Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư của loài ngũ vị vảy chồi (schisandra perulata gagnep )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Tuấn Anh NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LỒI NGŨ VỊ VẢY CHỒI (Schisandra perulata Gagnep.) LUẬN VĂN THẠC SĨ: HĨA HỌC LỜI CAM DOAN Tơi xin cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng cơng trình khác Tơi xin cam đoan rằng, giúp đỡ việc hoàn thành luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020 Học viên Trần Tuấn Anh LỜI CẢM ƠN Luận văn hoàn thành Trường Đại học Giao thông vận tải Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ lớn nhiều cá nhân tập thể Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Thị MaiTrường Đại học Giao thông vận tải, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới đồng nghiệp thuộc phịng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hố sinh biển tạo điều kiện, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian làm luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo thầy cô giáo Học viện Khoa học Công nghệ giúp đỡ, tạo điều kiện truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho suốt thời gian tơi học tập hồn thành luận văn Tôi trân trọng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn để hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 10 năm 2020 Học viên Trần Tuấn Anh DANH MỤC CAC KÝ HIỆU VA CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu 13 Tiếng Anh Diễn giải C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân proton CC Column chromatography Sắc kí cột DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT DMSO Dimethylsulfoxide (CH3)2SO HMBC Heteronuclear mutiple Bond Connectivity Tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear Single-Quantum Coherence Tương tác dị hạt nhân qua liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụ pha đảo C-18 TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane (CH3)4Si DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Số liệu NMR SP1 hợp chất tham khảo .30 Bảng 3.2 Số liệu NMR SP3 37 Bảng 3.3 Số liệu NMR SP5 hợp chất tham khảo .40 Bảng 3.4 Số liệu NMR SP6 hợp chất tham khảo .46 Bảng 3.5 Số liệu NMR SP7 hợp chất tham khảo .49 Bảng 3.6 Số liệu NMR SP11 52 Bảng 3.7.Kết đánh giá hoạt tính ức kháng tế bào ung thư chất 55 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1.Hình thái tổ chức mơ từ dạng bình thường đến phát triển thành khối u 10 Hình 1.2 Sơ đồ hình thành phát triển bệnh ung thư 10 Hình 2.1 Hình ảnh mẫu Ngũ vị vảy chồi .18 Hình 2.2 Sơ đồ phân lập hợp chất từ loài Ngũ vị vảy chồi 24 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học SP1 .29 Hình 3.2 Các tương tác HMBC NOESY SP1 31 Hình 3.3 Phổ CD hợp chất SP1 phổ ECD hợp chất 1a 1b 32 Hình 3.4 Phổ HR-ESI-MS hợp chất SP1 32 Hình 3.5 Phổ1H-NMR hợp chất SP1 .33 Hình 3.6 Phở 13C-NMR hợp chất SP1 33 Hình 3.7 Phổ HSQC hợp chất SP1 .34 Hình 3.8 Phở HMBC hợp chấtSP1 .34 Hình 3.9 Phổ NOESY hợp chất SP1 .35 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học SP2 35 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học SP3 36 Hình 3.12 Các tương tác HMBC SP3 38 Hình 3.13 Cấu trúc hóa học SP4 38 Hình 3.14 Cấu trúc hóa học SP5 39 Hình 3.15 Các tương tác HMBC COSY SP5 41 Hình 3.16 Phổ HR-ESI-MS hợp chất SP5 42 Hình 3.17 Phổ1H-NMR hợp chất SP5 42 Hình 3.18 Phở 13C-NMR hợp chất SP5 43 Hình 3.19 Phở HSQC hợp chất SP5 .43 Hình 3.20 Phở HMBC hợp chất SP5 44 Hình 3.21 Phở COSY hợp chất SP5 .44 Hình 3.22 Phở NOESY hợp chất SP5 45 Hình 3.23 Cấu trúc hóa học SP6 45 Hình 3.24 Các tương tác HMBC SP6 47 Hình 3.25 Cấu trúc hóa học SP7 48 Hình 3.26 Các tương tác HMBC SP7 49 Hình 3.27 Cấu trúc hóa học SP8 50 Hình 3.28 Cấu trúc hóa học SP9 51 Hình 3.29 Cấu trúc hóa học SP10 51 Hình 3.30 Cấu trúc hóa học SP11 52 Hình 3.31 Các tương tác HMBC SP11 .54 MỤC LỤC LỜI CAM DOAN I LỜI CẢM ƠN .II DANH MỤC CAC KÝ HIỆU VA CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HINH VẼ V MỤC LỤC VII MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI Schisandra .3 1.1.1 Đặc điểm thực vật 1.1.2 Tình hình nghiên cứu chi Schisandra giới 1.1.3 Tình hình nghiên cứu chi Schisandra nước 1.2 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ .9 1.2.1 Ung thư số phương pháp điều trị bệnh 1.2.2 Một số loại thuốc điển hình dùng để điều trị ung thư có nguồn gốc từ thực vật .15 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Phương pháp phân tích, phân tách phân lập hợp chất 18 2.2.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học hợp chất 19 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư 21 2.2.3.1 Nguyên liệu 21 2.2.3.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào 21 2.2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính 21 2.3 PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT 22 2.4 THÔNG SỐ VẬT LÍ CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC 24 2.4.1 Hợp chất SP1: schisandrulata A (chất mới) 24 2.4.2 Hợp chất SP2: 6-O-benzoylgomisin O .24 2.4.3 Hợp chất SP3: kadsutherin 25 2.4.4 Hợp chất SP4: γ-schizandrin 25 2.4.5 Hợp chất SP5: schisandrulata B (chất mới) 25 2.4.6 Hợp chất SP6: pinotatol 26 2.4.7 Hợp chất SP7: schisphentetralone A .26 2.4.8 Hợp chất SP8: (–)-8'-epi-aristotetralone 26 2.4.9 Hợp chất SP9: (–)-8,8'-epi-aristotetralone 26 2.4.10 Hợp chất SP10: rel-(8R,8'R)-dimethyl-(7S,7'R)-bis(3,4methylenedioxyphenyl)tetrahydrofuran 27 2.4.11 Hợp chất SP11: (-)-machilusin .27 2.5 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT .27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .29 3.1 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT 29 3.1.1 Hợp chất SP1: schisandrulata A (chất mới) 29 3.1.2 Hợp chất SP2: 6-O-benzoylgomisin O .35 3.1.3 Hợp chất SP3: kadsutherin 36 3.1.4 Hợp chất SP4: γ-schizandrin 38 3.1.5 Hợp chất SP5: schisandrulata B (chất mới) 39 3.1.6 Hợp chất SP6: pinotatol 45 3.1.7 Hợp chất SP7: schisphentetralone A .48 3.1.8 Hợp chất SP8: (–)-8'-epi-aristotetralone 50 3.1.9 Hợp chất SP9: (–)-8,8'-epi-aristotetralone 51 3.1.10 Hợp chất SP10: rel-(8R,8'R)-dimethyl-(7S,7'R)-bis(3,4methylenedioxyphenyl)tetrahydrofuran 51 3.1.11 Hợp chất SP11: (-)-machilusin .52 3.1.12 Danh sách hợp chất phân lập từ loài Ngũ vị vảy chồi (Schisandraperulata) 54 3.2 HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .56 4.1 KẾT LUẬN 56 4.2 KIẾN NGHỊ .56 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 MỞ ĐẦU Ung thư nhóm bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào cách vô tổ chức, tế bào có khả xâm lấn mô khác cách phát triển trực tiếp vào mô lân cận di chuyển đến nơi xa (di căn) Nghiên cứu, tìm kiếm hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính gây độc tế bào, ức chế phát triển tế bào ung thư để ứng dụng phòng ngừa, chữa trị bệnh ung thư nhiệm vụ đặc biệt quan trọng nhà khoa học nước quan tâm Các hợp chất thiên nhiên ln có vai trị việc phát phát triển dược phẩm Chúng thể ưu điểm so với chất tổng hợp có độc tính thấp khả dung nạp cao thể sinh vật Trong điều trị ung thư chúng độc có khả diệt tế bào u, bảo vệ tế bào lành khỏi nguy nhiễm độc dùng ở giai đoạn sớm hiệu tăng lên cao Điều giải thích ngày nhà khoa học tích cực tìm kiếm hoạt chất chống khối u lại quan tâm đến hợp chất thiên nhiên Đến nay, nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư như: từ số loại thông đỏ tách lượng đáng kể 10-DAB III chuyển hoá thành paclitaxel docetaxel (taxotere), loại thuốc điều trị ung thư vú ung thư phổi; hoạt chất vinblastine vincristine từ loài Catharanthus roseus L tác nhân chống phân bào sử dụng kết hợp với số loại thuốc khác để điều trị nhiều loại ung thư bạch cầu, bàng quang, tinh hoàn, u bạch huyết số carcinoma; paclitaxel từ Thông đỏ (Taxus brevifolia) có tác dụng điều trị ung thư vú,… Tuy nhiên, cịn có nhiều thuốc sử dụng để chữa trị ung thư đông y, dân gian chưa nghiên cứu cách khoa học, chưa xác định hoạt chất chế tác dụng hoạt chất Chi Schisandra hay gọi ngũ vị tử nhân dân sử dụng nhiều thuốc điều trị bệnh ung thư, mặt khác nghiên cứu nước bước đầu cho thấy hợp chất phân lập từ chi có khả ức chế phát triển tế bào ung thư Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, nhóm nghiên cứu đề xuất thực đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư lồi Ngũ vị vảy chồi (Schisandraperulata) ở Việt Nam” Đề tài bao gồm mục tiêu sau: Phân lập số hợp chất từ loài Ngũ vị vảy chồi Xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập Đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư hợp chất phân lập CHƯƠNG 1: CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHI Schisandra 1.1.1 Đặc điểm thực vật Giới Bộ Họ : Plantae : Austrobaileyales : Schisandraceae Chi : Schisandra Schisandra chi thực vật có hoa họ Schisandraceae, thường dây leo sớm rụng phát triển tốt nhiều loại đất ưa thích bờ tường nơi có nhiều bóng râm Các lồi có nguồn gốc ở khu vực Châu Á, khô chúng dùng nhiều y học Ngũ vị vảy chồi (Schisandraperulata) dây leo cao, chồi có 3-4 vảy cao bao lấy Lá ở nhánh ngắn, có phiến bánh bị hay xoan, hai đầu nhọn, to 10-15 × 5-9 cm, khơng lơng, gân phụ 6-8 cặp, cuống đến cm Hoa 1-2 ở nách vảy chồi, cọng 2-6 cm, đế hoa lồi, đài cành hoa 8, xa Trái mập, thư đài dài đến 13 cm, gắn gié, hột 2, dài mm[1] 1.1.2 Tình hình nghiên cứu chi Schisandra giới Chi Schisandra nhà khoa học giới quan tâm, có đến 25 lồi chi cơng bố thành phần hóa học hoạt tính sinh học Thành phần hóa học chi hợp chất lignan triterpenoid, ngồi ra, cịn chứa thành phần khác diterpenoid, flavonoid, …Các hợp chất dibenzocyclooctadien thành phần lignan chi Sự có mặt hợp chất lignan tác dụng sinh học chúng góp phần làm sáng tỏ công dụng dân gian số loài Schisandra sử dụng bảo vệ gan, chống oxi hóa Bên cạnh với cấu trúc hóa học tương đối đặc biệt, hợp chất dibenzocyclooctadien thể hoạt tính chống ung thư kháng HIV tiềm [2] Cho đến nay, nhà khoa học giới phát khoảng 300 hợp chất dibenzocyclooctadien chi Schisandra Phần lớn cấu trúc hợp chất phân lập có số lượng lớn nhóm hydroxy, methoxy, hay dioxymethylen…, hai nhân benzene hợp chất dibenzocyclooctadien thường lại hai proton thơm không bị thay (dạng hợp chất 1-4) Các nhóm dioxymethylene thường hình thành vị trí nhóm R1+R2 R5+R6 Bên cạnh đó, vị trí C-6 C-9 ở hợp chất thường xuất nhóm hydroxy (R R8) Điều đặc biệt có mặt nhóm hydroxy ở C-6 C-9 lại nhận thấy mặt hóa lập thể, nhóm hydroxy C-9 chủ yếu định hướng alpha nhóm hydroxy C-6 lại định hướng beta Khác với hợp chất lignan thơng thường, hợp chất dibenzocyclooctadien có chứa vịng cyclootadien, hình thành dạng đồng phân hình học hai nhóm methyl ở C-7 C-8 Các nghiên cứu trước phân lập hợp chất dibenzocyclooctadien từ chi Schisandra hai nhóm methyl C-7 C-8 tồn ở hai dạng đồng phân cis (dạng hợp chất 1, 2, 4) dạng đồng phân trans (dạng 3)[3, 4] Bên cạnh hợp chất dibenzocyclooctadien, ở chi Schisandra, nhà khoa học phát có mặt hợp chất spirobenzofuran lignan (dạng hợp chất 5-8).Theo thống kê, có khoảng gần 80 hợp chất có cấu trúc spirobenzofuran lignan phân lập từ chi Schisandra.Các hợp chất hình thành sở hợp chất dibenzocyclooctadien lignan Cấu trúc spiro tạo thành từ đóng vịng ether C-14 nhóm hydroxymethylen C-16 (dạng hợp chất 5-7) hay đóng vòng ether C-9 C-16 (dạng hợp chất 8) Ở hợp chất spirobenzofuran lignan, nhóm ở C-9 (R 2) thường chiếm vị trí alpha nhóm ở C-6 (R1) định hướng ở hai cấu hình alpha beta (dạng hợp chất 6) Ở hợp chất prirobenzofuran, có chứa đơn vị cấu trúc quinon bền dễ xảy q trình oxy hóa phá vỡ vịng hình thành hợp chất seco-spirobenzofuran lignan (dạng hợp chất 10) 10 Ngoài đặc điểm khung carbon, hợp chất spirobenzofuran lignan thuộc chi Schisandra có đa dạng nhóm ở C-6 C-9 Các nhóm hydroxy ở hai vị trí thường bị ester hóa bởi nhiều acid hữu khác acetic (Ac), propylic (Prop), butanoic, Caproic (Cap), angelic (Ang), isovaleroic, benzoic (Bz) cinamic (Cin) acid[5] Một số hợp chất lignan với khung aryltetralin lignan phân lập từ số loài thuộc chi Schisandra S sphenanthera, S henryi, S nigra Ở phenyltetralin lignan phân lập từ chi Schisandra lại nhận thấy có nhiều hợp chất có chứa nhóm ketone ở C-1, số hợp chất lại tồn dạng lignan glicoside với hợp phần đường đường với cấu trúc hexose glucopyranose hay pentose xylopyranose arabinopyranose Có thể kể đến số hợp chất đại diện cho nhóm phenyltetralin lignan hợp chất 11-18[3, 4] KH 11 Hợp chất Schisandron Cấu trúc R1=R2=CH3 12 13 14 Wulignan A1 Epienshicin Epienshicin metyl ete Epischisandron Epiwulignan A1 Wulignan A2 Schizandrizit R1=CH3, R2=H R1+R3=CH2, R3=H, R4=CH3 R1+R3=CH2, R3=R4=CH3 15 16 17 18 R1=H, R2=R3=R4=CH3 R1=R3=H, R2=R4=CH3 R1=R4= CH3, R2=R3=H Nguồn (bộ phận) S sphenanthera (q) S henryi (q) S henryi (q) S henryi (q) S henryi (q) S henryi (q) S henryi (q) S henryi (q) S nigra (q) Ngoài ra, hợp chất lignan với dạng khung diarylbutan lignan diaryl tetrahydrofuran lignan phân lập từ lồi chi Schisandra Cho đến nay, có khoảng 30 hợp chất diarylbutan lignan 10 hợp chất diaryl tetrahydrofuran phân lập từ chi Schisandra[3, 4] Các diarylbutan lignan tetrahydrofuran lignan Các hợp chất lignan phân lập từ chi Schisandra phân làm dạng hợp chất lignan dibenzocyclooctadien lignan, spirobenzofuran lignan, aryltetralin lignan, diaryl butan ligna hợp chất tetrahydrofuran lignan Trong số đó, phổ biến hợp chất dibenzocyclooctadien lignan Các hợp chất có cấu trúc hóa học đặc biệt, gặp tự nhiên hứa hẹn có giá trị cao hoạt tính sinh học Lớp hợp chất thứ cấp khác cơng bố lồi thuộc chi Schisandra phải kể đến triterpenoid[6, 7] Dạng khung carbon triterpene công bố từ chi Schisandra tập trung vào khung carbon lanostan, norlanostan, cycolartan dạng hợp chất triterpene đặc trưng riêng cho chi Schisandra gọi với tên chung schinortriterpenoid[8, 9] Chúng nhóm chất nortriterpen có chứa từ 26 đến 29 carbon phân lập từ loài họ Schisandraceae Điều đặc biệt cấu trúc hóa học triterpenoid phân lập từ chi Schisandra chúng tritrepenene bản, hay số nhóm methyl hình thành hợp chất nortriterpene, hay có phá vỡ vịng để hình thành hợp chất secotriterpene Cấu trúc hợp chất lanostane secolanostane phân lập từ chi Schisandra Cấu trúc hợp chất secocycloartan phân lập từ chi Schisandra Cấu trúc hợp chất schinortriterpenoid phân lập từ chi Schisandra Các hợp chất tritecpenoit phân lập từ chi Schisandra hầu hết thể hoạt tính kháng HIV-1 hoạt tính gây độc tế bào số dòng tế bào như: ung thư bạch cầu HL-60, ung thư phổi A-549, ung thư máu K562[2, 7,10] Thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Schirsandra giới cho thấy lồi Schisandra có chứa nhiều hợp chất thứ cấp, đáng ý hợp chất lignan triterpenoid Cấu trúc hóa học hợp chất lignan triterpenoid có chi Schisandra đặc thù dạng dibenzocyclooctadien lignan hay schinortriterpenoid hợp chất phân lập ở loài thực vật họ Schisandraceae Các hợp chất phân lập từ chi Schisandra thông báo hợp chất thể hoạt tính bảo vệ gan, chống oxi hóa, gây độc tế bào ung thư Do đó, nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng gây độc tế bào ung thư lồi ngũ vị vảy chồi hồn tồn có tính khả thi, có tiềm phát hợp chất có cấu trúc hóa học mới, đặc thù, tiềm tác dụng gây độc tế bào ung thư 1.1.3 Tình hình nghiên cứu chi Schisandra nước Năm 2010, Trần Văn Sung cộng phân lập hai hợp chất lignan, schizandrin (19), angeloylgomisin P (20) hợp chất nortriterpen, henridilacton A (21) từ loài S Sphenanthera, ba hợp chất thể hoạt tính gây độc tế bào bốn dòng tế bào ung thư người KB (ung thư biểu mô), Hep-G2 (ung thư gan), Lu (ung thư phổi) MCF-7 (ung thư vú) với giá trị IC50 18,6-66,8 µg/mL[11]  ... thành phần hóa học đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư lồi Ngũ vị vảy chồi (Schisandraperulata) ở Việt Nam” Đề tài bao gồm mục tiêu sau: Phân lập số hợp chất từ loài Ngũ vị vảy chồi Xác định... báo hợp chất thể hoạt tính bảo vệ gan, chống oxi hóa, gây độc tế bào ung thư Do đó, nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng gây độc tế bào ung thư loài ngũ vị vảy chồi hồn tồn có tính khả thi, có... hầu hết thể hoạt tính kháng HIV-1 hoạt tính gây độc tế bào số dịng tế bào như: ung thư bạch cầu HL-60, ung thư phổi A-549, ung thư máu K562[2, 7,10] Thành phần hóa học hoạt tính sinh học chi Schirsandra