. Hàm lượng DNA ựược tắnh như sau: 1 ựơn vị OD (mật ựộ quang, Optical Durity) ở 260 nm tương ứng với 50 ộl/mg DNẠ
Ớ Cách tắnh:
đơn vị mẫu ừ ựộ pha loãng ừ chỉ số/1000 = DNA ộg/ộl
Nếu DNA chưa sạch cần khử protein và RNA bằng enzyme proteaza K và RnazaẠ
* Chạy PRC và ựiện di
Ớ Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Mồi cho phản ứng PCR ựoạn rDNA 18S:
Mồi xuôi 2F:(2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ Hoặc 1315 F 5Ỗ-CGATAAGGAACGAGACCTT-3Ỗ Mồi ngược 1794R:(1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ
Ớ Chương trình chạy PCR
+Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 94ồC→ 1 phút, 50ồC→ 1 phút, 72ồC→ 90 giâỵ Hết một chu kỳ.
+Tổng hợp: 72ồC→ 2 phút.
+Kết thúc chương trình→ 4ồC nhiệt ựộ bảo quản.
+Kiểm tra sản phẩm PCR bằng ựiện di trên gel agarozạ +Pha ựệm: pha dung dịch ựệm 10 ừ TAE
Tris 242g Acid axetic 57.1 ml
Ọ5M EDTẠNa2 pH=8.0 100ml Pha với một lắt Trong quá trình chạy ựiện di dung dung dịch ựệm 1ừTAE (của 10ừTAE pha loãng dịch 10 trong 100 ml nước cất ựã khử trùng).
Ớ đổ gel
+Cân 0.8 Ờ 1.2g agaroza cho vào 100 ml dung dịch ựệm 1ừTAE, ựun sôi cho ựến khi agaroza tan hết.
+Lắc ựều ựể nguội ựến 40 - 50ồC. +đổ gel vào khay ựã cài sẵn lược.
+để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và ựặt khay gel vào máy ựiện dị
Ớ Tra mẫu
+Dùng pipet hút 2 ộl dung dịch DNA trộn với 2ộl 6 ừ loading buffer.
+Tra 1ộl của 1kb DNA lađer (Takara) trộn với 2ộl của 6 ừ loading buffer dùng như DNA chuẩn.
+Tra mẫu vào từng giếng.
Ớ Chạy ựiện di
+Chạy ựiện di với dòng ựiện 100V trong thời gian 20 - 30 phút cho tới khi vạch màu ựến 2/3 bản gel.
+Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad.
Kết quả của DNA mới ựược nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình với những vạch ựỏ màu da cam.
Kết quả sản phẩm PCR của mẫu ựược phân tắch giải trình tự trên Sequencer ABM Prism 3100-Avant.
Mồi cho xác ựịnh trình tự rDNA 18S:
Mồi xuôi 2F:(2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ 404 F:(404-423) 5Ỗ-GCTACCACATCCAAGGAAGG-3Ỗ 934 F:(934-945) 5Ỗ-CTGCGAAAGCATTTGCCAAGG-3Ỗ 1315 F:(1315-1333) 5Ỗ-CGATAACGAACGAGACCTT-3Ỗ
Mồi ngược U1:(586-563) 5Ỗ-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACC-3Ỗ U2:(1148-1124) 5Ỗ-CCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCC-3Ỗ U3:(1643-1619) 5Ỗ-GACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAG-3Ỗ 1794R:(1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ