Khảo sát quá trình trích ly thu nhận flavonoid từ củ cải trắng

Nhận thức được đây là một loại nguyên liệu rẻ tiền và có giá trị về mặt dược liệu nhưng nước ta vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về củ cải trắng cũng như thu nhận các hợp chất flavonoid tron

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA VŨNG TÀU VIỆN KỸ THUẬT - KINH TẾ BIỂN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH TRÍCH LY THU NHẬN

FLAVONOID TỪ CỦ CẢI TRẮNG

Trình độ đào tạo: Đại học

TRƯỜNG ĐH BÀ RỊA VŨNGTÀU

VIỆN KỸ THUẬT – KINH TẾ BIỂN

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Vũng Tàu, ngày 20 tháng 03 năm 2017

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN

Họ và tên sinh viên: Lê Thị Ánh Nguyệt Giới tính: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 10/02/1995 Nơi sinh: BR-VT

ly, thời gian trích ly

- Tối ưu hóa quá trình trích ly nhằm xác định các điều kiện phù hợp nhất để thu nhận flavonoid từ củ cải trắng

3- Ngày giao nhiệm vụ: 19/02/2017

4- Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 21/06/2017

5- Giáo viên hướng dẫn: ThS Phạm Thị Kim Ngọc

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

(Ký và ghi rõ họ tên)

SINH VIÊN THỰC HIỆN (Ký và ghi rõ họ tên)

TRƯỞNG BỘ MÔN VIỆN TRƯỞNG

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là quá trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của Th.S Phạm Thị Kim Ngọc Các nội dung nghiên cứu, kết quả số liệu trong bài này

là trung thực Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại học

Bà Rịa Vũng Tàu đã giảng dạy, truyền đạt cho chúng tôi những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian qua và tạo mọi điều kiện để tôi có thể thực hiện tốt đồ

án tốt nghiệp

Đặc biệt tôi xin gởi lời cám ơn đến Th.S Phạm Thị Kim Ngọc đã tận tình giúp

đỡ, trực tiếp chỉ bảo, góp ý và hỗ trợ hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm đồ án Trong thời gian làm việc với Cô, ngoài việc tiếp thu thêm nhiều kiến thức bổ ích, tôi còn học tập được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả Đây là những điều rất cần thiết cho tôi trong quá trình học tập và làm việc sau này Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện thuận lợi nhất về phòng thí nghiệm cũng như các dụng cụ, và thiết bị để tôi có thể hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp

Xin ghi nhận sự giúp đỡ nhiệt tình của các bạn sinh viên khoá DH13TP dành

cho tôi trong quá trình thực hiện đồ án

Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, kiến thức còn hạn chế nên vẫn còn nhiều thiếu sót trong quá trình thực hiện đồ án Tôi kính mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của quý thầy cô để hoàn thiện hơn nữa đề tài đồ án tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn

Vũng Tàu, ngày 20 tháng 06 năm2017

Sinh viên

Lê Thị Ánh Nguyệt

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH III DANH MỤC BẢNG IV DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT V

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về củ cải trắng 2

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học 2

1.1.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng 3

1.1.3 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng 4

1.1.4 Công dụng của củ cải 6

1.2 Hợp chất flavonoid 7

1.2.1 Khái niệm 7

1.2.2 Phân loại 7

1.2.3 Tính chất lý hóa 8

1.2.4 Giá trị sinh học của flavonoid 9

1.2.5 Phương pháp thu nhận flavonoid 12

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 15

2.2 Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị và hóa chất 15

2.2.1 Nguyên liệu 15

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 16

2.3.1 Nội dung nghiên cứu 16

2.3.2 Bố trí thí nghiệm 16

2.3.3 Phương pháp phân tích 18

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 25

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện trích ly 25

3.1.1 Ảnh hưởng của loại dung môi 25

3.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi 26

3.1.3 Ảnh hưởng tỉ lệ dung môi và nguyên liệu 27

3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 29

3.1.5 Ảnh hưởng của thời gian 30

3.2 Tối ưu quá trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng phương pháp bề mặt đáp ứng SRM 31

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 36

Tài liệu tham khảo 37

PHỤ LỤC 40

Kết quả xử lý ANOVA cho các thí nghiệm 40

1 Khảo sát dung môi trích ly 40

2 Khảo sát nồng độ trích ly 42

3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi 44

4 Khảo sát nhiệt độ trích ly 46

5 Khảo sát thời gian trích ly 48

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Củ cải trắng 2

Hình 1.2 Khung sườn cơ bản của flavonoid 8

Hình 1.3 Các phân nhóm chính của flavonoid 8

Hình 1.4 Cơ chế ức chế của catechol với gốc tự do peroxy 11

Hình 1.5 Các vị trí của flavonoid có thể liên kết với các ion kim loại 11

Hình 2.1 Bột củ cải 17

Hình 2.2 Nội dung nghiên cứu 18

Hình 2.3 Đường chuẩn queretin dùng xác định TFC 21

Hình 2.4 Phản ứng tạo màu khi xây dựng đường chuẩn quercein 21

Hình 2.5 Phản ứng tạo màu khi xây dựng đường chuẩn galic 23

Hình 2.6 Đường chuẩn galic dung để xác định TPC 24

Hình 2.7 Đường chuẩn trolox dùng xác định khả năng khử ABTS* 23

Hình 3.1 Ảnh hưởng của dung môi trích ly 28

Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ dung môi trích ly 29

Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ : dung môi trích ly 30

Hình 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly 32

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 33

Hình 3.6 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và nhiệt độ đến TFC 37

Hình 3.7 Mô hình bề mặt đáp ứng thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly đến TFC 38

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 1 Giá trị dinh dưỡng trong 100g của cải 3

Bảng 2.1 Các bước xây dựng đường chuẩn acid galic 22

Bảng 2.2 Kết quả đường chuẩn galic 24

Bảng 2.3 Quá trình xây dựng đường chuẩn với dung dịch trolox chuẩn 23

Bảng 3.1 Kết quả thí nghiệm khảo sát loại dung môi 27

Bảng 3.2 Kết quả thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi 29

Bảng 3.3 Kết quả thí nghiệm khảo sát tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 31

Bảng 3.4 Kết quả thí nghiệm khảo sát nhiệt độ 32

Bảng 3.5 Kết quả thí nghiệm khảo sát thời gian 33

Bảng 3.6 Các yếu tố dung trong SRM 35

Bảng 3.7 Kế hoạch thực nghiệm và kết quả theo RSM để tối ưu TFC 35

Bảng 3.8 Phân tích phương sai của mô hình hồi quy 36

DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT

ABTS: Khả năng khử gốc tự do ABTS (mmol TEAC/g chất khô)

GAE (Galic Acid Equivalents): Tương đương acid galic

QE (Quercetin Equivalents): Tương đương quercetin

TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity): Khả năng chống oxi hóa tương đương trolox

SRM: Reponse Surface Methods

TFC (Total Flavonoid Content): Hàm lượng flavonoid tổng (mg QE/g chất khô)

TPC (Total Phenolic Content): Hàm lượng phenolic tổng (mg GAE/g chất khô)

Việt Nam là một nước khí hậu nhiệt đới vì vậy rau củ cũng đa dạng và phong

phú Củ cải trắng (Raphanus sativus L.) là loại củ phổ biến, rẻ tiền và ngày càng

được dùng nhiều ở Việt Nam

Nhận thức được đây là một loại nguyên liệu rẻ tiền và có giá trị về mặt dược liệu nhưng nước ta vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về củ cải trắng cũng như thu nhận

các hợp chất flavonoid trong củ cải trắng vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài “Khảo sát quá trình trích ly thu nhận flavonoid từ củ cải trắng” nhằm khảo sát các yếu

tố ảnh hưởng và tìm ra điều kiện tối ưu nhất để thu nhận các hợp chất flavonoid trong củ cải trắng phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về củ cải trắng

1.1.1 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm sinh học

Củ cải có tên khoa học là Raphanus sativus L., là một loại rau ăn củ thuộc họ

Cải đã được thuần hóa ở châu Âu trước thời La Mã, được trồng và tiêu thụ trên toàn

thế giới Phân loại theo tên khoa học như sau:

Có thể dùng để lấy củ, ăn sống, làm dưa muối…

Củ cải có nhiều giống, chúng khác nhau về kích thước, màu sắc, độ dài và thời gian canh tác Củ cải có hình tròn đến hình trụ với màu sắc khác nhau, từ màu trắng đến màu đỏ Hình dạng rễ củ phình to, dài lên đến 15 cm, thích hợp cho việc nấu ăn, trong khi đó, rễ củ hình tròn nhỏ hơn thường được ăn sống trong món salad Thịt củ ban đầu có vị ngọt nhưng sẽ bị đắng nếu ở lại trong đất quá lâu [20]

Củ cải là loại rau ăn củ dễ trồng, thời gian sinh trưởng ngắn, nhanh cho thu hoạch và có thể trồng nhiều vụ trong năm Phần thu hoạch chính của củ cải trắng là

củ, vì vậy để đạt được năng suất cao cần tạo điều kiện để củ cải sinh trưởng tốt nhất Chọn nơi có nhiệt độ khoảng 18-290C, đất thịt nhẹ hoặc cát pha, tơi xốp, nhiều mùn hoặc đất phù sa, thoát nước tốt Tùy theo giống nhưng thường 45 - 50 ngày sau gieo

là có thể thu hoạch, nếu thu hoạch quá muộn củ cải sẽ bị giảm chất lượng

1.1.2 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng

Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng của củ cải được thể hiện ở Bảng 1.1

Củ cải có chứa nhiều carbohydrat, kali, magiê, đồng, canxi, vitamin, các hợp chất có hoạt tính sinh học bao gồm anthocyanin, glucosinolat, isothiocyanat, các flavonoid và nhiều loại hợp chất phenolic khác [32]

Bảng 1.1 Giá trị dinh dưỡng trong 100 g của cải

Giá trị dinh dưỡng trong 100g

Vitamin và khoáng chất: Hàm lượng vitamin C chiếm khoảng 0,015% trong

100 g củ cải tươi Hàm lượng vitamin C trong rễ củ cải bị ảnh hưởng nhiều với điều kiện chiếu sáng và phân bón [19] Củ cải là một nguồn giàu vitamin B9, B6, B3, B2,…Rễ củ cải muối có chứa nguyên tố vi lượng như: nhôm, bari, lithium, mangan, silic, titan, flo và i-ốt [25]

1.1.3 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng

Các nghiên cứu đã công bố cho thấy trong củ cải trắng có chứa nhiều hợp chất thứ cấp có lợi cho sức khỏe con người

Enzyme: trong củ cải trắng đã tìm thấy sự hiện diện của các enzyme invertase,

cellulase, ß-galactosidase, protease, peroxidase, catalase, sucrase, amylase, alcohol dehydrogenase, pyruvic carboxylase, glutathione reductase [26] và raphanin [19] Trong số này, catalase và glutathione reductase là 2 enzyme có tác dụng như những chất chống oxi hóa bậc 2, góp phần ngăn chặn sự tạo thành các gốc tự do Ngoài ra, raphanin, một protease trung tính có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm mạnh cũng được tìm thấy trong củ cải trắng

Acid hữu cơ: chủ yếu gồm acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid

erythorbic, acid erucic, acid gentisic, acid hydrocinnamic, acid salicylic và acid vanillic [28]

Các hợp chất phenolic: các flavonoid được tìm thấy trong củ cải trắng gồm

quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin, luteolin, catechin và rutin [21] Các acid

phenolic có mặt trong củ cải trắng bao gồm caffeic, p-coumaric, ferulic, hydroxycinnamic, p-hydroxybenzoic, vanillic, salicylic, acid gentisic [29], acid

syringic và phenyl pyruvic [19] Anthocyanidin cũng được tìm thấy trong củ cải trắng nhưng với hàm lượng nhỏ, ngoại trừ pelargonidine, delphinidin và cyanidine,

là những chất tạo màu cho củ cải đỏ, hồng hoặc tía [29]

Các hợp chất isothiocyanate: gồm 4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate

(raphasatin), 4-(methylthio) butyl isothiocyanate (erucin) [23], allyl isothiocyanate, benzyl isothiocyanate và phenethyl isothiocyanate đã được ghi nhận là có mặt trong thành phần của củ cải trắng

Ngoài các thành phần trên, trong củ cải trắng còn có các hợp chất tannin, alkaloid, coumarin, gibberellin và các hợp chất có chứa lưu huỳnh

Koo Hui Miean và cộng sự (2001) đã nghiên cứu hàm lượng các flavonoid phổ biến gồm myricetin, quercetin, kaempferol, luteolin và apigenin trong 62 loại thực vật ăn được, bao gồm cả củ cải trắng Mẫu thực vật được rửa sạch, sấy khô, xay nhỏ thành bột Trích ly bằng dung môi methanol 50% có pha 1,2M HCl (để thực hiện quá trình thủy phân các flavonoid ở dạng glycoside thành dạng aglycon) trong 2 giờ

ở 900

C bằng phương pháp trích ly hồi lưu Dịch sau trích được lọc, thu dịch, định mức lên 50 ml, lọc lại qua giấy lọc 0,45 µm Dịch sau lọc dùng làm mẫu phân tích HPLC để xác định hàm lượng các flavonoid HPLC pha đảo được tiến hành trên cột Nova-Pak C18, đường kính 3,9 mm, dài 150 mm, sử dụng hệ dung môi pha động là methanol/nước (1:1, v/v), pH 2,5 với acid triflouroacetic, đầu dò UV 365 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid tổng trong củ cải trắng là 65 mg/kg, trong đó quercetine là 17,5 ± 0,05 mg/kg, luteolin 9,0 ± 0,07 mg/kg và kaempferol là 31,5 ± 0,05 mg/kg

R Jakmatakul và cộng sự (2009) đã so sánh khả năng ức chế tyrosinase và hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết methanol và nước ép từ củ cải trắng Thái Lan lạnh đông chậm nhằm xác định tiềm năng làm trắng da và chống lão hóa trong các ứng dụng mỹ phẩm Kết quả nghiên cứu công bố cho thấy nước ép từ củ cải lạnh đông chậm có hàm lượng các hợp chất phenolic, flavonoid và acis ascorbic cao hơn trong dịch chiết methanol, khả năng khử các gốc tự do (DPPH, superoxide, oxi đơn)

và ức chế tyrosinase của nước ép cũng cao hơn so với dịch chiết methanol Nghiên cứu cũng đã xác định được giá trị IC50 cho khả năng ức chế tyrosinase của dịch chiết methanol là 9,62 mg/ml và và của nước ép là 3,09 mg/ml Do đó, tác giả cũng

đề nghị về việc xem xét hướng nghiên cứu sử dụng R.sativus vào công nghệ mỹ

phẩm dưỡng da

Ali Ghasemzadeh và cộng sự (2012) cũng đã nghiên cứu thành phần flavonoid

và hoạt tính chống oxi hóa của một số loài cây nhiệt đới ở Malaysia gồm bắp cải, ớt xanh, ớt đỏ, rau dền, củ cải trắng, xả và nghệ Flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp của Chen (1998), các flavonoid thành phần được xác định bằng HPLC Kết quả cho thấy trong củ cải trắng Malaysia có hàm lượng flavonoid tổng

là 0,098 ± 0,012 mg/g chất khô [30] với ít nhất 5 loại flavonoid gồm quercetin, catechin, kaemferol, apigenin và rutin với hàm lượng lần lượt là: 0,016; 0,057; 0,039; 0,014 và 0,012 mg/g chất khô Một kết quả cao hơn đã được ghi nhận trong nghiên cứu của D Marinava và cộng sự (2005) trên một số loài rau và trái cây của Bulgari Theo đó, trong củ cải trắng Bulgari có chứa các hợp chất phenolic và flavonoid với hàm lượng tương ứng là 160 mg/g và 48,5 mg/g

1.1.4 Công dụng của củ cải

Củ cải cung cấp nhiều lợi ích về sức khỏe và dinh dưỡng

Củ cải là một trong những loại rau củ rất ít calo Củ tươi chỉ cung cấp 16 calo trên 100 gram Tuy nhiên, nó là một nguồn tuyệt vời của chất chống oxi hóa, chất điện giải, chất khoáng và vitamin

Củ cải giòn và ngon ngọt, thường dùng để ăn sống và đang được dùng rất phổ biến trong món salad, nấu chín hoặc hấp Củ cải được nấu chín cùng với các loại rau quả khác hoặc sử dụng làm nguyên liệu nhồi cho món mooli parantha ở Ấn Độ Kim chi củ cải là một đặc sản của truyền thống Hàn Quốc

Các phần khác nhau của củ cải được sử dụng trong y học để điều trị các bệnh khác nhau như rối loạn chức năng gan, các bệnh truyền nhiễm, viêm phế quản, trị bỏng, vết bầm tím và mùi hôi ở bàn chân

Hoạt tính sinh học của củ cải được khuyến khích để điều trị các bệnh khác nhau, bao gồm bệnh ho gà, bệnh ung thư, khó tiêu, các vấn đề túi mật, viêm khớp, sỏi mật, sỏi thận, bệnh giang mai, ký sinh trùng đường ruột và được sử dụng trong việc chữa các chứng rối loạn khác nhau của dạ dày

Tại khu vực Đông Nam Á, củ cải được nghiền và sử dụng như một loại thuốc đắp để điều trị đau thấp khớp, bỏng hoặc vết bầm tím Nước ép củ cải được xem như là một phương thuốc trị ho và tiêu chảy

1.2 Hợp chất flavonoid

1.2.1 Khái niệm

Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo màu cho rất nhiều loại rau, hoa và quả Flavonoid tồn tại phổ biến trong thực vật, được tìm thấy trong tất

cả các bộ phận của thực vật: lá, hoa, rễ, hạt, quả

Hình 1.2 Khung sườn cơ bản của flavonoid Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là gồm 2 vòng benzen (vòng A và B) nối với nhau qua 1 dây 3 carbon (vòng pyron - vòng C), nên thường được gọi là khung cacbon C6-C3-C6 Trừ một số trường hợp mạch 3C hở như chalcone, đa số trường hợp mạch 3C đóng vòng với vòng A và tạo nên dị vòng

C chứa oxy [32]

1.2.2 Phân loại

Flavonoid được chia thành ba phân nhóm chính: euflavonoid phenylbenzopyrans), isoflavonoid (3-benzopyrans) và neoflavonoid (4-benzopyrans) Trong mỗi nhóm này các flavonoid lại được chia thành các nhóm phụ khác nhau dựa vào sự khác biệt trong cấu tạo của vòng C [33]

(2-Hình 1.3 Các phân nhóm chính của flavonoid

(A: euflavonoid, B: iso-flavonoid, C: neo-flavonoid)

 Phân nhóm của euflavonoid gồm các nhóm phụ: flavan, flavan 3-ol (catechin), flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone

 Phân nhóm isoflavonoid gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-ol, isoflavon, isoflavanon, rotenoid…Thường gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu

 Neoflavon chỉ giới hạn trong một số cây gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman, 4-aryl-coumarin, dalbergion

Ngoài ra, người ta còn phân loại flavonoid thành flavonoid, biflavonoid, triflavonoid và flavonlignan [33]

1.2.3 Tính chất lý hóa

Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng liên kết với đường (glycoside) Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme sẽ giải phóng ra đường và aglycon Các đường thường gặp nhất là D-glucose, D-galactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose [33]

Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether, methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid Glycoside: tan trong ethanol, methanol Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch đường càng dài thì tan tốt trong nước nóng Các flavonoid glycoside có nhóm -OH tại vị trí C7 còn tan được trong dung dịch NaOH, Na2CO3, NaHCO3 do có tính acid Các flavonoid dạng aglycon thường dễ kết tinh, trong khi các glycoside thường khó kết tinh hơn [33]

Các flavonoid thường có màu Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ Các isoflavon, flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin, delphinidin…tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái [32,33]

Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với

pH, nhiệt độ và ánh sáng Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm

có màu đặc trưng

Hệ thống nối đôi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại Thường thu được 2 dải hấp thu cực đại, dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [33]

1.2.4 Giá trị sinh học của flavonoid

1.2.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa

Gần đây, các hợp chất flavonoid đã được coi là chất chống oxi hóa mạnh mẽ trong ống nghiệm và được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C, vitamin E và carotenoids [35]

Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hoãn, ức chế, hoặc ngăn chặn quá trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [35, 36] Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến quá trình oxi hóa của một loại đại phân tử sinh học, như các enzym, protein, DNA và lipid [10,11] Stress oxi hóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thoái hóa mãn tính bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa [31,35]

Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng:

 Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vòng thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi hóa khử, bắt giữ các gốc tự do;

 Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự

do

 Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [31,35].Quá trình chống oxi hóa của flavonoid chủ yếu theo 3 cơ chế sau:

 Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxi hóa khử thấp: các hợp chất flavonoid nhờ thế oxi hóa khử thấp nên có thể khử các gốc tự do bằng cách nhường ngyên tử hidro hoặc một electron cho gốc tự do [34]

Hình 1.4 Cơ chế ức chế của catechol với gốc tự do peroxy [31]

 Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách liên kết với các ion kim loại lượng tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do[34]

Hình 1.5 Các vị trí của flavonoid có thể liên kết với các ion kim loại [31]

 Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do [34]

Hoạt tính chống oxi hóa của các flavonoid chịu ảnh hưởng từ đặc điểm cấu tạo của chúng: số lượng và vị trí của các nhóm hydroxyl và các nhóm thế khác trên các vòng, loại nhóm thế Ví dụ: hydro nằm ở vị trí ortho của vòng B có khả năng cho hydro cao nhất, tạo gốc tự do ổn định; nhóm thế CH2=CH-COOH sẽ giúp tăng cường hoạt tính chống oxi hóa hơn nhóm thế -COOH; sự hiện diện của catechol ở vòng B cũng giúp tăng cường hoạt tính chống oxi hóa [32, 36]

Nghiên cứu của Bùi Hữu Trung và Nguyễn Thị Thanh Mai (2009) về hoạt tính

ức chế gốc tự do NO.

với cấu trúc của các hoạt chất cô lập từ hoa cúc trắng đã ghi

nhận sự liên quan giữa cấu trúc của flavonoid với khả năng ức chế gốc tự do NO.

Cụ thể, nếu nhóm -OH nằm ở vị trí B3' và B4' cho hoạt tính ức chế cao hơn các vị trí còn lại Đối với các chất mà phân tử có nhóm đường thì hoạt tính chống oxi hóa giảm hẳn Đặc biệt nhóm -OH tại vị trí B4' có hoạt tính lớn hơn hẳn so với B3' Khi nhóm -OH hiện diện cả hai vị trí B3', B4' thì hoạt tính ức chế NO rất mạnh Đặc biệt, khi so sánh với chất chuẩn quercetin, cho thấy nhóm -OH nằm ở vị trí C3 làm tăng hoạt tính ức chế NO rất mạnh với IC50 là 18.3 μM Ngoài ra, nối đôi giữa C2 và C3cũng làm tăng hoạt tính Trong khi đó, thì nhóm metoxy ở các vị trí trên vòng B làm tăng hoạt tính của các hợp chất khảo sát Nhóm -OH trên vòng A hầu như có hoạt tính ức chế NO rất thấp Nhìn chung, khả năng ức chế gốc tự do của nhóm flavonoid là nhờ vào số lượng và vị trí nhóm -OH trên vòng B quyết định Đồng thời, nó còn chịu ảnh hưởng do cấu trúc cộng hưởng kéo dài của các vòng phenol [38]

1.2.4.2 Tác dụng ức chế vi sinh vật, chống viêm nhiễm

Dịch chiết flavonoid từ quả mơ cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển

của S.aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với đường kính

vòng ức chế tương ứng là 23, 21, 26 và 29 mm Kết quả tương tự đối với dịch chiết

flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.coli, P.aeruginosa, B.subtilis và

S.aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và 50 µg/ml Các flavonoid

5,7-dimethoxyflavanone-4’-O-β-D-glucopyranoside; nicotiflorin; rutin;

naringenin-7-O-β-D-glucopyranoside; 5,7-dimethoxyflavanone

4’-O-[2’’-O-(5’’’-O-trans-cinnamoyl)--D-glucopyranoside; và 5, 7, glucopyranoside có khả năng ức chế đối với sự phát triển của 10 chủng Klebsiella

3’-trihydroxy-flavanone-4’-O-β-D-pneumoniae khác nhau ở nồng độ 32 - 64 μg/ml, trong khi đó mẫu đối chứng dùng

ampicillin không làm được điều này Quercetin làm giảm đáng kể tình trạng viêm

nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter pylori trong niêm mạc dạ dày

của chuột bạch [37]

1.2.4.3 Tác dụng đối với enzyme

Dẫn xuất 6-hydroxy luteolin của luteolin có thể ức chế sự hoạt động của

enzyme α-glucosidase đến 92% ở nồng độ 500 μM Một số flavonoid cũng đã cho

thấy hoạt tính ức chế đối với enzyme xanthine oxidase, enzyme xúc tác cho sự oxi hóa xanthine và hypoxanthine thành acid uric [36]

1.2.4.4 Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường

Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng các flavonoid tự nó có vai trò như chất kích thích insulin hay bắt chước chức năng của insulin; ngoài ra chúng còn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong quá trình chuyển hóa đường…[36]

1.2.4.5 Tác dụng đối với ung thư

Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất flavonoid, gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro và in vivo của flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau Quercetin có tác dụng ức chế sự phát triển của các tế bào ung thu tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u Naringenin

và kaempferol-3-O- (2”, 6”-di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu nhận từ hoa của

Melastoma malabathricum L cũng đã được tìm thấy là có khả năng ức chế sự tăng

sinh của dòng tế bào ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,28 µM và 1,3

µM [30]

1.2.5 Phương pháp thu nhận flavonoid

Quy trình chung của quá trình thu nhận flavonoid từ thực vật được thể hiện trong sơ đồ hình 1.6

Đầu tiên, mẫu thực vật dùng nghiên cứu sau khi thu gom sẽ trải qua quá trình sơ chế chuẩn bị để có dạng mẫu phù hợp cho nghiên cứu Quá trình sơ chế chủ yếu là rửa sạch, loại các phần hư hỏng và tạp chất, cắt nhỏ mẫu

Sau đó mẫu sẽ qua quá trình chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu Quá trình chuẩn bị mẫu chủ yếu là tạo mẫu ở dạng tươi hay khô Bảo quản lạnh mẫu nếu mẫu nghiên cứu là mẫu tươi (bảo quản lạnh thường và bảo quản lạnh đông) hoặc sấy khô mẫu nếu mẫu nghiên cứu là mẫu khô (sấy đối lưu, sấy chân không, sấy thăng hoa) Ngoài ra, một số quy trình còn có quá trình xử lý mẫu như: chần hoặc hấp để ức chế một số enzyme có trong mẫu, nghiền nhỏ mẫu, xử lý với các enzyme pectinase, cellulase, protease, amylase để phá vỡ thành tế bào và một số liên kết hóa học nhất định, giải phóng các chất hòa tan bên trong hoặc lên men rồi đưa vào trích ly để thu nhận flavonoid

Quá trình trích ly có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, gồm:

 Các phương pháp truyền thống: chiết bằng thiết bị Soxhlet, chiết ngấm kiệt

và chiết ngâm dầm Trong đó, chiết ngấm kiệt có đối lưu dòng dung môi và ngâm dầm có khuấy trộn có ưu điểm là thiết bị đơn giản, đồng thời trích ly được một lượng mẫu lớn và có thể đạt hiệu suất trích ly cao đối với chất hòa tan cũng như các hoạt chất sinh học Tuy nhiên, lại cần nhiều thời gian, tốn dung môi, dung môi sử

Hình 1.1 Quy trình thu nhận flavonoid từ thực vật

dụng phải tinh khiết, nồng độ chất nghiên cứu trong dịch chiết thu được thấp, phải tốn nhiều thời gian và công sức để loại dung môi ra khỏi dịch chiết để thu cao Chiết bằng thiết bị soxhlet có ưu điểm tiết kiệm dung môi hơn, ít tốn thời gian, nồng

độ chất chiết trong dịch trích ly cao Tuy nhiên, không thể tiến hành cùng lúc một lượng lớn mẫu cùng lúc và hợp chất có thể bị ảnh hưởng do nhiệt độ cao trong quá trình trích ly

 Các phương pháp hiện đại: trích ly có sự hỗ trợ của:

Sóng siêu âm (UAE)

Xung điện (PEF)

Enzyme (EAE)

Vi sóng (MAE)

Áp suất cao (PLE)

Chất lỏng siêu tới hạn (SFE)

Các phương pháp trích ly hiện đại sẽ rút ngắn được thời gian trích ly, giảm lượng dung môi phải sử dụng nhưng hiệu quả thu hồi vẫn gần bằng và cao hơn so với phương pháp trích ly chỉ dùng nhiệt độ và dung môi đối lưu Hiệu quả quá trình còn phụ thuộc vào các thông số kỹ thuật đặc trưng của từng phương pháp Tuy nhiên, nhược điểm của các phương pháp trích ly hiện đại là đòi hỏi phải có thiết bị phù hợp và chi phí cũng cao hơn

Dịch sau trích ly được đem cô giảm áp để loại dung môi, thu cao chiết thô chứa flavonoid Cao này sau cùng sẽ trải qua các quá trình tinh chế để tách riêng phần flavonoid Có một số phương pháp khác nhau để thực hiện quá trình này, chủ yếu dựa trên kỹ thuật chiết lỏng lỏng hoặc kỹ thuật chiết pha rắn (SPE: solid phase extraction) Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị nhưng có nhược điểm là hiệu quả thu hồi thấp, dễ gây sai số, tốn thời gian và dung môi Ngày nay, SPE được sử dụng phổ biến vì tốn ít thời gian, cho kết quả nhanh, tiện lợi, hiệu quả về mặt kinh tế và có thể hoàn toàn tự động [35]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của ngành Công nghệ Thực phẩm, viện Kỹ thuật và Kinh tế Biển, trường Đại học Bà Rịa-Vũng Tàu Thời gian thực hiện: 06/02/2017 - 19/06/2017

2.2 Nguyên liệu, dụng cụ thiết bị và hóa chất

Máy đo quang

Bể điều nhiệt

Lọc chân không

Các dụng cụ thông thường trong phòng thí nghiệm

 Hóa chất

Trolox, acid gallic, quercetin, ABTS (Sigma)

Thuốc thử Folin – Ciocalteu (Sigma)

Putassium persulfate

Nhôm clorua

Natri cacbonat

Kali acetat

Các dung môi: ethanol, ethyl acetate, methanol, chloroform

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nội dung nghiên cứu

2.3.2 Bố trí thí nghiệm

Các yếu tố sau đây đươc cố định trong toàn bộ nghiên cứu: phương pháp trích

ly sử dụng là phương pháp chưng ninh, lượng mẫu cho mỗi một thí nghiệm là 1g

Tối ưu quá trình trích ly

Loại dung môi

2.3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi

Yếu tố khảo sát: loại dung môi sử dụng gồm ethanol 900, methanol, chlorofom

và ethyl acetate

Yếu tố cố định

+ Thời gian trích ly: 4 giờ

+ Nhiệt độ trích ly: 600C

+ Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi = 1:20 (g/ml)

+ Nồng độ dung môi: nguyên chất

Yếu tố đo đạc: hàm lượng flavonoid tổng (TFC), phenolic tổng (TPC) và khả năng khử gốc tự do ABTS* (ABTS)

2.3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung môi sử dụng

Yếu tố khảo sát: nồng độ dung môi phù hợp cho trích ly gồm các mức là 100,

75, 50, 25, 0 (v/v)

Yếu tố cố định

+ Thời gian trích ly: 4 giờ

+ Nhiệt độ trích ly: 600C

+ Tỉ lệ nguyên liệu: dung môi = 1:20 (g/ml)

+ Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1

Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS

2.3.2.3 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi

Yếu tố khảo sát: tỉ lệ nguyên liệu: dung môi ở 4 mức 1:10, 1:20, 1: 30, 1: 40 (g/ml)

Yếu tố cố định

+ Thời gian trích ly: 4 giờ

+ Nhiệt độ trích ly: 600C

+ Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1

+ Nồng độ dung môi từ kết quả 2.3.2.2

Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS

2.3.2.4 Khảo sát nhiệt độ trích ly

Yếu tố khảo sát: nhiệt độ trích ly ở 5 mức 400C, 500C, 600C, 700C

Yếu tố cố định

+ Thời gian trích ly: 4 giờ

+ Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1

+ Nồng độ dung môi từ kết quả 2.3.2.2

+ Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi từ kết quả 2.3.2.3

Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS

2.3.2.5 Khảo sát thời gian trích ly

Yếu tố khảo sát: nhiệt độ trích ly ở 5 mức 2; 2,5; 3; 3,5 và 4 giờ

Yếu tố cố định

+ Loại dung môi: từ kết quả 2.3.2.1

+ Nồng độ dung môi từ kết quả 2.3.2.2

+ Tỉ lệ nguyên liệu và dung môi từ kết quả 2.3.2.3

+ Nhiệt độ trích ly từ kết quả 2.3.2.4

Yếu tố đo đạc: TFC, TPC và ABTS

2.3.2.6 Tối ưu hóa trích ly flavonoid từ củ cải trắng

Các thí nghiệm đơn yếu tố được tiến hành nhằm sơ bộ xác định các điểm tại tâm Quá trình tối ưu các thông số của quá trình trích ly được thực hiện bằng phương pháp quy hoạch thực ngiệm theo mô hình Box-Wilson dạng CCC

2.3.3 Phương pháp phân tích

2.3.3.1 Xác định hàm lượng flavonoid tổng (TFC) [10]

Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chan và cộng sự (2002) dựa trên nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung dịch AlCl3 Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở bước sóng 415 nm Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu

 Xây dựng đường chuẩn quercetin:

Pha dung dịch quercetin 100 ppm trong dung dịch cồn 80%

Từ dung dịch chuẩn quercetin 100pm, tiếp tục pha ra thành các dung dịch có nồng độ 75, 50, 25, 12,5, 6,25 và 3,125 ppm

Ứng với mỗi nồng độ dung dịch pha loãng hút 0,5 ml cho vào ống nghiệm sau

đó cho vào: 1,5 ml ethanol 95%; 0,1ml AlCl310%; 0,1 ml CH3COOK 1M; và 2,8 ml nước cất

Lắc đều để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút Đo màu ở 415 nm, mẫu trắng thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3 bằng nước cất

Hình 2.3 Đường chuẩn queretin dùng xác định TFC

a Mẫu trước khi phản ứng b Mẫu sau khi phản ứng

a V n TFC

0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12