Nghiên cứu thành phần hóa học, thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây Trinh Nữ Hoàng Cung Crinum latifolium L., Amaryllidacceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ***** NGUYỄN HỮU LẠC THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT LẬP CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Tp Hồ Chí Minh – Năm 2014 B GIÁO DC VÀ ÀO TO B Y T I HC Y DC THÀNH PH H CHÍ MIINH NGUYN HU LC THY NGHIÊN CU THÀNH PHN HÓA HC, THIT LP CHT I CHIU VÀ XÂY DNG QUY TRÌNH KIM NGHIM THÀNH PHN ALCALOID VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH N HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L., Amaryllidaceae) Chuyên ngành: KIM NGHIM THUC Mã s: 62.73.15.01 LUN ÁN TIN S DC HC Ngi hng dn khoa hc: PGS.TS. VÕ TH BCH HU Tp H Chí Minh – Nm 2014 LI CAM OAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cu ca riêng tôi. Các s liu, kt qu đc trình bày trong lun án là trung thc và cha tng đc ai công b trong bt k công trình nào khác. Ngi cam đoan, Nguyn Hu Lc Thy i MC LC MC LC i BNG CÁC CH VIT TT iii DANH MC HÌNH NH v DANH MC BNG BIU vii DANH MC S  vii T VN  1 CHNG 1: TNG QUAN TÀI LIU 3 1.1. Tng quan thc vt hc cây Trinh n hoàng cung 3 1.2. Tng quan hóa hc ca chi Crinum và cây Trinh n hoàng cung 5 1.3. Tng quan tác dng sinh hc chi Crinum và cây Trinh n hoàng cung 14 1.4. Chit hot cht t dc liu bng dung môi CO 2 lng siêu ti hn 21 1.5. Các phng pháp nghiên cu hóa hc ca cây Trinh n hoàng cung 22 1.6. Phng pháp thit lp cht đi chiu 24 CHNG 2: PHNG PHÁP NGHIÊN CU 27 2.1. Nguyên vt liu 27 2.2. Trang thit b 28 2.3. Phng pháp nghiên cu 29 CHNG 3: KT QU NGHIÊN CU 40 3.1. Quy trình chit cao cn, phân đon alcaloid và phân đon flavonoid t cây Trinh n hoàng cung 40 3.2. Phân lp hp cht tinh khit 46 3.3. Thit lp cht đi chiu 69 3.4. Xây dng phng pháp HPLC, CE, du vân tay đ đnh tính và đnh lng alcaloid hoc flavonoid trong lá TNHC 82 3.5.  xut mt s ch tiêu cn thit đ xây dng tiêu chun kim nghim bt lá Trinh n hoàng cung 99 ii CHNG 4: BÀN LUN 102 4.1. Các phng pháp chit xut hot cht t cây Trinh n hoàng cung 102 4.2. Phân lp hp cht tinh khit 107 4.3. Thit lp cht đi chiu t cao chit Trinh n hoàng cung 111 4.4. Quy trình đnh lng alcaloid và flavonoid t lá Trinh n hoàng cung 112 4.5. Các ch tiêu cn thit ca Tiêu chun kim nghim TNHC 117 KT LUN KIN NGH DANH MC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CU LIÊN QUAN N LUN ÁN TÀI LIU THAM KHO PHN PH LC iii BNG CÁC CH VIT TT ASEAN Association of Southeast Asian Nations (Hip hi các quc gia ông Nam Á) AL-NK Phân đon alcaloid chit t lá TNHC bng phng pháp ngm kit AL-SA Phân đon alcaloid chit t lá TNHC bng sóng siêu âm AL-SFE Phân đon alcaloid chit t lá TNHC bng phng pháp SFE AR-96 Phân đon alcaloid chit t r TNHC vi dung môi cn 96% A s H s bt đi CC Cht đi chiu CE Caplillary Electrophoresis (in di mao qun) Corr Area Corrected Area (Din tích pic đc chun hóa) CZE Caplillary Zone Electrophoresis (in di mao qun vùng) d doublet (đnh đôi) DVN IV Dc đin Vit Nam xut bn ln th IV DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DSC Differential Scanning Calorimetry (Nhit vi sai) DMSO Dimethylsulfoxyd DVT Du vân tay ESI Electrospray Ionization (Ion hóa bng cách phun ion) FL-NK Phân đon flavonoid chit t lá TNHC bng phng pháp ngm kit FL-SA Phân đon flavonoid chit t lá TNHC bng sóng siêu âm FL-SFE Phân đon flavonoid chit t lá TNHC bng phng pháp SFE FR-96 Phân đon flavonoid chit t r TNHC vi dung môi cn 96% GC Gas Chromatography (Sc ký khí) GC-MS Gas Chromatography – Mass Spectrometry (Sc ký khí ghép khi ph) GLP Good Laboratory Practices (Thc hành tt phòng kim nghim thuc) HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sc ký lng hiu nng cao) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IR Infrared (Hng ngoi) iv J Coupling constant (Hng s ghép) LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (Sc ký lng ghép khi ph) L-SFE Cao toàn phn chit t lá TNHC bng phng pháp SFE MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography (Sc ký mixen đin đng) MS Mass Spectrometry (Khi ph) NMR Nuclear Magnetic Resonance (Cng hng t ht nhân) P Phân đon PDA Photo Diode Array (Dãy diod quang) PCRS Primary Chemical Reference Standard (Cht đi chiu hóa hc s cp) PTN Phòng thí nghim RSD Relative Standard Deviation ( lch chun tng đi) Rs đ phân gii gia pic có thi gian lu nh và ln hn k bên S Din tích pic (µV x giây) s singlet (nh đn) SK Sc ký đ SCRS Secondary Chemical Reference Standard (Cht đi chiu hóa hc th cp) SDS Sodium Dodecyl Sulfate SFE Supercritical Fluid Extraction (Chit bng cht lng siêu ti hn) SKLM Sc ký lp mng TCKN Tiêu chun kim nghim T R Thi gian lu (phút) T M Thi gian di chuyn (phút) TNHC Trinh n hoàng cung TGA Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhit trng lng) TT Thuc th UV-Vis Ultraviolet-Visible (T ngoi kh kin) VLC Vacuum Liquid Chromatography (Sc ký ct chân không) v DANH MC HÌNH NH Hình 1.1: Hình v cây TNHC 5 Hình 1.2: Các cu trúc hóa hc ca alcaloid khung crinin 6 Hình 1.3: Cu trúc hóa hc alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) 6 Hình 1.4: Cu trúc hóa hc khung belladin (C) và cu trúc khung galanthamin (D) 7 Hình 1.5: Cu trúc hóa hc khung lycorenin (E) và cu trúc khung cheryllin (F) 7 Hình 1.6: Cu trúc hóa hc ca các flavonoid trong chi Crinum 8 Hình 1.7: Cu trúc hóa hc các hp cht flavonoid trong cây TNHC 10 Hình 3.1: Hình lá và cm hoa ca cây TNHC (Crinum latifolium L.) 40 Hình 3.2: Hình hoa Trinh n hoàng cung (Crinum latifolium L.) 40 Hình 3.3: SK các hp cht phân lp t các phân đon alcaloid. 48 Hình 3.4: SK các hp cht phân lp t phân đon alcaloid AR và flavonoid. 48 Hình 3.5: Cu trúc hóa hc và d liu ph NMR (500 MHz, CDCl 3 ) ca (2). 58 Hình 3.6: Cu trúc hóa hc ca 6-ethoxyundulatin 58 Hình 3.7: SK xác đnh đ tinh khit ca CC crinamidin bng HPLC. 71 Hình 3.8: SK xác đnh đ tinh khit CC 6-hydroxycrinamidin HPLC. 72 Hình 3.9: SK xác đnh đ tinh khit ca CC lycorin bng HPLC. 72 Hình 3.10: SK xác đnh đ tinh khit ca CC hippadin bng HPLC. 73 Hình 3.11: SK xác đnh đ tinh khit ca CC astragalin bng HPLC 73 Hình 3.12: SK xác đnh đ tinh khit ca CC isoquercitrin bng HPLC. 74 Hình 3.13: Các SK thm đnh tính đc hiu trong quy trình đnh lng đng thi 6 alcaloid trong lá TNHC bng phng pháp HPLC. 85 Hình 3.14: Các SK thm đnh tính đc hiu trong quy trình đnh lng đng thi astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bng phng pháp HPLC. 89 Hình 3.15: Các đin di đ thm đnh tính đc hiu ca quy trình đnh lng đng thi 6 alcaloid trong lá TNHC bng phng pháp CE. 92 vi Hình 3.16: Các đin di đ thm đnh tính đc hiu ca quy trình đnh lng đng thi astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC bng phng pháp CE. 95 Hình 3.17: Sc ký đ DVT – SKLM alcaloid TNHC. 97 Hình 3.18: Sc ký đ DVT – SKLM flavonoid TNHC 98 Hình 4.1: SK alcaloid TNHC bng HPLC, k thut ra gii isocratic. 113 Hình 4.2: SK alcaloid TNHC bng HPLC, k thut ra gii gradient. 113 Hình 4.3: in di đ so sánh mu th alcaloid phân tích bng CZE và MEKC. . 114 Hình 4.4: in di đ mu th alcaloid pha trong methanol. 115 Hình 4.5: in di đ mu th alcaloid pha trong đm dinatri tetraborat 25 mM. . 115 Hình 4.6: in di đ mu th alcaloid pha trong dung dch acid H 3 PO 4 . 115 Hình 4.7: SK so sánh kh nng ra gii mu flavonoid TNHC bng HPLC vi pha đng methanol và acetonitril . 116 DANH MC S  S đ 2.1 S đ kho sát quy trình chit hot cht t cây TNHC. 29 S đ 2.2 S đ kho sát chit hot cht t lá TNHC kt hp hai phng pháp SFE và phng pháp chit ngm kit vi cn 70% 32 S đ 3.1 S đ chit cao cn, P alcaloid và P flavonoid t lá TNHC 42 S đ 3.2 S đ chit alcaloid và flavonoid t r TNHC. 42 S đ 3.3 S đ chit alcaloid và flavonoid bt lá kt hp hai phng pháp chit. 45 S đ 3.4 S đ phân lp hp cht (2) và (3) t P alcaloid AL-SFE. 50 S đ 3.5 S đ chit alcaloid AL-SA hoc flavonoid FL-SA. 82 vii DANH MC CÁC BNG Bng 1.1: Alcaloid ca TNHC Crinum latifolium L. 11 Bng 3.1: Hiu sut chit (%) hot cht bng phng pháp ngm kit. 41 Bng 3.2: Kt qu kho sát nh hng thi gian lên hiu sut chit. 43 Bng 3.3: Kt qu kho sát nh hng ca áp sut lên hiu sut chit. 44 Bng 3.4: Kt qu tách phân đon mu AL-SFE và FL-NK bng VLC. 46 Bng 3.5: Các hp cht tinh khit phân lp đc t cao chit TNHC. 47 Bng 3.6: Kt qu phân lp alcaloid t phân đon ALS1. 48 Bng 3.7: Kt qu trin khai sc ký ct vi cht hp ph pha đo. 49 Bng 3.8: Kt qu phân lp (2) và (3) t P n–hexan. 49 Bng 3.9: Kt qu phân lp các (8), (9), (10) t P alcaloid AL-NK. 51 Bng 3.10: D liu ph NMR (Máy 500 MHz, CDCl 3 ) ca hp cht (2) 56 Bng 3.11: Các tng tác proton trên ph COSY, HMBC ca hp cht (2). 57 Bng 3.12: Kt qu đ tinh khit; hàm m bng phân tích nhit trng lng. 69 Bng 3.13: Thành phn pha đng và bc sóng phát hin ca quy trình xác đnh đ tinh khit ca các nguyên liu CC bng phng pháp HPLC. 70 Bng 3.14: Kt qu kho sát tính phù hp h thng quy trình phân tích HPLC. 70 Bng 3.15: Kt qu xác đnh đ tinh khit sc ký (%) các CC bng HPLC. 74 Bng 3.16: D liu ph UV-Vis, MS và đim chy ca các CC. 75 Bng 3.17: D liu ph IR ca các CC. 75 Bng 3.18: Kt qu đánh giá đng nht lô ca các CC sau khi đóng gói. 77 Bng 3.19: Kt qu phân tích robust A ca CC crinamidin. 79 Bng 3.20: Kt qu phân tích robust A ca CC 6-hydroxycrinamidin 79 Bng 3.21: Kt qu phân tích robust A ca CC hippadin. 80 Bng 3.22: Kt qu phân tích robust A ca CC lycorin. 80 Bng 3.23: Kt qu phân tích robust A ca CC astragalin. 81 [...]... có ngu n g c t c li u này c nghiên nh và c phân ph i trên th ng V i mong mu n góp ph n gi i quy t các b t c p hi n t i và góp ph n vào công tác m b o ch ng” cho c li u Trinh n hoàng cung, chúng tôi ti Nghiên c u thành ph n hóa h c, thi t l p ch tài: i chi u và xây d ng quy trình ki m nghi m thành ph n alcaloid và flavonoid cho cây Trinh n hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae” v i 4 m... 1 Chi t xu t cao c n alcaloid, n flavonoid và phân l p các h p ch t tinh khi t t cây Trinh n hoàng cung 2 Thi t l p m t s ch 3 Xây d ng quy trình hoàng cung b ng các 4 i chi u hóa h c có ngu n g c t cây Trinh n hoàng cung ng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh n s c ký l ng hi n di mao qu n xu t m t s ch tiêu c n thi t cho vi c xây d ng tiêu chu n ki m nghi m li u Trinh n hoàng cung c 3 T NG QUAN TÀI... t o thành b ãn trung tr ; 1 vòi nh i 3 ô, m i ô ch a nhi u noãn, u nh y chia 3 thùy Qu ng là nang n t t có n i nh [5] Chi Crinum có kho ng 130 loài Vi t Nam, chi Crinum các vùng nhi i, c n nhi i và vùng nóng c tr ng làm c nh và làm thu c: Crinum amabile Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr., Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F [4] 4 1.1.2 Cây Trinh N Hoàng. .. K t qu kh và isoquercitrin trong lá TNHC b a quy trình ng th i astragalin 96 1 TV Cây Trinh n hoàng cung (Crinum latifolium L – Amaryllidaceae) c s d ng ph bi n th c ph m ch c truy n và thu c hi Công d ng u phì i các d ng bào ch thu c i c quan tâm và ã c th nghi m lâm sàng i lành tính tuy n ti n li t trong cây v i các ch ph m K c c li u u tr cung, c cho là do tác d ng c a thành ph n alcaloid Crila,... 6 1.2.1 Thành ph n hóa h c c a các loài trong chi Crinum 1.2.1.1 Alcaloid c a chi Crinum Alcaloid khung crinin: ây là u thu c khung này v alcaloid khung này i di n cho alcaloid Crinum do ph n l n các 80 alcaloid ã c phân l p C u trúc các i theo 3 c u trúc sau [107], [116]: Hình 1.2: Các c u trúc hóa h c c a alcaloid khung crinin Alcaloid khung lycorin: l c x p th hai sau nhóm crinin v s ng alcaloid. .. 1.1: Hình v cây TNHC: 1 Cây v i thân hành và lá 2 C m hoa; 3 M t ph n bao hoa và b nh ; 4 B nh y “Ngu n: Nguy n Th N , 2007” [7] t th m i c a loài TNHC do nhóm tác gi Nguy n Th Ng c Trâm, Tr n Công Khánh nh trong qu n th Crinum Vi t nam là Trinh n Crila” có tên khoa h c Crinum latifolium L var Crilae Tram & Khanh, var n [32] 1.2 T NG QUAN HÓA H C C A CHI CRINUM VÀ CÂY TNHC Thành ph n hóa h c c a các... chi là tác d ng c a loài Crinum latifolium [31], [95], [139] Các h p ch t alcaloid tinh khi c phân l p t Trinh n hoàng cung (TNHC) lidin ã th c nghi m ch ng minh là có kh c n ch n l c s phát tri n c a các t c nghi m Thành ph n hóa h c và tác d ng sinh h c c r t nhi u công trình nghiên c ã 2013, có kho ng 30 công trình công b nghiên c u v l pháp quang ph c nhi u tác gi quan tâm và c công b v hai l i d... h n ch ng alcaloid toàn ph n [22]; ph n alcaloid [11], [106]; chi u [12], [24], [27] c này – (kho ng 6 công trình) : nh danh thành ng alcaloid d a trên 1 ch u ng d i 2 có công trình công b vi ng th i m t s alcaloid hay flavonoid trong lá TNHC n Vi v m b o ch qu n lý và ng c a nguyên li u và các ch ph m có thành ph n TNHC v n c th c hi n m t cách ch t ch Nguyên nhân ch y u là do thành ph n hóa h c c... sát tình phù h p h th ng c a quy trình ng th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b B ng 3.31: K t qu kh 88 chính xác c a quy trình ng th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng HPLC (n = 6) 90 B ng 3.32: K t qu kh a quy trình và isoquercitrin trong lá TNHC b nh ng th i astragalin (n = 9) 90 B ng 3.33: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng quy trình alcaloid trong lá TNHC b B ng... xác trung gian trong quy trình th i 6 alcaloid trong lá TNHC b 93 B ng 3.35: K t qu kh o sát t l ph c h i c a quy trình alcaloid trong lá TNHC b ng ng th i 6 (n = 9) 93 B ng 3.36: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng c a quy trình ng th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng CE (n = 6) 94 B ng 3.37: K t qu kh chính xác c a quy trình ng th i astragalin và isoquercitrin trong . carbohydrat: gm resin, pectin, hemicellulose, glucan và polysaccharid. Thân hành loài C. amabile cha 5,4 % saccharid; 8,7 % pectin, 8,2 % hemicellulose. Glucan A và B t loài C. latifolium, glucan A cha. và xây dng quy trình kim nghim thành phn alcaloid và flavonoid cho cây Trinh n hoàng cung - Crinum latifolium L. , Amaryllidaceae” vi 4 mc tiêu chính nh sau: 1. Chit xut cao cn,. VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ***** NGUYỄN HỮU L C THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, THIẾT L P CHẤT ĐỐI CHIẾU VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH KIỂM NGHIỆM THÀNH PHẦN