Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Và Đánh Giá Tác Dụng Diệt Tế Bào Ung Thư Của Lá Xạ Đen

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll & Mor) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC HÀ NỘI – 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN (Ehretia asperula Zoll & Mor) CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS NGUYỄN TIẾN ĐẠT HÀ NỘI - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Nếu khơng nêu trên, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm đề tài Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Thủy ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Tiến Đạt, Trung tâm nghiên cứu Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa Học Công nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn suốt trình học tập thực nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Lãnh đạo Viện Y sinh nhiệt đới – Trung tâm Nhiệt đới Việt – Nga bạn đồng nghiệp phòng Thích nghi Y học quân tạo điều kiện giúp đỡ tơi suốt q trình thực hiện, bảo vệ luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, cán nghiên cứu phòng Hoạt tính Sinh học - Viện Hóa sinh biển, phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm khoa học Cơng nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Luận văn tiến hành hỗ trợ đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học, đánh giá hoạt tính sinh học số hợp chất phân lập từ Xạ đen tỉnh Hồ Bình Thử nghiệm tạo chế phẩm làm thực phẩm chức từ cao chiết tiềm năng”, GS TS Đặng Đình Kim, Viện Cơng nghệ mơi trường, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cảm ơn GS TS Đặng Đình Kim, ThS Vũ Thị Nguyệt nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin cảm ơn gia đình thân u, bạn bè, người thân đồng nghiệp – người bên tơi, ln động viên, khích lệ chỗ dựa vững cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Thu Thủy iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi KÝ HIỆU VIẾT TẮT vii LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu Xạ đen 1.1.1 Đặc điểm sinh thái phân bố 1.1.2 Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoạt tính sinh học hợp chất xạ đen 1.1.3 Tác dụng sinh học 12 1.1.4 Một số thuốc y học cổ truyền: 13 1.2 Giới thiệu chung phương pháp Sắc kí 13 1.2.1 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (SKLM) 13 1.2.2 Phương pháp sắc ký cột 17 1.3 Sơ phương phác xác định cấu trúc 19 1.3.1 Phổ khối lượng MS 20 1.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 21 1.3.3 Phổ 1H-NMR 22 1.3.4 Phổ 13C-NMR 22 1.3.5 Phổ DEPT 23 1.3.6 Phổ 2D-NMR 23 1.4 Giới thiệu số phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 25 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 27 2.1 Mẫu thực vật 27 iv 2.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất 28 2.2.1 Dụng cụ thiết bị chiết tách mẫu 28 2.2.2 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 29 2.2.3 Hoá chất 29 2.2.4 Dòng tế bào (cell lines) 30 2.3 Chiết phân đoạn 30 2.4 Phân lập số hợp chất xạ đen 32 2.4.1 Phân lập hợp chất Ed 3.2 Ed 5.5 33 2.4.2 Phân lập hợp chất Ed 17.3 35 2.4.3 Phân lập hợp chất Ed 11.4 36 2.5 Hằng số vật lý số liệu phổ nghiệm 37 2.5.1 Hợp chất Ed 3.2 37 2.5.2 Hợp chất Ed 5.5 37 2.5.3 Hợp chất Ed 17.3 38 2.5.4 Hợp chất Ed 11.4 38 2.6 Phương pháp thử khả gây độc tế bào (cytotoxicity) 39 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 Hợp chất 1: Ed 3.2 42 3.2 Hợp chất 2: Ed 5.5 44 3.3 Hợp chất 3: Ed 17.3 47 3.4 Hợp chất 4: Ed 11.4 50 3.5 Kết thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào 54 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 4.1 KẾT LUẬN 56 4.2 KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC PHỔ 62 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ehretia asperula Zoll & Mor Hình 1.2: Cấu trúc số hợp chât theo tài liệu Hình 1.3: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu Hình 1.4: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu 10 Hình 1.5: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu 11 Hình 1.6: Cấu trúc số hợp chất theo tài liệu 12 Hình 2.1 Mẫu Xạ đen thu Hòa Bình 27 Hình 2.2 Mẫu tiêu Xạ đen giám định 28 Hình 2.3 Sơ đồ chiết phân đoạn, phân lập cao xạ đen 32 Hình 2.4 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 3.2 Ed 5.5 34 Hình 2.5 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 17.3 35 Hình 2.6 Sơ đồ phân lập hợp chất Ed 11.4 36 Hình 3.1 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 3.2 42 Hình 3.2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 5.5 44 Hình 3.3 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 5.5 45 Hình 3.4 Phổ DEPT hợp chất Ed 5.5 45 Hình 3.5 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 17.3 47 Hình 3.6 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 17.3 48 Hình 3.7 Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 11.4 50 Hình 3.8 Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 11.4 51 Hình 3.9 Phổ hai chiều HSQC hợp chất Ed 11.4 52 Hình 3.10 Phổ hai chiều HMBC hợp chất Ed 11.4 52 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính sinh học cắn chiết xạ đen vi khuẩn Gram dương Gram âm Bảng 3.1 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR Ed 3.2 với số liệu phổ 1HNMR caffeic acid 43 Bảng 3.2 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR Ed 5.5 với số liệu phổ 1H-NMR Methyl caffedte 46 Bảng 3.3 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR Ed 17.3 với số liệu phổ 1H-NMR Rosmarinic acid 49 Bảng 3.4 Bảng so sánh số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR Ed 11.4 với số liệu phổ 1H-NMR Methyl rosmarinate 53 Bảng 3.5: Kết hoạt tính gây độc tế bào 54 vii KÝ HIỆU VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Việt Ehretia asperula Zoll & Mor Xạ đen C-NMR Carbon (13) Nucleaedr Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13) H-NMR Hydro (1) Nucleaedr Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1) DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT HMBC Polarization Transfer Phổ tương tác dị hạt nhân qua Heteronucleaedr Multiple Bond nhiều liên kết Coherence HSQC Heteronucleaedr Single Quantum Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết δ Chemical shift Độ chuyển dịch hóa học ppm Part per million Một phần triệu Ed 13 Tiếng Anh s Singlet d Doublet dd Double of doublet Rf retardation factors Hep-G2 Phát triển chậm Human hepatocellular carcinoma Tế bào Ung thư gan Human lung adenocarcinoma Tế bào Ung thư phổi Human breaedst adenocarcinoma Tế bào Ung thư vú HeLa cervical cancer cells Tế bào Ung thư cổ tử cung HeLa W Water nước D Dichloromethane H n-Hexane M Methanol E Ethyl acetate A Acetone LU-1 MCF-7 HeLa LỜI MỞ ĐẦU Vai trò quan trọng hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học khẳng định từ y học cổ truyền y học đại Giá trị chúng khơng có cơng dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà dùng làm ngun mẫu cấu trúc dẫn đường cho phát phát triển nhiều dược phẩm Việt Nam đánh giá có nguồn tài nguyên dược liệu phong phú có nhiều kinh nghiệm sử dụng nguồn dược liệu nhờ vào y học cổ truyền lâu đời Theo thống kê Việt Nam có 13000 lồi thực vật khoảng 4000 lồi sử dụng làm thuốc Đây lợi để khai thác nguồn dược liệu phục vụ cho sống Các nghiên cứu hoá học theo định hướng hoạt tính sinh học đường ngắn hiệu để tìm kiếm có chọn lọc hoạt chất từ nguồn tài nguyên thiên nhiên Ung thư coi bệnh nan y khả kháng thuốc, gây di mạnh tế bào ung thư Chính thế, việc phát triển loại dược phẩm đặc trị ngăn ngừa trình di ung thư vấn đề cấp thiết y học đại Cây xạ đen có tên khoa học Ehretia asperula Zoll & Mor, họ Vòi Voi (Boraginaceae) Xạ đen phân bố chủ yếu tỉnh Sơn La, Hà Nam, Quảng Ninh, Hòa Bình, chúng mọc tự nhiên rừng Xạ đen thân gỗ mọc leo thành bụi, nhánh non tròn, khơng lơng Dài trung bình 5-7m có tới hàng chục mét, thân già vỏ nâu đốm trắng, chồi non có màu tím đỏ Tại Việt Nam có số cơng trình nghiên cứu Xạ đen như: Lê Thế Trung cộng (1999) nghiên cứu khả chữa ung thư xạ đen Hòa Bình; Nguyễn Huy Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học thăm dò hoạt tính sinh học xạ đen 57 đồng thời sâu vào hoạt tính sinh học hợp chất phân lập kết thu cơng bố tạp chí khoa học Chúng tơi hy vọng với đề tài thiết thực góp phần làm rõ thành phần hóa học có xạ đen, giúp có nhìn tổng qt hiểu rõ đặc tính sinh học, công dụng 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Huy Cường, Luận án tiến sĩ, “Nghiên cứu thành phần hố học thăm dò hoạt tính sinh học Xạ đen (Celastrus hindsii Benth & Hook.) Cùm rụm (Ehretia dentata Courch.)”, 2008 Phạm Thị Lương Hằng, Đoàn Thị Duyên, Nguyễn Thị Yến, Ngô Thị Trang (2013), “Phát triển phương pháp khuếch tán - so màu đĩa thạch sàng lọc phát chất có hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết thực vật”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học tự nhiên Công nghệ, tập 29, số 2, tr 10-17 Hoàng Quỳnh Hoa, Phạm Thanh Kỳ, Phan Văn Kiệm, Lê Mai Hương (2009), “Xác định cấu trúc tác dụng gây độc tế bào acid rosmarinic phân lập từ cùm cụm hoa dài (Ehretia longiflora Champ)”, Tạp chí Dược học, 8/2009, tr 27-30 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr.80-90 Tran Van Sung, Nguyen Huy Cuong, Trinh Thi Thuy, Pham Thi Ninh, Le Thi Hong Nhung (2007), “Isolation and chracterization of triterpens and phenolic glycoside frome Celastrus hindsii Benth”, Internationnal Workshop on Herbal Medicinal Plants and Traditional Herb Remedies, 20-21 September 2007, Hanoi, Vietnam, tr 85 59 Trần Văn Sung, Nguyễn Huy Cường, Trịnh Thị Thủy, Phạm Thị Ninh, Lê Thị Hồng Nhung (2008), “Isolation and structural characterization of Phenolic glycoside and Triterpenes in Celastrus hindsii Benth” Tạp chí Hóa học, 46 (2), tr 224 - 228 Trinh Thi Thuy, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung (2007), “Nitril glucoside, flavonol glucoside and polyphenolic acids from Ehretia dentata Courch”, Tạp chí Hóa Học, 45 (2), tr.228-232 10 Trinh Thi Thuy, Nguyen Huy Cuong, Tran Van Sung (2007), “Triterpenes from Celastrus hindsii Benth”, Tạp chí Hóa học, 45(3), tr 373 – 376 11 Nguyễn Đình Triệu (2015), Bài tập phương pháp vật lí ứng dụng hóa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 12 Abedini A., Roumy V., Mahieux S., Biabiany M., Standaert-Vitse A, Rivière C., Sahpaz S., Bailleul F., Neut C., and Hennebelle T (2013), “Rosmarinic Acid and Its Methyl Ester as AntimicrobialComponents of the Hydromethanolic Extract of Hyptis atrorubensPoit (Lamiaceae)”, Hindawi Publishing Corporation, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Volume 2013, Article ID 604536, p.11 13 Chang S W., Kim K H., Lee I K., Choi S U., Ryu S Y., Lee K R.(2009), “Phytochemical Constituents of Bistorta manshuriensis”, Natural Product Sciences 15(4), p.234-240 14 Huang H C., Shen C C., Chen C F., Yang-Chang Wu Y C., Kuo Y H.(2000), A Novel Agarofuran Sesquiterpene, Celahin D from Celastrus hindsii Benth., Chem Pharm Bull 48(7), p.1079-1080 60 15 Kuo Y H., Kuo L M (1997), “Antitumour and anti-AIDS triterpenes from Celastrus hindsii”, Phytochemistry 1997, 44, p.1275–1281 16 Kuo Y H , Chen C F., Kuo L M Y (1995), “Celahinine, a new sesquiterpene pyridine alkaoid from celastrus hindsii”, Journol of Natural Products, Vol 58, No 11, p.1735-1738 17 Likhitwitayawuid K., Angerhofer C K., Cordell G A., Pezzuto J M., & Ruangrungsi N (1993), “Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinolme alkaloids from Stephania erecta”, Journal of Natural Products, 56(1), p.30-38 18 Mossmann T (1983), “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays”, J Immunol, Meth.65, p.55-63 19 Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R (1991), “New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents”, Eur J Cancer 27, p.1162–1168 20 Takahashi K., Yoshioka Y., Kato E., KatsukiI S., Iida O., Hosokawa K., Kawabata J.(2010), “Methyl Caffeate as an α-Glucosidase Inhibitor from Solanum torvum Fruits and the Activity of RelatEd Compounds” Biosci, Biotechnol, Biochem, 74(4), p.741–745 21 Yu D., Susan L., Morris-Natschke, Lee K H (2006), “New Developments in Natural Products-Based Anti-AIDS Resedrch”, Published online August 2006 in Wiley (www.interscience.wiley.com), DOI 10.1002/mEd.20075 InterScience 61 Tài liệu website: 22 http://duoclieutuelinh.vn/xa-den.html 23 http://xadenhoabinh.vn/cong-trinh-nghien-cuu-cay-xa-den-cua-giao-sule-the-trung 24 Ancotnam.vn/mot-so-tac-dung-cua-cay-xa-den-than-duoc-tri-ungthu.html 62 PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 3.2 63 Phụ lục 2: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 5.5 64 Phụ lục 3: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 5.5 65 Phụ lục 4: Phổ DEPT hợp chất Ed 5.5 66 Phụ lục 5: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 17.3 67 Phụ lục 6: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 17.3 68 Phụ lục 7: Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) hợp chất Ed 11.4 69 Phụ lục 8: Phổ 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) hợp chất Ed 11.4 70 Phụ lục 9: Phổ hai chiều HSQC hợp chất Ed 11.4 71 Phụ lục 10: Phổ hai chiều HMBC hợp chất Ed 11.4 ... tế bào ung thư mạnh Chính việc lựa chọn đề tài: Nghiên cứu thành phần hóa học đánh giá tác dụng diệt tế bào ung thư Xạ đen (Ehretia asperula Zoll & Mor)” việc cấp thiết có ý nghĩa khoa học giá. ..VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ THU THỦY NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG DIỆT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA LÁ XẠ ĐEN (Ehretia asperula... thư xạ đen Hòa Bình; Nguyễn Huy Cường (2008) nghiên cứu thành phần hóa học thăm dò hoạt tính sinh học xạ đen 2 Dựa kết sàng lọc hoạt tính tế bào ung thư cho thấy cao chiết xạ đen có tác dụng diệt