giảm mạnh ngay ngày nuôi cấy thử 2 và không xuất hiện sau ngày nuôi cấy thứ 4 của quá trình thắ nghiệm.
Qua các kết quả trên (ựược thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.4) môi trường ASW ựược chọn là môi trường dinh dưỡng tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo chủng TC1. Do ASW là môi trường nước biển nhân tạo (nước muối), hàm lượng các chất dinh dưỡng trong muối không ựầy ựủ bằng nước biển tự nhiên nhưng ựiều ựó lại hoàn toàn thắch ứng với sự thay ựổi của khu hệ rừng ngập mặn dưới các ựiều kiện khác nhaụ Chứng tỏ vi tảo chủng TC1 có sự thắch nghi cao khi các ựiều kiện thay ựổi, ựiều ựó mở ra tiềm năng trong ứng dụng nuôi sinh khối lớn làm thức ăn cho nuôi trồng thủy sản.
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA đỘ MẶN LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI TẢO CHỦNG TC1 CHỦNG TC1
Các loài vi tảo rất nhạy cảm với sự thay ựổi ựộ mặn. Khi nồng ựộ muối của môi trường giảm xuống quá thấp hay tăng lên quá cao sẽ ức chế các quá trình quang hợp. Mỗi loài vi tảo có biên ựộ chịu mặn khác nhau : có loài rộng muối có loài hẹp muối, có loài có khả năng thắch nghi ựộ mặn cao có loài khả năng thắch nghi ựộ mặn thấp. để xác ựịnh khoảng ựộ mặn tố ưu cho nuôi sinh khối vi tảo chủng TC1 thắ nghiệm ựược thực hiện với thang ựộ mặn : 0Ẹ, 10Ẹ, 20Ẹ, 25Ẹ, 30Ẹ, 35Ẹ, 40Ẹ. Môi trường nuôi cấy là môi trường ASW với mật ựộ ban ựầu là 1x106 tb/ml. Các ựiều kiện nuôi dưỡng là ựồng ựều nhaụ Cứ sau hai ngày tiến hành lấy mẫu ựể kiểm tra một lần. Kết quả thu ựược trình bầy trong bảng 3.2 và
Bảng 3.2. Mật ựộ tế bào chủng TC1 trên môi trường ASW với ựộ mặn khác nhau Số lượng tế bào (x106/ml) Ngày 0 Ẹ 10Ẹ 20Ẹ 25Ẹ 30Ẹ 35Ẹ 40Ẹ 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 3.03 3.16 4.77 3.78 3.17 2.11 5 0.7 7.06 8.24 15.45 10.42 9.72 3.01 7 0.3 18.03 21.3 35.3 28.93 24.5 8 9 0 14.1 16.98 27.06 23.71 19.88 4.99
Từ biểu ựồ hình 3.5, nhận thấy vi tảo chủng TC1 phát triển tốt ở ựộ mặn từ 10Ẹ-40Ẹ. Chứng tỏ vi tảo chủng TC1 là có tắnh rộng muối, tại môi trường có ựộ mặn bằng 0, nhận thấy sự sinh trưởng của tảo giảm sút nhanh chóng (ở ngày nuôi cấy thứ 5 của quá trình thắ nghiệm, mật ựộ tế bào vi tảo chủng TC1 giảm xuống còn 0.7 x106 tb/ml và không thấy xuất hiện ở ngày nuôi cấy thứ 9 của quá trình thắ nghiệm.
Ở môi trường có ựộ mặn 25Ẹ, từ ngày nuôi cấy thứ 5 trở ựi chủng phát triển tốt nhất, ựến ngày nuôi cấy thứ 7 ựạt mật ựộ 35.5 x106 tb/ml, cao hơn gấp hai lần so với mật ựộ tế bào trong nồng ựộ muối 10Ẹ, gấp 1.5 lần so với mật ựộ tế bào trong môi trường có nồng ựộ muối 20Ẹ và 35Ẹ. Dải ựộ mặn thắch hợp nhất cho quá trình sinh trưởng của vi tảo chủng TC1 là 25 Ờ 30Ẹ. Ở ngày nuôi cấy thứ 7 của quá trình thắ nghiệm, mật ựộ tế bào trong môi trường có nồng ựộ muối 25Ẹ và 30Ẹ lần lượt là 35.3x106/ml và 28.93x106/ml.
độ mặn nước biển của khu hệ rừng ngập mặn Xuân Thủy biến thiên nhiều phụ thuộc vào pha của thuỷ văn và chế ựộ lũ của Sông Hồng. Vào mùa ựông ựộ mặn trung bình của nước biển tương ựối ựồng nhất trong khoảng 28 - 30Ẹ. Vào mùa hè, ựộ mặn trung bình thấp hơn mùa ựông, dao ựộng trong khoảng 20 - 27 Ẹ. Mức ựộ dao ựộng ựộ mặn cao nhất tại rừng ngập mặn là 30Ẹ, ựiều này phù hợp với kết quả thắ nghiệm tại dải ựộ mặn 35 - 40Ẹ, khả năng sinh trưởng của vi tảo ở môi trường có nồng ựộ muối 35 - 40Ẹ giảm, mật ựộ tế bào của vi tảo ở môi trường này giảm từ 0.3 lần (ở ựộ mặn 35Ẹ) ựến 3.5 lần (ở ựộ mặn 40Ẹ) so với mật ựộ tế bào tại ựộ mặn 25Ẹ. Nhưng tại ựộ mặn 40Ẹ của môi trường vi tảo vẫn sinh trưởng với mật ựộ 8x106 tb/ml, cho thấy khả năng chống chịu của chủng vi tảo TC1 khi pH môi trường tăng cao ựo ựược tại nồng ựộ muối này là 9.12 Ờ 9.5.
để thu ựược lượng sinh khối lớn trong thời gian ngắn mà vẫn ựảm bảo ựộ thuần khiết của chủng vi tảo, nhằm phục vụ cho các thắ nghiệm tiếp theo, tiến hành nhân nuôi và thu sinh khối tuần tự theo quy trình như sau:
Mẫu giống (bảo quản trong lọ thạch nghiêng)
↓ Cấy chuyển Lọ Penicillin ↓ Cấy chuyển Bình tam giác 250 ml ↓ Cấy giống Bình tam giác 500 ml ↓ Cấy giống
Tăng sinh khối bình nhỏ (2 lắt)
↓ Bổ sung môi trường, cấy chuyển
Tăng sinh khối bình 5 lắt (nuôi sục khắ 24/24)
↓ Bổ sung môi trường, cấy chuyển
Tăng sinh khối trong bình 20 lắt (nuôi sục khắ 24/24)
↓ Làm lắng
Hình 3.6. Nuôi sinh khối vi tảo trong bình 5 lắt có sục khắ 24/24 và chiếu sáng Chúng tôi thu sinh khối vi tảo vào giai ựoạn sớm của pha cân bằng. Lượng sinh khối vi tảo tươi ựược sử lý qua quá trình chiết vi tảo, thu ựược cặn chiết sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theọ
3.5. PHÂN LOẠI VI TẢO CHỦNG TC1 đà TUYỂN CHỌN
3.5.1. Phân loại theo hình thái học
Sử dụng một số ựặc ựiểm hình thái của chủng vi tảo ựể bước ựầu xác ựịnh tên và vị trắ của chủng. Các hình thái này ựược phát hiện căn cứ vào khả năng phát triển của vi tảo cần ựược nghiên cứu trên môi trường chuẩn ựoán ựã ựược thừa nhận hiện nay và sử dụng các phương pháp soi kắnh hiển vi quang học.
Hình 3.7. Hình ảnh vi tảo chủng TC1 trên kắnh hiển vi quang học Olympus CX41
Quan sát trên kắnh hiển vi quang học, có thể thấy vi tảo chủng TC1 có những ựặc ựiểm sau: tế bào nhỏ, thường sống ựơn lẻ, ựôi khi cũng nối thành chuỗi 2, 3 tế bàọ Mặt vỏ tế bào hình bầu dục, gần tròn hơi lồi lên. Mặt vòng vỏ rộng, hình chữ nhật hoặc gần vuông, không thấy ựai nốị Lông gai nhỏ, dài và thẳng mọc ngay mép mặt vỏ và vươn ra gần song song với mặt phẳng vỏ. Mỗi tế bào có một thể sắc tố hình hạt hoặc hình tròn. Từ các ựặc ựiểm hình thái trên, bước ựầu có thể xác ựịnh ựược vi tảo chủng TC1 thuộc :
Ngành: Bacillariophyta
Lớp: Coscinodiscophyceae Bộ: Chaetocerotales
Họ: Chaetocerotaceae Chi: Chaetoceros
3.5.2. Phân loại dựa theo sinh học phân tử
Ở ựây ngoài phân loại vi tảo chủng TC1 bằng phương pháp truyền thống dựa trên các ựặc ựiểm hình thái, nuôi cấy, ựặc ựiểm sinh lý, ựể xác ựịnh rõ vi tảo chủng TC1 thuộc loài nào của chi Chaetoceros, tiến hành phân loại theo phương pháp sinh học phân tử dựa trên phân tắch giải trình tự rDNA 18S. đây không phải là một công việc ựơn giản và máy tắnh sẽ giúp ta hoàn toàn các tắnh toán cần thiết ựể tối thiểu hóa số khoảng trống và các lỗi bắt cặp sai của các trật tự ựược so sánh.
Kết quả giải trình tự các ựoạn sản phẩm PCR, thu ựược ựoạn trình tự dài 652 bp. Kết quả so sánh trên ngân hàng dữ liệu NCBI với công cụ BLASTn cho thấy ựoạn trình tự của vi tảo chủng TC1 tương ựồng 98% với chủng vi tảo
Chaetoceros muelleri ký hiệu AY485453.
Dưới ựây là trình tự ựoạn DNA ribosom 18S của vi tảo chủng TC1
Chaetoceros muelleri AAATCCCTTATCGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGC TCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTGTGGTGTGACT GATCGGTCCGACCTTTGGTGGGTACTCGATCTTGTCACGCCATCCTTGAGTGGTTCGCTCTGG CATTAAGTTGTCGGGGCGGCAGCCGCTCATCGTTTACTGTGAGAAAATGTGTTCAAAGCAGGC TTATGCCGTTGAATATACTAGCATGGAATAATAAGATAGGACCTCGGTACTATTTTGTTGGTT TGAGAACCAAGGTAATGATCAATAGGGACAGTTGGGGGTATTCGTATTCAGTTGTCAGAGGTG AAATTCTTAGATTTACGGAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTACCAAGGATGTTTTCTAATC AAGAACGAAAGTATGGGGATCGATGATTAGATACCATCGTAGTCTATACCATAAACTATGCCG ACTCAGGATGGGCGGGTGCCACTCTGGCCTCGTCTGCACTGTATGAGAAATCAAAGTCTTTGG GTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGA GTGGAACCTGCGGCTTAATTTG
Như vậy, có thể khẳng ựịnh rằng chủng vi tảo TC1 ựã tuyển chọn và phân lập ựược là chủng Chaetoceros muelleri.
3.6. XÁC đỊNH THÀNH PHẦN ACID BÉO CỦA VI TẢO Chaetoceros
muelleri TC1
Các acid béo tồn tại chủ yếu trên màng tế bào và ựây cũng là một ựặc ựiểm ựể phân loại vi tảọ Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phân tắch thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 và thu ựược kết quả trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1
STT Acid béo Danh pháp Tên thường gọi
Tỷ lệ % (% tổng số
acid béo)
1 14:0 Tetradecanoic acid Myristic 1.910 2 14:1n-5 9-Tetradecenoic acid Myristolenic acid 18.086 3 15:0 Pentadecanoic acid Convolvulinolic 0.745 4 15:1n-5 Pentadecenoic acid Hormelic 0.096 5 16:0 Hesadecanoic acid Palmitic 5.532 6 16:1n-7 9-hesadecenoic acid Palmitoleic 15.232 7 16:1n-9 11-hesadecenoic acid Ambrettolic 2.200 8 17:0 Heptadecanoic acid Margric 9.519 9 18:0 Octadecanoic acid Stearic 1.462
STT Acid béo Danh pháp Tên thường gọi
Tỷ lệ % (% tổng số
acid béo)
10 18:1n-7 11- octadecenoic acid Asclepic 3.744
11 18:2n-6-c 2.703
12 18:3n-6
6,9,12-
Octadecatrienoic acid γ-Linolenic acid 1.122
13 18:4n-3
Octadecatetraenoic
acid Moroctic acid 0.216
14 20:0 Eicosanoic acid Arachidic 1.048 15 20:1n-9 11-Eicosaenoic acid Eicosenoic acid 0.256
16 20:1n-7 0.099 17 20:4n-6 5,8,11,14- eicosatetraenoic acid Arachidonic acid (AA) 7.845 18 20:5n-3 5,8,11,14,17- Eicosapentaenoic acid Eicosapentaenoic acid (EPA) 24.759
19 24:0 Tetracosanoic acid Lignoceric 0.121
Qua kết quả phân tắch thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 ựược thể hiện ở bảng 3.3, nhận thấy tỉ lệ acid béo trong vi tảo
19 loại acid béo, bao gồm 7 loại acid béo no và 12 loại acid béo không nọ Trong ựó, tỉ lệ acid béo không no rất cao, chiếm 76.358% tổng số acid béo trong vi tảo
Chaetoceros muelleri TC1. Tỉ lệ EPA và AA cao (EPA chiếm 24.759% còn AA chiếm 7.845% tổng số acid béo có trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1) thể hiện ựặc tắnh phổ biến của tảo silic [8,9].
Tỉ lệ eicosapentaenoic acid (20:5n-3) trong vi tảo Chaetoceros muelleri
TC1 cao nhất trong tổng số các loại acid béo: eicosapentaenoic acid chiếm 24.759% tổng số acib béo; tiếp ựó ựến myristolenic acid (14:1n-5) với tỉ lệ là 18.086% và palmitoleic (16:1n-7) là 15.232%. Các acid béo ựạt tỉ lệ cao tiếp theo lần lượt là margric (17:0), arachidonic acid (20:4n-6) và asclepic (18:1n-7) với tỉ lệ lần lượt là 9.519%, 7.845% và 3.744% tổng số acid béo trong vi tảo
Chaetoceros muelleri TC1.
Tỉ lệ EPA và AA khá cao (EPA chiếm 24.759%, AA chiếm 7.845%) có trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 có ảnh hưởng rất lớn tới hoạt tắnh của chủng. đây là tiền chất trong sinh tổng hợp các chất như các hormone bao gồm: prostaglandin, thrombosane, và leukotrienẹ Kết quả thành phần các acid béo ựược thể hiện rõ hơn trên sắc ký ựồ sau:
Hình 3.8. Sắc ký ựồ thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 Vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 chứa tỉ lệ acid béo chưa no rất cao, cao nhiều hơn các vi tảo silic khác. Có thể nhận thấy khi so sánh kết quả phân tắch thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 với kết quả phân tắch của các loài tảo silic khác. Bảng 3.4 thể hiện kết quả so sánh giữa thành phần acid béo của vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 với vi tảo Amphiprora alata ựể thấy rõ ựiều ựó.
Bảng 3.4. Kết quả so sánh tỉ lệ acid béo trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 và tỉ lệ acid béo trong vi tảo Amphiprora alata
STT Acid béo Chaetoceros muelleri TC1
(% tổng số acid) Amphiprora alata (% tổng số acid) 1 12:0 - 0.643 2 14:0 1.910 13.260 3 14:1n-5 18.086 - 4 15:0 0.745 1.104 5 15:1n-5 0.096 0.396 6 16:0 5.532 14.307 7 16:1n-7 15.232 13.151 8 16:1n-9 2.200 4.469 9 17:0 9.519 5.009 10 17:1n-7 - 0.821 11 18:0 1.462 4.152 12 18:1n-7 3.744 4.652 13 19:0 - 0.923 14 18:5n-3 - 0.573
STT Acid béo Chaetoceros muelleri TC1 (% tổng số acid) Amphiprora alata (% tổng số acid) 15 18:4n-3 0.216 0.594 16 18:2n-6-c 2.703 - 17 18:3n-6 1.122 - 18 20:0 1.048 2.207 19 20:1n-7 0.099 - 20 20:1n-9 0.256 1.496 21 20:4n-6 7.845 7.962 22 20:5n-3 24.759 9.192 23 22:5n-6 - 3.655 24 24:0 0.121 2.831 25 22:6n-3 - 5.249
Ghi chú: (-) là không xuất hiện
Qua bảng 3.4 nhận thấy tỉ lệ acid béo chưa no ở vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 cao hơn nhiều so với tỉ lệ acid béo chưa no ở vi tảo Amphiprora alata, còn tỉ lệ acid béo no ở vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 lại thấp hơn ở vi tảo Amphiprora alata :
+ Tỉ lệ acid béo chưa no ở vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 chiếm 76.358% tổng số acid béo trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1, trong khi ở vi
tảo Amphiprora alata, acid béo chưa no chỉ chiếm 52.21% tổng số acid béo thu ựược trong vi tảo Amphiprora alatạ
+ Tỉ lệ EPA trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 cao hơn rất nhiều so với tỉ lệ EPA trong vi tảo Amphiprora alata. Trong tổng số acid béo thu ựược từ vi tảo Chaetoceros muelleri TC1, có tới 24.759% tổng số acid béo, trong khi EPA chỉ chiếm 9.192% tổng số acid béo thu ựược từ vi tảo Amphiprora alata.
+ Tỉ lệ palmitoleic trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 cũng cao hơn tỉ lệ palmitoleic trong vi tảo Amphiprora alata. Palmitoleic chiếm 15.232% tổng số acid béo trong vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 trong khi chỉ chiếm 13.151% tổng số acid béo trong vi tảo Amphiprora alatạ
+ Hay như với myristolenic acid, tỉ lệ myristolenic acid chiếm 18.086% tổng số acid béo thu ựược từ vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 trong khi ựó, ở vi tảo Amphiprora alata lại không chứa loại acid béo chưa no quan trọng nàỵ
Nhận thấy kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nhiều nhận ựịnh trước ựó, vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 chứa rất nhiều EPA (trên 24%). Với tỉ lệ acid béo không no cần thiết, hay tỉ lệ EPA và AA cao (EPA chiếm 24.759%, AA chiếm 7.845%) hơn với các chủng tảo silic khác, cho thấy vi tảo
Chaetoceros muelleri TC1có tiềm năng ứng dụng ựể kháng tế bào ung thư. Bên cạnh ựó, với hàm lượng các acid béo chưa no cao, vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 còn có tiềm năng ựể ứng dụng vào nuôi trồng thủy sản, làm tăng chất lượng con giống.
3.7. XÁC đỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ
Qua những nghiên cứu ứng dụng thực tiễn thấy rằng những hợp chất sinh học có trong vi tảo silic ựã có những ựóng góp ựáng kể trong ựời sống của con
ngườị Chúng giúp tăng cường trắ tuệ, tăng sức ựề kháng, cải thiện hệ miễn dịch của con ngườị Chúng có khả năng sửa chữa tế bào bị tổn thương và tái tạo tế bào mới, chống lão hóa tế bào và làm chậm quá trình lão hóạ đặc biệt là khả năng chữa và tiêu diệt một số tế bào của bệnh ung thư như ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư ruột, ung thư tủyẦ của con ngườị
Sinh khối vi tảo tươi ựược chiết trong dung môi methanol/ chloroform (1:1, v/v) ựem cô quay chân không thu cặn chiết khô ựem thực hiện phép thử hoạt tắnh sinh học diệt và ức chế tế bào ung thư biểu mô miệng (KB). Kết quả ựo ựược ở các bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometer Genios TECAN và tắnh toán, các mẫu ựo có nồng ựộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) nhỏ hơn 128 ộg/ml có tác dụng phòng và ựiều trị ung thư ở mức tế bàọ Kết quả thu ựược ựược trình bày ở bảng 3.5 và hình3.9.
Bảng 3.5. Kết quả thử khả năng kháng tế bào ung thư biểu mô
STT Tên loài IC50 (ộộộộg/ml) 1 Amphiprora alata 84.17 2 Ankistrodesmus gracilis 26.50 3 Chaetoceros muelleri 67.24 4 Chlorella vulgaris 78.98 5 Gyrosigma limosum > 128 6 Melosira nummuloides > 128 7 Navicula radiosa > 128
STT Tên loài IC50 (ộộộộg/ml) 8 Navicula tuscula > 128 9 Scenedesmus sp. > 128 10 Scenedesmus quadricauda > 128 (a) (b)
Hình 3.9. Mật ựộ tế bào ung thư biểu mô sau thử nghiệm (a) Mẫu ựối chứng
(b) Mẫu thử nghiệm với cặn chiết Chaetoceros muelleri TC1
Kết quả hình 3.9, quan sát tế bào ung thư biểu mô miệng của mẫu ựối chứng và mẫu sau khi thử nghiệm bằng cặn chiết Chaetoceros muelleri TC1,
trong vòng 76h, có khả năng ức chế tế bào khá rõ rệt, tế bào ung thư biểu mô
miệng mất khả năng liên kết, tế bào không còn khả năng tăng sinh và bị phá vỡ, số lượng tế bào giảm ựáng kể. Cặn chiết vi tảo Chaetoceros muelleri TC1 có tác
dụng ức chế khả năng tăng sinh tế bào ung thư biểu mô miệng trên mô hình thực nghiệm, với nồng ựộ ức chế 50% lượng tế bào ung thư biểu mô (IC50) của vi tảo