Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây trinh nữ hoàng cung – crinum latifolium l , amaryllidacceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ***** NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MIINH NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC Mã số: 62.73.15.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS VÕ THỊ BẠCH HUỆ Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết trình bày luận án trung thực chưa công bố công trình khác Người cam đoan, Nguyễn Hữu Lạc Thủy i MỤC LỤC MỤC LỤC i BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT .iii DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG BIỂU vii DANH MỤC SƠ ĐỒ vii ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thực vật học Trinh nữ hoàng cung 1.2 Tổng quan hóa học chi Crinum Trinh nữ hoàng cung 1.3 Tổng quan tác dụng sinh học chi Crinum Trinh nữ hoàng cung 14 1.4 Chiết hoạt chất từ dược liệu dung môi CO2 lỏng siêu tới hạn 21 1.5 Các phương pháp nghiên cứu hóa học Trinh nữ hoàng cung 22 1.6 Phương pháp thiết lập chất đối chiếu 24 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên vật liệu 27 2.2 Trang thiết bị 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 40 3.1 Quy trình chiết cao cồn, phân đoạn alcaloid phân đoạn flavonoid từ Trinh nữ hoàng cung 40 3.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 46 3.3 Thiết lập chất đối chiếu 69 3.4 Xây dựng phương pháp HPLC, CE, dấu vân tay để định tính định lượng alcaloid flavonoid TNHC 82 3.5 Đề xuất số tiêu cần thiết để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bột Trinh nữ hoàng cung 99 ii CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 102 4.1 Các phương pháp chiết xuất hoạt chất từ Trinh nữ hoàng cung 102 4.2 Phân lập hợp chất tinh khiết 107 4.3 Thiết lập chất đối chiếu từ cao chiết Trinh nữ hoàng cung 111 4.4 Quy trình định lượng alcaloid flavonoid từ Trinh nữ hoàng cung 112 4.5 Các tiêu cần thiết Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TNHC 117 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN PHỤ LỤC iii BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á) AL-NK Phân đoạn alcaloid chiết từ TNHC phương pháp ngấm kiệt AL-SA Phân đoạn alcaloid chiết từ TNHC sóng siêu âm AL-SFE Phân đoạn alcaloid chiết từ TNHC phương pháp SFE AR-96 Phân đoạn alcaloid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% As Hệ số bất đối CĐC Chất đối chiếu CE Caplillary Electrophoresis (Điện di mao quản) Corr Area Corrected Area (Diện tích pic chuẩn hóa) CZE Caplillary Zone Electrophoresis (Điện di mao quản vùng) d doublet (đỉnh đôi) DĐVN IV Dược điển Việt Nam xuất lần thứ IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhiệt vi sai) DMSO Dimethylsulfoxyd DVT Dấu vân tay ESI Electrospray Ionization (Ion hóa cách phun ion) FL-NK Phân đoạn flavonoid chiết từ TNHC phương pháp ngấm kiệt FL-SA Phân đoạn flavonoid chiết từ TNHC sóng siêu âm FL-SFE Phân đoạn flavonoid chiết từ TNHC phương pháp SFE FR-96 Phân đoạn flavonoid chiết từ rễ TNHC với dung môi cồn 96% GC Gas Chromatography (Sắc ký khí) GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký khí ghép khối phổ) GLP Good Laboratory Practices (Thực hành tốt phòng kiểm nghiệm thuốc) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IR Infrared (Hồng ngoại) iv J Coupling constant (Hằng số ghép) LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (Sắc ký lỏng ghép khối phổ) L-SFE Cao toàn phần chiết từ TNHC phương pháp SFE MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sắc ký mixen điện động) MS Mass Spectrometry (Khối phổ) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cộng hưởng từ hạt nhân) PĐ Phân đoạn PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PCRS Primary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học sơ cấp) PTN Phòng thí nghiệm RSD Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Rs độ phân giải pic có thời gian lưu nhỏ lớn kề bên S Diện tích pic (µV x giây) s singlet (Đỉnh đơn) SKĐ Sắc ký đồ SCRS Secondary Chemical Reference Standard (Chất đối chiếu hóa học thứ cấp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chiết chất lỏng siêu tới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng TCKN Tiêu chuẩn kiểm nghiệm TR Thời gian lưu (phút) TM Thời gian di chuyển (phút) TNHC Trinh nữ hoàng cung TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhiệt trọng lượng) TT Thuốc thử UV-Vis Ultraviolet-Visible (Tử ngoại khả kiến) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sắc ký cột chân không) v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Hình vẽ TNHC Hình 1.2: Các cấu trúc hóa học alcaloid khung crinin Hình 1.3: Cấu trúc hóa học alcaloid khung lycorin (A) khung tazettin (B) Hình 1.4: Cấu trúc hóa học khung belladin (C) cấu trúc khung galanthamin (D) Hình 1.5: Cấu trúc hóa học khung lycorenin (E) cấu trúc khung cheryllin (F) Hình 1.6: Cấu trúc hóa học flavonoid chi Crinum Hình 1.7: Cấu trúc hóa học hợp chất flavonoid TNHC 10 Hình 3.1: Hình cụm hoa TNHC (Crinum latifolium L.) 40 Hình 3.2: Hình hoa Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) 40 Hình 3.3: SKĐ hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid 48 Hình 3.4: SKĐ hợp chất phân lập từ phân đoạn alcaloid AR flavonoid 48 Hình 3.5: Cấu trúc hóa học liệu phổ NMR (500 MHz, CDCl3) (2) 58 Hình 3.6: Cấu trúc hóa học 6-ethoxyundulatin 58 Hình 3.7: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC crinamidin HPLC 71 Hình 3.8: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC 6-hydroxycrinamidin HPLC 72 Hình 3.9: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC lycorin HPLC 72 Hình 3.10: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC hippadin HPLC 73 Hình 3.11: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC astragalin HPLC 73 Hình 3.12: SKĐ xác định độ tinh khiết CĐC isoquercitrin HPLC 74 Hình 3.13: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC 85 Hình 3.14: Các SKĐ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp HPLC 89 Hình 3.15: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE 92 vi Hình 3.16: Các điện di đồ thẩm định tính đặc hiệu quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp CE 95 Hình 3.17: Sắc ký đồ DVT – SKLM alcaloid TNHC 97 Hình 3.18: Sắc ký đồ DVT – SKLM flavonoid TNHC 98 Hình 4.1: SKĐ alcaloid TNHC HPLC, kỹ thuật rửa giải isocratic 113 Hình 4.2: SKĐ alcaloid TNHC HPLC, kỹ thuật rửa giải gradient 113 Hình 4.3: Điện di đồ so sánh mẫu thử alcaloid phân tích CZE MEKC 114 Hình 4.4: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha methanol 115 Hình 4.5: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha đệm dinatri tetraborat 25 mM 115 Hình 4.6: Điện di đồ mẫu thử alcaloid pha dung dịch acid H3PO4 115 Hình 4.7: SKĐ so sánh khả rửa giải mẫu flavonoid TNHC HPLC với pha động methanol acetonitril 116 DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết hoạt chất từ TNHC 29 Sơ đồ 2.2 Sơ đồ khảo sát chiết hoạt chất từ TNHC kết hợp hai phương pháp SFE phương pháp chiết ngấm kiệt với cồn 70% 32 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết cao cồn, PĐ alcaloid PĐ flavonoid từ TNHC 42 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ chiết alcaloid flavonoid từ rễ TNHC 42 Sơ đồ 3.3 Sơ đồ chiết alcaloid flavonoid bột kết hợp hai phương pháp chiết 45 Sơ đồ 3.4 Sơ đồ phân lập hợp chất (2) (3) từ PĐ alcaloid AL-SFE 50 Sơ đồ 3.5 Sơ đồ chiết alcaloid AL-SA flavonoid FL-SA 82 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Alcaloid TNHC Crinum latifolium L 11 Bảng 3.1: Hiệu suất chiết (%) hoạt chất phương pháp ngấm kiệt 41 Bảng 3.2: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên hiệu suất chiết 43 Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng áp suất lên hiệu suất chiết 44 Bảng 3.4: Kết tách phân đoạn mẫu AL-SFE FL-NK VLC 46 Bảng 3.5: Các hợp chất tinh khiết phân lập từ cao chiết TNHC 47 Bảng 3.6: Kết phân lập alcaloid từ phân đoạn ALS1 48 Bảng 3.7: Kết triển khai sắc ký cột với chất hấp phụ pha đảo 49 Bảng 3.8: Kết phân lập (2) (3) từ PĐ n–hexan 49 Bảng 3.9: Kết phân lập (8), (9), (10) từ PĐ alcaloid AL-NK 51 Bảng 3.10: Dữ liệu phổ NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) hợp chất (2) 56 Bảng 3.11: Các tương tác proton phổ COSY, HMBC hợp chất (2) 57 Bảng 3.12: Kết độ tinh khiết; hàm ẩm phân tích nhiệt trọng lượng 69 Bảng 3.13: Thành phần pha động bước sóng phát quy trình xác định độ tinh khiết nguyên liệu CĐC phương pháp HPLC 70 Bảng 3.14: Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống quy trình phân tích HPLC 70 Bảng 3.15: Kết xác định độ tinh khiết sắc ký (%) CĐC HPLC 74 Bảng 3.16: Dữ liệu phổ UV-Vis, MS điểm chảy CĐC 75 Bảng 3.17: Dữ liệu phổ IR CĐC 75 Bảng 3.18: Kết đánh giá đồng lô CĐC sau đóng gói 77 Bảng 3.19: Kết phân tích robust A CĐC crinamidin 79 Bảng 3.20: Kết phân tích robust A CĐC 6-hydroxycrinamidin 79 Bảng 3.21: Kết phân tích robust A CĐC hippadin 80 Bảng 3.22: Kết phân tích robust A CĐC lycorin 80 Bảng 3.23: Kết phân tích robust A CĐC astragalin 81 viii Bảng 3.24: Kết phân tích robust A CĐC isoquercitrin 81 Bảng 3.25: Kết xác định giá trị ấn định giá trị công bố CĐC 81 Bảng 3.26: Chương trình dung môi định lượng alcaloid HPLC 83 Bảng 3.27: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC (n = 6) 83 Bảng 3.28: Kết khảo sát độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC (n = 6) 86 Bảng 3.29: Kết khảo sát tỷ lệ phục hồi quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp HPLC (n = 9) 87 Bảng 3.30: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình đinh lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp HPLC (n = 6) 88 Bảng 3.31: Kết khảo sát độ xác quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC HPLC (n = 6) 90 Bảng 3.32: Kết khảo sát độ quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp HPLC (n = 9) 90 Bảng 3.33: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE (n = 6) 91 Bảng 3.34: Kết khảo sát độ xác trung gian quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE (n = 6) 93 Bảng 3.35: Kết khảo sát tỷ lệ phục hồi quy trình định lượng đồng thời alcaloid TNHC phương pháp CE (n = 9) 93 Bảng 3.36: Kết khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC CE (n = 6) 94 Bảng 3.37: Kết khảo sát độ xác quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC CE (n = 6) 96 Bảng 3.38: Kết khảo sát độ quy trình định lượng đồng thời astragalin isoquercitrin TNHC phương pháp CE (n = 9) 96 [...]... trị ấn định và giá trị công bố các CĐC 81 Bảng 3.26: Chương trình dung môi định l ợng 6 alcaloid bằng HPLC 83 Bảng 3.27: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định l ợng đồng thời 6 alcaloid trong l TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6) 83 Bảng 3.28: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định l ợng đồng thời 6 alcaloid trong l TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6)... tỷ l phục hồi của quy trình định l ợng đồng thời 6 alcaloid trong l TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9) 87 Bảng 3.30: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình đinh l ợng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong l TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 6) 88 Bảng 3.31: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định l ợng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong l TNHC bằng HPLC... khảo sát độ đúng của quy trình định l ợng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong l TNHC bằng phương pháp HPLC (n = 9) 90 Bảng 3.33: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống quy trình định l ợng đồng thời 6 alcaloid trong l TNHC bằng phương pháp CE (n = 6) 91 Bảng 3.34: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian trong quy trình định l ợng đồng thời 6 alcaloid trong l TNHC bằng phương pháp... quả khảo sát tỷ l phục hồi của quy trình định l ợng đồng thời 6 alcaloid trong l TNHC bằng phương pháp CE (n = 9) 93 Bảng 3.36: Kết quả khảo sát tình phù hợp hệ thống của quy trình định l ợng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong l TNHC bằng CE (n = 6) 94 Bảng 3.37: Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định l ợng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong l TNHC bằng CE... Kết quả khảo sát độ chính xác của quy trình định l ợng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong l TNHC bằng CE (n = 6) 96 Bảng 3.38: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình định l ợng đồng thời astragalin và isoquercitrin trong l TNHC bằng phương pháp CE (n = 9) 96