Đang tải... (xem toàn văn)
Mục tiêu của luận án là xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P.damselae phân lập từ cá biển Việt Nam. Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ BIỂN NI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Hà Nội, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ BIỂN NI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG BỆNH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Tâm PGS.TS Tô Long Thành Hà Nội, năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực Toàn số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa sử dụng để cơng bố cơng trình nghiên cứu để nhận học vị, thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận án này, lỗ lực thân nhận nhiều giúp đỡ từ tổ chức cá nhân Trước hết tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội), PGS TS Tô Long Thành (Trung tâm chuẩn đoán thú ý Trung ương) định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi thực nội dung đề tài luận án, hỗ trợ mặt để tơi hồn thành luận án Để hồn thành luận án này, tơi nhận động viên, khuyến khích giúp đỡ bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tất giúp đỡ tình cảm q báu nguồn động lực lớn giúp tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu đó! Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018 Tác giả luận án Lê Minh Hải ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ni cá biển giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình ni cá biển giới 1.1.2 Tình hình ni cá biển Việt Nam 1.2 Một số bệnh thường gặp cá biển nuôi lồng 1.3 Vi khuẩn Photobacterium damselae bệnh vi khuẩn P damselae gây cá biển 10 1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae 10 1.3.2 Bệnh vi khuẩn Photobacterium damselae gây cá biển 15 1.4 Tổng quan tạo chủng vi khuẩn nhược độc 19 1.4.1 Phương pháp vật lý 19 1.4.2 Các phương pháp vi sinh vật học 21 1.4.3 Đột biến kháng sinh rifampicin 22 1.4.4 Giảm độc kỹ thuật gen 24 1.5 Đáp ứng miễn dịch cá vắc xin phòng bệnh 25 1.5.1 Đáp ứng miễn dịch cá 25 1.5.2 Vắc xin phòng bệnh cho cá 29 CHƯƠNG VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Đối tượng nghiên cứu 42 2.2 Vật liệu nghiên cứu 42 2.2.1 Động vật thí nghiệm 42 iii 2.2.2 Hóa chất 42 2.2.3 Môi trường dung dịch nuôi cấy vi khuẩn 42 2.2.4 Thiết bị 43 2.3 Nội dung nghiên cứu 43 2.4 Phương pháp nghiên cứu 43 2.4.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh 43 2.4.2 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng 44 2.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae 44 2.4.4 Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 2.4.5 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn 45 2.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả nhân lên sinh độc tố gây dung huyết vi khuẩn 46 2.4.7 Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) cá biển vi khuẩn P damselae 47 2.4.8 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm xác định LD50 48 2.4.9 Phương pháp tách chiết DNA 48 2.4.10 Phương pháp Multiplex PCR phát phân biệt P.damselae subsp Damselae P damselae subsp piscicida 49 2.4.11 Phương pháp PCR phát gen dly hlyA 49 2.4.12 Phương pháp điện di agarose 50 2.4.13 Phương pháp tạo chủng nhược độc kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 50 2.4.14 Đánh giá khả gây dung huyết dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 51 2.4.15 Phương pháp mô bệnh học 52 2.4.16 Giải trình tự DNA, xử lý phân tích số liệu trình tự gen 53 iv 2.4.17 Phương pháp xác định khả tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cá dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 53 2.4.18 Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu 53 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 Kết phân lập vi khuẩn P damselae 55 3.1.1 Đặc điểm mẫu cá bệnh 55 3.1.2 Kết phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh cá biển nuôi lồng 57 3.1.3 Xác định phân loài P damselase gây bệnh cá biển nuôi lồng phương pháp sinh học phân tử 61 3.1.4 Nghiên cứu độc lực chủng P damselae phân lập 63 3.2 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn P damselae phân lập 65 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả sinh trưởng gây dung huyết vi khuẩn P damselae 65 3.2.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng gây dung huyết vi khuẩn P damselae 69 3.2.3 Ảnh hưởng độ mặn (NaCl) đến khả sinh trưởng gây dung huyết vi khuẩn P damselae 71 3.3 Kết tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc lực 73 3.3.1 Kết tạo lựa chọn dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến 73 3.3.2 Kết đánh giá mức độ giảm độc lực dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến 76 3.3.3 Kết đánh giá mức độ an toàn vi khuẩn P damselae đột biến giảm độc lực cá mú 81 v 3.3.4 Kết phân tích kiểm tra đột biến chủng vi khuẩn Photobacterium damselae nhược độc 88 3.4 Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch dòng vi khuẩn Photobacterium damsalae đột biến giảm độc lực 104 3.4.1 Kết xác định khả tạo kháng thể đặc hiệu 104 3.4.2 Kết xác định khả tạo kháng thể bảo hộ 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111 Kết luận 111 Kiến nghị 111 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 112 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 113 PHỤ LỤC vi Chữ viết tắt AFLP BFNNV BHI CFU cs Da DNA ELISA FA GS IgM LD50 nt OD ORF PCR RNA TCBS UV VNN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Giải thích Amplified fragment length polymorphism Barfin flounder nervous necrosis virus Brain heart infusion Colony forming units - đơn vị khuẩn lạc Cộng Dalton Deoxyribonucleic acid Enzyme linked immunosorbent assay Fluorescent antibody - Kháng thể huỳnh quang Grouper spleen – tế bào lách cá mú Immunoglobulin M - globulin miễn dịch lớp M Lethal dose 50 - liều gây chết 50% Nucleotide Optical density - mật độ quang Open reading frame -khung đọc mở Polymerase chain reaction - Polymerase chain reaction Ribonucleic acid Thiosulphate citrate bile salt- môi trường nuôi cấy Ultra violet Viral nervour necrosis vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Sản lượng đánh bắt nuôi trồng thủy hải sản giới Bảng 1.2 Các lồi cá biển ni chủ yếu Trung Quốc Bảng 1.3 Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển Việt Nam Bảng 1.4 Một số vắc xin sản xuất từ vi khuẩn làm giảm độc lực 37 Bảng 2.1 Mồi khuếch đại gen UreC 16S RNA 49 Bảng 2.2 Mồi khuếch đại gen dly hlyA 49 Bảng 3.1 Kết thu mẫu mẫu bệnh phẩm 56 Bảng 3.2 Kết phân lập vi khuẩn P damsalae từ mẫu cá biển nghi mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) 58 Bảng 3.3 Kết xác định liều LD50 chủng vi khuẩn P.damselae phân lập 64 Bảng 3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T4.3 69 Bảng 3.5 Ảnh hưởng pH đến khả gây dung huyết vi khuẩn P amselae T1.7 T4.3 71 Bảng 3.6 Ảnh hưởng độ mặn đến khả gây dung huyết vi khuẩn P damselae T1.7 T4.3 73 Bảng 3.7 Kết tạo chủng vi khuẩn P damselae nhược độc tác nhân UV 74 Bảng 3.8 Kết tạo chủng vi khuẩn P damselae nhược độc tác nhân kháng sinh Rifampicin 75 Bảng 3.9 Kết kiểm tra gây dung huyết dòng Photobacterium damsela đột biến 77 Bảng 3.10 Kết xác định liều LD50 dòng vi khuẩn P.damselae đột biến 80 Bảng 3.11 Kết theo dõi triệu chứng lâm sàng cá thí nghiệm 81 viii ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VI N KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VI T NAM - LÊ MINH HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LỒI CÁ BIỂN... tơi tiến hành đề tài: Nghiên cứu đặc tính sinh học vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh số lồi cá biển ni lồng Vi t Nam tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh ... tài luận án - Ở Vi t Nam cơng trình nghiên cứu đầu tiên, toàn diện vi khuẩn P damselae gây bệnh cá biển nuôi lồng, phân lập xác định 07 chủng vi khuẩn, xác định số đặc tính sinh học vi khuẩn gây