Các loài vi tảo silic thuộc chi Chaetoceros ựược phân lập ở rừng ngập mặn Xuân Thủy Ờ Nam định.
2.1.2. địa ựiểm và thời gian tiến hành nghiên cứu
địa ựiểm thu mẫu: rừng ngập mặn Xuân Thủy Ờ Nam định.
Thời gian tiến hành nghiên cứu: từ tháng 07/2009 tới tháng 06/2010 tại phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, đại học Quốc Gia Hà Nộị
2.1.3. Hóa chất
Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ NaHCO3 Merk, đức Fe_EDTA Sigma, Mỹ NaH2PO4 Merk, đức Mn_EDTA Merk, đức NaNO3 Merk, đức Na2_EDTA Merk, đức Na2SiO3 Merk, đức CoSO4 Sigma, Mỹ KNO3 Merk, đức ZnSO4 Merk, đức MgSO4 Merk, đức VitaminB12,H,B1 Sigma, Mỹ
2.1.4. Máy móc và dụng cụ
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi sử dụng các máy móc, dụng cụ có tại phòng Sinh học tảo, Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật và các phòng khác thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, đại học Quốc Gia Hà Nội:
- Kắnh hiển vi quang học (Olympus, Zeiss)
- Kắnh lúp quan sát khuẩn lạc (Olympus, Nhật Bản)
- Máy sắc ký lỏng cao áp (High Performance Liquid Chromatography, HPLC 1100, đức)
- Máy ly tâm Sigma, Mỹ - Máy ựo pH (Osi, Pháp)
- Máy nhân gen Amp PCR System 9700 (ABI, Mỹ) - Máy Sequencer ABM Prism 3100-Avant (ABI, Mỹ) - Chlorolab2, Hansatech Intruments Ltd., Anh
- Bộ ựiện di nằm (Bio-Rad, Mỹ)
2.1.5. Môi trường nuôi cấy
Trong nghiên cứu lựu chọn môi trường nuôi vi tảo, chúng tôi sử dụng các môi trường nuôi tảo có thể là môi trường nước biển tự nhiên, môi trường nhân tạo (nước cất, các chất dinh dưỡng bổ sung) như: F/2, ESM, ASW, WalneẦ ựược trình bày trong phần Phụ lục 1. Nước biển ựể dùng pha các môi trường lấy từ rừng ngập mặn Xuân Thủy - Nam định. Chất lượng nước không thay ựổi trong các lần thắ nghiệm.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Dụng cụ lấy mẫu: Vợt lấy mẫu, panh, kẹp, dao cạoẦ
Dụng cụ ựựng mẫu: Mẫu ựược ựể trong các chai, ống falcon có nắp nhựa ựậy kắn, có ghi rõ thời gian và ựịa ựiểm lấy mẫụ
Cách lấy mẫu: Lấy mẫu cách mặt nước 20 cm, tầng này ựại diện cho tầng hiếu khắ.
Cách thu mẫu nước: Tại ựiểm thu mẫu, cần tiến hành ựo pH. đối với mẫu ựo hàm lượng oxy hòa tan, mẫu nước ựược lấy vào các chai nhựa PE 0.5 lắt, mỗi vị trắ lấy 2 chai, một chai ựựng ựầy cố ựịnh mẫu ựể ựo DỌ
Cố ựịnh mẫu: Dùng pipet 1 ml hút 1 ml MnSO4 và 1 ml dung dịch KI + KOH (Lắc ựều cho ựến khi có xuất hiện kết tủa bông).
Bảo quản mẫu: Trong quá trình vận chuyển từ Xuân Thủy, Nam định về phòng thắ nghiệm, mẫu ựược bảo quản trong hộp xốp chứa ựá, sau khi về ựược
bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ 4oC tại phòng Sinh học tảo, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, đại học Quốc Gia Hà Nộị
2.2.2. Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi tảo biển
2.2.2.1. Làm giàu mẫu
Hút 1000 ộl mẫu nước cho vào ống Eppendorf, ly tâm ở tốc ựộ 7000 vòng/phút trong 10 phút và rửa 2 lần với dung dịch muối sinh lý 0,05% nhằm mục ựắch giữ vững ựặc tắnh sinh lý của vi tảọ Sau ựó hút 100 ộl dịch huyền phù tảo cho vào nuôi cấy trong lọ Penicillin dung tắch 20 ml chứa môi trường F/2. Nuôi giữ ở nhiệt ựộ phòng với ánh sáng ựèn neon với cường ựộ sáng là 10000- 20000 Lux theo quang chu kì là 10h chiếu sáng và 14h tốị Sau thời gian 5-7 ngày nuôi cấy, quan sát khả năng sinh trưởng của mẫu vi tảo ựã ựược làm giàu bằng kắnh hiển vi quang học ở ựộ phóng ựại 400-1000 lần.
2.2.2.2. Phương pháp tách và thuần khiết trên ựĩa thạch
Quá trình phân lập ựược tiến hành theo phương pháp của Shirai có cải tiến [13]. Các vi tảo sau khi làm giàu ựược xác ựịnh dưới kắnh hiển vi quang học, qua quan sát hình thái và sự sinh trưởng của tảo thì tiến hành phân lập.
Nhỏ 100 ộl dịch mẫu vi tảo trên ựĩa thạch chứa môi trường F/2 có bổ sung khoáng và vitamin. Sau 5-7 ngày nuôi ở nhiệt ựộ phòng với cường ựộ sáng là 10000-20000 Lux theo quang chu kì là 10h chiếu sáng và 14h tốị Khuẩn lạc sẽ phát triển trên ựĩa thạch.
Sau ựó các khuẩn lạc ựược tách riêng rẽ và quan sát dưới kắnh lúp Olympus. Các khuẩn lạc thuần khiết ựược cấy truyền sang ống thạch nghiêng và bảo quản ở 4ồC ựược dùng trong các nghiên cứu tiếp theọ
2.2.3. Phương pháp xác ựịnh khả năng sinh trưởng của vi tảo biển
để xác ựịnh khả năng sinh trưởng của các loài vi tảo nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nuôi trực tiếp vi tảo trên các môi trường ựược trình bày trong Phụ lục 1, sau ựó tiến hành ựếm tế bào ựịnh kì 2 ngày/lần trên các môi trường nuôi cấy ựể tìm ra thời gian sinh trưởng tối ựa và môi trường nuôi cấy tối ưu nhất.
Ớ Phương pháp ựếm tế bào bằng buồng ựếm Neubauer
Cấu tạo buồng ựếm Neubauer:
Buồng ựếm Neubauer là một tấm thủy tinh dày khoảng 3 mm, ựược chia làm ba phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh dọc. Phần giữa ựược chia ựôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0,1 mm, tạo ra hai ngăn ựếm giống nhaụ Mỗi ngăn ựếm hình vuông, ựược chia thành 16 ô lớn, mỗi ô lớn lại chia thành 16 ô nhỏ. Vậy tổng số ô nhỏ trong một ngăn ựếm là 16ừ16=256 ô nhỏ.
Mỗi ô nhỏ có diện tắch là 1/400 mmỗ, và chiều cao là 1/10 mm. Như vậy thể tắch mỗi ô là: 1/400ừ1/10 = 25ừ mmỠ
Thể tắch một ngăn ựếm là: 25ừ ừ256 = 64ừ mmỠ = 64ừ ml
Mật ựộ tế bào ựược tắnh theo công thức: D = (a/64) ừ Trong ựó: D: mật ựộ tế bào (số tế bào/ml)
a: số tế bào trung bình trong một buồng ựếm
+ Buồng ựếm và lamen ựược lau sạch bằng cồn 70ồ, thấm khô trước khi cho dịch tảo vàọ Lamen ựược ựặt trên buồng ựếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy sự giao thoa ánh sáng ở vị trắ tiếp xúc giữa buồng ựếm và lamen. Sau ựó dùng pipet Pasteur hút một ắt dịch tảo ựã ựược lắc ựều và chấm vào cạnh của lamen. Dịch tảo sẽ tràn láng vào buồng ựếm.
+ Buồng ựếm có chứa tảo ựược ựưa lên kắnh hiển vi và quan sát ở vật kắnh 40, thị kắnh 10. đối với những mẫu ựếm quá ựặc không thể ựếm chắnh xác ựược thì pha loãng trước khi ựếm và nhân hệ số pha loãng khi tắnh kết quả.
Trên cơ sở dữ liệu thu ựược qua các ngày ựếm, lập ựường cong sinh trưởng bằng cách ựặt trên trục tung chỉ số mật ựộ tế bào, ựặt trên trục hoành chỉ số thời gian (ngày) nuôi tảọ
Ớ Xác ựịnh môi trường thắch hợp ựể nuôi vi tảo
Trong ựiều kiện tiến hành nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm nuôi tảo thuộc chi Chaetoceros trong sáu môi trường nuôi cấy là: F/2, F/2 không silic, ESM, Walne, BBM, ASW (môi trường nước biển nhân tạo). Dịch mẫu tảo và dịch môi trường ở các môi trường nuôi cấy là ựồng nhất, dựa vào kết quả ựếm tế bào ựể tìm ra môi trường nuôi cấy thắch hợp: mật ựộ tế bào ở môi trường nào tốt nhất thì ựó là môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi tảo nghiên cứụ
2.2.4.Phương pháp xác ựịnh ảnh hưởng của ựộ mặn tới tốc ựộ sinh trưởng
để xác ựịnh ựộ mặn tối ưu cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi tảo chủng TC1, tiến hành nuôi vi tảo chủng TC1 trong môi trường F/2 có ựộ mặn lần lượt là:
đo tốc ựộ sinh trưởng của vi tảo chủng TC1, sẽ xác ựịnh ựược mức ựộ thắch nghi của vi tảo với các nồng ựộ muối và xác ựịnh ựược ựộ mặn tối ưu cho vi tảo chủng TC1 phát triển.
2.2.5. Phương pháp phân loại vi tảo biển
2.2.5.1. Phương pháp hình thái học
Các chủng vi tảo biển sau khi ựược thuần khiết ựược quan sát dưới kắnh hiển vi quang học Zeiss ở ựộ phóng ựại 400 - 1000 lần ựể quan sát các ựặc ựiểm hình thái và kắch thước tế bào của chúng. để ựịnh loại chúng tôi sử dụng các tài liệu sau:
Khóa phân loại sinh vật phù du (plankton) miền Nam -Việt Nam [12]. Khóa phân loại tảo silic phù du biển Việt Nam [6].
2.2.5.2. Phương pháp ựịnh loài bằng sinh học phân tử
*Phương pháp tách chiết DNA
Theo phương pháp của Giovannoni et al (1990) và có sự thay ựổi của Van Mooy et al (2004).
Ớ Nguyên tắc:
Màng của tế bào vi tảo ựược phá vỡ bởi lyzozyme và các chất tẩy mạnh như: SDS-Tris-HCl giúp DNA ựược giải phóng. Protein và RNA ựược tách khỏi DNA nhờ các enzyme xúc tác RNaza A, Proteaza K và các dung môi chloroform: isoamyl alcohol (24:1).
Cuối cùng DNA ựược tủa bằng etanol lạnh 100% và xác ựịnh nồng ựộ DNA trong dung dịch mẫụ
Ớ Hóa chất:
+ Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) + Chloroform : isoamyl alcohol (24:1)
+ Ethanol lạnh 100% và 70%
+ đệm phá tế bào: 40 mM EDTA, 50 mM Tris, 750 mM sucrose, pH=8.0 (Bảo quản ở 4oC trong 1 năm).
Ớ Tiến hành:
DNA ựược tách chiết từ sinh khối ướt. Lấy khoảng 5 Ờ 10 mg sinh khối tế bào sau 5 ngày nuôi cấy, ly tâm lạnh ở 40ồC với tốc ựộ 8000 - 9000 vòng/phút trong 15 phút và rửa hai lần bằng 300 ộl dung dịch muối EDTA pH 8.0 (0.5M Na2EDTA, 0.15 NaCl). Sau ựó tạo dịch huyền phù trở lại trong 300 ộl ựệm 10 x TE (10 nM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, tỷ lệ mẫu : ựệm là 1 : 2). Sau ựó bổ sung tiếp 500 ộl dịch pha tế bào (Triston-X100 2% (v/v), 1% SDS,100 mM NaCl, 1 mM EDTA 8.0, 10 mM Tris 8.0), và hạt thủy tinh (tỉ lệ 1 : 2 mg/v), trộn ựều cho tan. Tiếp tục bổ sung choloroform : iso amyl alcohol (tỉ lệ 24 : 1, v/v) với thể tắch bằng 1/3 thể tắch mẫu, trộn ựều trong 5 - 10 phút bằng taỵ Cuối cùng bổ sung protein K (Sigma, 20 mg/ml proteinase K trong 1/10xTE), ủ mẫu ở 56ồC trong 10 - 15 phút. Sự tan tế bào ựược xác ựịnh bằng sự trong suốt của dung dịch cùng với sự tăng ựộ nhớt tương ứng, rồi làm lạnh trong nước ựá 10 phút. Tiếp theo, ly tâm mẫu ở 15000 vòng/phút trong 15 - 20 phút ựể phân lớp. Sau ựó chuyển phần nhớt pha dầu sang Eppendof (cỡ 1.5 ml) mới và DNA ựược tách ra bằng bổ sung etanol lạnh (etanol 95.5% giữ ở 22ồC) với thể tắch gấp ựôi thể tắch mẫu và 2 ộl của 3M Na acetate (pH = 4.5). Ngâm DNA trong 100 ộl ethanol 70% trong 30 phút và sau ựó ngâm liên tiếp trong ethanol 80%, 90%, 95% cho
mỗi nồng ựộ trong 5 phút. Sợi DNA làm khô bằng nhiệt ựộ phòng trong 10 phút và ựược làm tan trở lại trong 50 ộl ựệm 0.1xTE (của 10xTE) ở 4ồC qua ựêm.
Dịch ựem phân tắch bằng máy quang phổ kế ở các bước sóng 230, 260 và 280 nm. DNA hấp thụ rất nhanh ở bước sóng 260 nm, ở bước sóng 280 nm chứng tỏ sự có mặt của protein. Bước sóng 230 nm biểu hiện sự có mặt của chất ựệm, các muối như EDTA và của RNẠ Các tỉ lệ chuẩn về hấp thụ của DNA ở các bước sóng 230 : 260 : 280 là 0.1 : 0.45 : 0.515. Hàm lượng DNA ựược tắnh như sau: 1 ựơn vị OD (mật ựộ quang, Optical Durity) ở 260 nm tương ứng với 50 ộl/mg DNẠ
Ớ Cách tắnh:
đơn vị mẫu ừ ựộ pha loãng ừ chỉ số/1000 = DNA ộg/ộl
Nếu DNA chưa sạch cần khử protein và RNA bằng enzyme proteaza K và RnazaẠ
* Chạy PRC và ựiện di
Ớ Chuẩn bị mẫu cho phản ứng PCR
Mồi cho phản ứng PCR ựoạn rDNA 18S:
Mồi xuôi 2F:(2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ Hoặc 1315 F 5Ỗ-CGATAAGGAACGAGACCTT-3Ỗ Mồi ngược 1794R:(1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ
Ớ Chương trình chạy PCR
+Chạy nhắc lại 30 chu kỳ tại: 94ồC→ 1 phút, 50ồC→ 1 phút, 72ồC→ 90 giâỵ Hết một chu kỳ.
+Tổng hợp: 72ồC→ 2 phút.
+Kết thúc chương trình→ 4ồC nhiệt ựộ bảo quản.
+Kiểm tra sản phẩm PCR bằng ựiện di trên gel agarozạ +Pha ựệm: pha dung dịch ựệm 10 ừ TAE
Tris 242g Acid axetic 57.1 ml
Ọ5M EDTẠNa2 pH=8.0 100ml Pha với một lắt Trong quá trình chạy ựiện di dung dung dịch ựệm 1ừTAE (của 10ừTAE pha loãng dịch 10 trong 100 ml nước cất ựã khử trùng).
Ớ đổ gel
+Cân 0.8 Ờ 1.2g agaroza cho vào 100 ml dung dịch ựệm 1ừTAE, ựun sôi cho ựến khi agaroza tan hết.
+Lắc ựều ựể nguội ựến 40 - 50ồC. +đổ gel vào khay ựã cài sẵn lược.
+để 30 phút cho tới khi bản gel cứng, rút lược và ựặt khay gel vào máy ựiện dị
Ớ Tra mẫu
+Dùng pipet hút 2 ộl dung dịch DNA trộn với 2ộl 6 ừ loading buffer.
+Tra 1ộl của 1kb DNA lađer (Takara) trộn với 2ộl của 6 ừ loading buffer dùng như DNA chuẩn.
+Tra mẫu vào từng giếng.
Ớ Chạy ựiện di
+Chạy ựiện di với dòng ựiện 100V trong thời gian 20 - 30 phút cho tới khi vạch màu ựến 2/3 bản gel.
+Soi bản gel trên máy soi UV của Bio-rad.
Kết quả của DNA mới ựược nhân lên trong phản ứng PCR sẽ hiện hình với những vạch ựỏ màu da cam.
Kết quả sản phẩm PCR của mẫu ựược phân tắch giải trình tự trên Sequencer ABM Prism 3100-Avant.
Mồi cho xác ựịnh trình tự rDNA 18S:
Mồi xuôi 2F:(2-21) 5Ỗ-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3Ỗ 404 F:(404-423) 5Ỗ-GCTACCACATCCAAGGAAGG-3Ỗ 934 F:(934-945) 5Ỗ-CTGCGAAAGCATTTGCCAAGG-3Ỗ 1315 F:(1315-1333) 5Ỗ-CGATAACGAACGAGACCTT-3Ỗ
Mồi ngược U1:(586-563) 5Ỗ-TGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACC-3Ỗ U2:(1148-1124) 5Ỗ-CCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCC-3Ỗ U3:(1643-1619) 5Ỗ-GACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAG-3Ỗ 1794R:(1794-1775) 5Ỗ-GATCCTTCCGCAGGTTCACC-3Ỗ
Từ mẫu gốc lưu giữ ở môi trường thạch nghiêng cấy chuyển ra lọ Penicillin rồi tiếp tục ựược cấy chuyển sang bình tam giác 250 ml làm giống nuôi thu sinh khốị Mẫu vi tảo giống ựã lên tiếp tục ựược cấy chuyển ra bình 500 ml nuôi sinh khốị Quá trình nuôi sinh khối cấy chuyển liên tục và tăng dần thể tắch nuôi cấy: từ bình thủy tinh 500 ml lên bình 2 lắt, 5 lắt và tiếp tục lên bình nhựa 20 lắt. đối với các bình nuôi sinh khối 5 lắt và 20 lắt ựược chiếu sáng ánh ựèn neon với cường ựộ sáng là 10000 Ờ 20000 Lux và sục khắ liên tục 24/24h, còn các bình dung tắch nhỏ hơn ựược chiếu sáng theo quang chu kỳ là 10h chiếu sáng và 14h tối, sục khắ nhỏ.
Sinh khối của tảo ựược thu vào giai ựoạn sớm của pha cân bằng và ựược xử lý theo quy trình chiết tảo sau:
Mẫu nuôi sinh khối tảo thu từ các bình nuôi
↓ Làm lắng
Mẫu sinh khối với nồng ựộ cao hơn
↓ Ly tâm 10000 vòng/phút, 15 phút, 2ồC
Sinh khối tươi
↓ Methanol/chloroform (1 : 1, v/v)
Dịch chiết
↓ Cô quay chân không
2.2.7. Phương pháp xác ựịnh thành phần acid béo
Lấy khoảng 20 ộg vi tảo tươi cho vào ống nhựa và sấy khô mẫụ Sau ựó cho 5 ml chloroform/methanol (2 : 1, v/v) và chiết rút lipit bằng máy siêu âm trong 90 phút. Lọc lấy dịch chiết và rửa hai lần bằng dung dịch mới chiết. Sau ựó mẫu ựược cô cạn (làm bay hơi dung môi) và cặn chiết ựược hòa tan bằng methanol : acid sulfuric (95 : 5, v/v), ựun ở 80ồC trong 4h ựể este hóa các acid béọ Cho thêm 100ml nước. Các acid béo sau khi ựược metyl este hóa ựược chiết hai lần với 2 ml n-hesanẹ Các acid béo này ựược phân tắch bằng máy sắc ký khắ (gas chromatography, GC) Finnigan Trace GC ultra, cột BPX70 (50MẦ). Các acid béo ựược xác ựịnh bằng cách so sánh thời gian lưu (retention time) của mẫu với thời gian lưu của dung dịch chuẩn và ựược ựịnh lượng bằng so sánh các peak với chuẩn.
2.2.8. Phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
Là phương pháp hiệu quả cho việc ựịnh tắnh, ựịnh lượng và tinh sạch các hợp chất hữu cơ.
Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha là pha ựộng và pha tĩnh. Pha ựộng có thể là chất khắ hoặc lỏng ựể ựẩy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh. Pha tĩnh chứa chất rắn hoặc lỏng gọi là các
Xác ựịnh thành phần acid béo
Thử hoạt tắnh kháng tế bào ung thư
chất hấp phụ có khả năng chứa các chất hoà tan. Mẫu phân tắch chứa một hay nhiều cấu tử khi tiếp xúc với pha tĩnh và pha ựộng các cấu tử khác nhau tách nhau ra do chúng có ái lực khác nhau với cả hai phạ