Luận án tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực

Mục tiêu của luận án là xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn P.damselae phân lập từ cá biển Việt Nam. Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

LÊ MINH HẢI

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN

Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ

BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

LÊ MINH HẢI

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN

Photobacterium damselae GÂY BỆNH TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ

BIỂN NUÔI LỒNG TẠI VIỆT NAM VÀ TẠO CHỦNG ĐỘT BIẾN

PGS.TS Tô Long Thành

Hà Nội, năm 2018

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện Toàn

bộ số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các

thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018

Tác giả luận án

Lê Minh Hải

ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đề tài luận án này, ngoài sự lỗ lực của bản thân tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các tổ chức và cá nhân Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở

Hà Nội), PGS TS Tô Long Thành (Trung tâm chuẩn đoán thú ý Trung ương)

đã định hướng, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ, kỹ thuật viên, học viên của Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội nơi tôi thực hiện các nội dung trong

đề tài luận án, đã hỗ trợ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành luận án này

Để hoàn thành luận án này, tôi còn nhận được sự động viên, khuyến khích giúp đỡ của các bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Tất cả những sự giúp

đỡ và tình cảm quý báu đó là nguồn động lực lớn giúp tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những giúp đỡ quý báu đó!

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 12 năm 2018

Tác giả luận án

Lê Minh Hải

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH MỤC CÁC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở Việt Nam 4

1.1.1 Tình hình nuôi cá biển trên thế giới 4

1.1.2 Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam 5

1.2 Một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng 8

1.3 Vi khuẩn Photobacterium damselae và bệnh do vi khuẩn P damselae gây ra trên cá biển 10

1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae 10

1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra trên cá biển 15

1.4 Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc 19

1.4.1 Phương pháp vật lý 19

1.4.2 Các phương pháp vi sinh vật học 21

1.4.3 Đột biến bằng kháng sinh rifampicin 22

1.4.4 Giảm độc bằng kỹ thuật gen 24

1.5 Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc xin phòng bệnh 25

1.5.1 Đáp ứng miễn dịch của cá 25

1.5.2 Vắc xin phòng bệnh cho cá 29

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Đối tượng nghiên cứu 42

2.2 Vật liệu nghiên cứu 42

2.2.1 Động vật thí nghiệm 42

iv

2.2.2 Hóa chất 42

2.2.3 Môi trường và dung dịch nuôi cấy vi khuẩn 42

2.2.4 Thiết bị 43

2.3 Nội dung nghiên cứu 43

2.4 Phương pháp nghiên cứu 43

2.4.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh 43

2.4.2 Phương pháp mổ cá để lấy nội tạng 44

2.4.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae 44

2.4.4 Phương pháp giữ giống các chủng vi khuẩn tuyển chọn 45

2.4.5 Phương pháp xác định đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 45

2.4.6 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng nhân lên và sinh độc tố gây dung huyết của vi khuẩn 46

2.4.7 Phương pháp nghiên cứu đặc tính gây bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) trên cá biển của vi khuẩn P damselae 47

2.4.8 Phương pháp gây nhiễm động vật thí nghiệm và xác định LD50 48

2.4.9 Phương pháp tách chiết DNA 48

2.4.10 Phương pháp Multiplex PCR phát hiện phân biệt P.damselae subsp Damselae và P damselae subsp piscicida 49

2.4.11 Phương pháp PCR phát hiện gen dly và hlyA 49

2.4.12 Phương pháp điện di trên agarose 50

2.4.13 Phương pháp tạo chủng nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm 50

2.4.14 Đánh giá khả năng gây dung huyết của các dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 51

2.4.15 Phương pháp mô bệnh học 52

2.4.16 Giải trình tự DNA, xử lý và phân tích số liệu trình tự các gen 53

v

2.4.17 Phương pháp xác định khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ ở cá

của dòng vi khuẩn đột biến giảm độc lực 53

2.4.18 Phương pháp ELISA xác định kháng thể đặc hiệu 53

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 55

3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P damselae 55

3.1.1 Đặc điểm mẫu cá bệnh 55

3.1.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Photobacterium damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng 57

3.1.3 Xác định phân loài P damselase gây bệnh trên cá biển nuôi lồng bằng phương pháp sinh học phân tử 61

3.1.4 Nghiên cứu độc lực của các chủng P damselae phân lập 63

3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn P damselae phân lập được 65

3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P damselae 65

3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P damselae 69

3.2.3 Ảnh hưởng của độ mặn (NaCl) đến khả năng sinh trưởng và gây dung huyết của vi khuẩn P damselae 71

3.3 Kết quả tạo dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến giảm độc lực 73

3.3.1 Kết quả tạo và lựa chọn các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến 73

3.3.2 Kết quả đánh giá mức độ giảm độc lực của các dòng vi khuẩn Photobacterium damselae đột biến 76

3.3.3 Kết quả đánh giá mức độ an toàn của vi khuẩn P damselae đột biến giảm độc lực trên cá mú 81

vi

3.3.4 Kết quả phân tích kiểm tra đột biến của các chủng vi khuẩn

Photobacterium damselae nhược độc 88

3.4 Nghiên cứu mức độ tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn Photobacterium damsalae đột biến giảm độc lực 104

3.4.1 Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể đặc hiệu 104

3.4.2 Kết quả xác định khả năng tạo kháng thể bảo hộ 106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111

Kết luận 111

Kiến nghị 111

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN 112

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 113 PHỤ LỤC

vii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified fragment length polymorphism

BFNNV Barfin flounder nervous necrosis virus

BHI Brain heart infusion

CFU Colony forming units - đơn vị khuẩn lạc

DNA Deoxyribonucleic acid

ELISA Enzyme linked immunosorbent assay

FA Fluorescent antibody - Kháng thể huỳnh quang

GS Grouper spleen – tế bào lách cá mú

IgM Immunoglobulin M - globulin miễn dịch lớp M

LD50 Lethal dose 50 - liều gây chết 50%

OD Optical density - mật độ quang

ORF Open reading frame -khung đọc mở

PCR Polymerase chain reaction - Polymerase chain reaction

TCBS Thiosulphate citrate bile salt- môi trường nuôi cấy

VNN Viral nervour necrosis

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới 4

Bảng 1.2 Các loài cá biển nuôi chủ yếu ở Trung Quốc 5

Bảng 1.3 Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam 7

Bảng 1.4 Một số vắc xin sản xuất từ vi khuẩn làm giảm độc lực 37

Bảng 2.1 Mồi khuếch đại các gen UreC và 16S RNA 49

Bảng 2.2 Mồi khuếch đại các gen dly và hlyA 49

Bảng 3.1 Kết quả thu mẫu và mẫu bệnh phẩm 56

Bảng 3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn P damsalae từ các mẫu cá biển nghi mắc Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) 58

Bảng 3.3 Kết quả xác định liều LD50 của các chủng vi khuẩn P.damselae phân lập 64

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P damselae T1.7 và T4.3 69

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P amselae T1.7 và T4.3 71

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P damselae T1.7 và T4.3 73

Bảng 3.7 Kết quả tạo chủng vi khuẩn P damselae nhược độc bằng tác nhân UV 74

Bảng 3.8 Kết quả tạo chủng vi khuẩn P damselae nhược độc bằng tác nhân kháng sinh Rifampicin 75

Bảng 3.9 Kết quả kiểm tra gây dung huyết của các dòng Photobacterium damsela đột biến 77

Bảng 3.10 Kết quả xác định liều LD50 của các dòng vi khuẩn P.damselae đột biến 80

Bảng 3.11 Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của cá thí nghiệm 81

ix

Bảng 3.12 Biểu hiện bệnh tích do P damselae trên cá thí nghiệm 83

Bảng 3.13 Tần suất xuất hiện các tổn thương vi thể trong các tổ chức của cá

thí nghiệm 85

Bảng 3.14 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập lại từ cá gây nhiễm 87

Bảng 3.15 So sánh độ tương đồng gen hlyA Genbank với chủng P.damselae

T4.3 92

Bảng 3.16 So sánh độ tương đồng gen dly Genbank so với chủng P.damselae

T4.3 101

x

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Hình thái của vi khuẩn P damselae 11

Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine 21

Hình 1.3 Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [56] 23

Hình 1.4 Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB [56] 23

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp mô bệnh học 52

Hình 3.1 (a), (b) Mẫu cá mú nghi mắc bệnh Photobacteriosis, thu tại Hải Phòng (c) Mẫu cá mú không bị bệnh 55

Hình 3.2 Hình ảnh cơ quan nội tạng cá bị bệnh Photobacteriosis 56

Hình 3.3 Hình thái vi khuẩn P damselae 59

Hình 3.4 Kết quả thử nghiệm các phản ứng sinh hóa của chủng T1.7 60

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm multi-PCR khuếch đại các gen ureC và 16S rRNA của vi khuẩn P damselase 62

Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P damselae T1.7 66

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn P damselae T4.3 66

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của P damselae 70

Hình 3.9 Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh trưởng của vi khuẩn 72

P damselae phân lập 72

Hình 3.10 Khuẩn lạc sống sót sau khi chiếu UV 75

Hình 3.11 Khuẩn lạc sống sót sau khi sử dụng kháng sinh rifampicin 76

Hình 3.12 Hình ảnh dung huyết thạch máu của các dòng vi khuẩn thí nghiệm 77 Hình 3.13 Biểu hiện bệnh tích bên ngoài của cá mú gây nhiễm chủng P damselae T4.3 (liều tiêm 100 LD50, sau 7 ngày) 82

Hình 3.14 Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm 84

xi

Hình 3.15 Biểu hiện bệnh tích ở các cơ quan bên trong cơ thể của cá gây nhiễm 86

Hình 3.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen hlyA của chủng

giống gốc và các dòng gây giảm độc lực 89

Hình 3.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dly của chủng

giống gốc và các dòng gây giảm độc lực 89

Hình 3.18 Kết quả so sánh trình tự gen hlyA của chủng gốc T4.3 với trình tự

hlyA trên Genbankmã số KF984030.1 92

Hình 3.19 So sánh trình tự gen hlyA của các dòng đột biến và chủng T4.3 gốc 95

Hình 3.20 Vị trí mã mở đầu và mã kết thúc vùng mã hóa protein của dòng

U4.3K8.2 và chủng gốc T4.3 98

Hình 3.21 So sánh trình tự amino acid của các dòng T4.3U6, T4.3K8.2 và

chủng gốc T4.3 99

Hình 3.22 Kết quả so sánh trình tự gen dly của chủng gốc T4.3 và LBT6 với

trình tự gen dly của Genbank 100

Hình 3.23 Trình tự đoạn gen dly của các dòng đột biến với chủng gốc T4.3 102

Hình 3.24 Trình tự protein suy diễn của các dòng đột biến với chủng gốc T4.3 102 Hình 3.25 Biến thiên mức độ hình thành kháng thể đặc hiệu ở cá được tiêm

vi khuẩn nhược độc và vô hoạt 105

Hình 3.26 Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.8 sau khi

tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt 107

Hình 3.27 Tỷ lệ sống của cá được công cường độc với chủng T1.7 sau khi

tiêm vi khuẩn nhược độc và vô hoạt 108

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản trên biển, diện tích

có khả năng sử dụng phát triển nuôi cá biển bao gồm các vùng vịnh kín, bãi triều ven biển và một phần ở các hải đảo, vùng biển hở Biển Việt Nam có nhiều loài cá phân bố tự nhiên có thể đưa vào nuôi biển như nhóm cá mú, cá hồng, cá cam, cá tráp, cá giò, cá vược Trong chương trình nuôi, đến năm

2020 Việt Nam dự kiến đạt sản lượng 200.000 tấn cá biển nuôi trong đó 50.000 tấn là nuôi theo quy mô lớn [16]

Hiện tại, mô hình nuôi cá lồng bè có giá trị kinh tế cao trên biển đang được áp dụng phổ biến ở nhiều vùng ven biển nước ta Tuy nhiên, việc phát triển mô hình nuôi nhanh về số lượng cũng như về mức độ thâm canh ngày càng cao, tình hình dịch bệnh gây chết cá hàng loạt cũng đã được ghi nhận

ngày càng nhiều với tỉ lệ hao hụt cao Vi khuẩn ưa mặn Photobacterium damselae gây bệnh Photobacteriosis hay Pasteurellosis còn được gọi là xuất

huyết nhiễm trùng, hoặc bệnh đốm trắng ở thận trên cá biển [5]

Vi khuẩn P damselae có thể tấn công và gây bệnh trên cá biển nuôi ở

tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng, cá giống đến cá nuôi thương phẩm Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn tính và cấp

tính, biểu hiện bệnh Photobacteriosis như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt

kem trắng hoặc u hạt tubercules màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng và hoại tử rộng rãi [146], [41] Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ở Việt Nam, theo báo cáo của các tác giả

Đỗ Thị Hòa và cs năm 2008, cho thấy các loài cá biển nuôi tại Khánh Hòa,

2

Kiên Giang và các tỉnh phía Bắc đều bị bệnh do vi khuẩn P damselae và gây thiệt hại lớn cho người nuôi [5]

Hiện nay, người nuôi cá biển sử dụng vắc xin để phòng bệnh còn rất ít

do các nghiên cứu và sản xuất còn hạn chế, trên thị trường khan hiếm vắc xin

thương mại Vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn P damselae chủ yếu là ở dạng

vô hoạt, sử dụng bằng cách tiêm cho cá, giá thành cao, khó sử dụng cho cá giống kích thước bé Người nuôi cá biển, chủ yếu sử dụng kháng sinh để trị

bệnh do vi khuẩn P damselae dẫn đến sự kháng thuốc, tồn dư kháng sinh

trong sản phẩm Nhằm giảm thiểu việc sử dụng kháng sinh, thì nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh là rất cần thiết Hiện tại, có nhiều phương pháp để tạo vắc xin, trong đó phương pháp tạo vắc xin nhược độc từ chủng vi khuẩn nhược độc bằng kỹ thuật gây đột biến thực nghiệm là phương pháp phổ biến và rất

hữu hiệu khắc phục được các hạn chế của vắc xin vô hoạt

Xuất phát từ lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc tính sinh học của vi khuẩn Photobacterium damselae gây

bệnh trên một số loài cá biển nuôi lồng tại Việt Nam và tạo chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin phòng bệnh” làm cơ sở ban đầu

hướng đến việc sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển trên

quy mô công nghiệp

2 Mục tiêu đề tài luận án

- Xác định được một số đặc tính sinh học của chủng vi khuẩn

P.damselae phân lập từ cá biển Việt Nam

- Tạo được chủng đột biến giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc xin

phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển nuôi lồng

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng: Vi khuẩn Photobacterium damselae, một số loài cá biển

nuôi lồng (cá mú, cá hồng mỹ, cá bớp (cá giò)

3

- Phạm vi nghiên cứu: Các vùng ven biển miền Bắc Việt Nam

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học:

- Các kết quả nghiên cứu trong luận án đã xác định được các đặc tính

sinh học của các chủng vi khuẩn P damselae gây bệnh Photobacteriosis ở cá

là cơ sở khoa học trong nghiên cứu dịch tễ và xây dựng các giải pháp phòng trị bệnh

- Kết quả tạo vi khuẩn P damselae giảm độc lực bằng kỹ thuật gây đột

biến là cơ sở cho các nghiên cứu tạo các dòng vi khuẩn đột biến phục vụ cho định hướng sản xuất vắc xin nhược độc phòng bệnh cho cá đạt hiệu quả cao

Ý nghĩa thực tiễn:

Đề tài đã tạo được chủng vi khuẩn P damselae giảm độc lực, an toàn,

có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ làm nguyên liệu để sản xuất vắc

xin phòng bệnh Photobacteriosis cho cá góp phần tăng sản lượng cá nuôi và

phát triển bền vững nghề nuôi cá biển ở nước ta

5 Đóng góp mới của đề tài luận án

- Ở Việt Nam đây là công trình nghiên cứu đầu tiên, toàn diện về vi

khuẩn P damselae gây bệnh trên cá biển nuôi lồng, đã phân lập và xác định

được 07 chủng vi khuẩn, xác định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn gây bệnh

- Luận án là công trình đầu tiên tại Việt Nam nghiên cứu tạo chủng vi

khuẩn P.damselae giảm độc lực làm nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh Photobacteriosis ở cá biển Thành công của nghiên cứu sẽ góp phần giải

quyết vấn đề một cách đáng kể việc sử dụng kháng sinh dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc và giảm sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, nâng giá trị sản phẩm cá biển, tăng năng suất cá biển nuôi lồng

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nuôi cá biển trên thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Tình hình nuôi cá biển trên thế giới

Theo số liệu của FAO, 2016, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu năm 2014 là 73,8 triệu tấn, trong đó 26,7 triệu tấn nuôi biển (Bảng 1.1) Đối với sản xuất thủy sản biển, Trung Quốc vẫn là nước sản xuất chính tiếp theo là Ấn Độ và Việt Nam

Bảng 1.1 Sản lượng đánh bắt và nuôi trồng thủy hải sản trên thế giới

Đơn vị: Triệu tấn

2009 2010 2011 2012 2013 2014 Đánh bắt

Tổng sản lượng đánh bắt 90,2 89,1 93,7 91,3 92,7 93,4 Nuôi trồng

1970, tỉnh Quảng Đông đã thành công trong việc nuôi cá biển bao gồm cá mú

và cá chẽm trong lồng Năm 1984, số lượng lồng cá biển ở ba tỉnh Quảng Đông, Phúc Kiến và Chiết Giang đã đạt trên 57000 Đến năm 2005, tổng số lồng biển của các mô hình khác nhau đã đạt đến một triệu, sản lượng nuôi lồng là khoảng 200000 tấn/năm với hơn 40 loài cá (Bảng 1.2)[49] Trong 5 năm gần đây, nghề nuôi cá biển của Trung Quốc phát triển đều theo từng năm, số lượng báo cáo về tổng sản lượng cá biển nuôi từ năm 2010 - 2015 của Cục thủy sản, Bộ Nông nghiệp cho thấy năm 2010 đạt 0,8082 triệu tấn, năm 2011 đạt 0,9642 triệu tấn, năm 2012 đạt 1,0284 triệu tấn, năm 2013 đạt 1,1236 triệu tấn, năm 2014 đạt 1,1897 triệu tấn, năm 2015 đạt 1,3076 triệu tấn [49]

Cá tráp đen (Acanthopagrus schlegelii schelgelii)  

Cá lưỡi trâu (Cynoglossus semilaevis) 

Ấn Độ triển khai nuôi cá biển từ năm 1950 bao gồm các loài cá da trơn, cá mú, cá chẽm và cá điểm ngọc trai Trong những năm đó, hầu hết các trang trại nuôi cá đều ở quy mô nhỏ và bán tập trung Theo số lượng thống kê của Cục Chăn nuôi và Nghề cá, sản lượng nuôi cá biển của Ấn Độ tăng khá đều đặn kể từ năm 1950-2014, sản lượng năm 1950 là 534.000 tấn, năm 2014 3.440.000 tấn, mặc dù tốc độ tăng trưởng không cao, nhưng nuôi cá biển tận dụng tối ưu tài nguyên biển và đã đóng góp đáng kể cho nền kinh tế

1.1.2 Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam

Trong giai đoạn 2005 - 2010, nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo đã

có những bước phát triển đáng kể, diện tích và sản lượng tăng không ngừng Sản lượng nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo trong giai đoạn năm 2005-

2010 đạt tốc độ tăng trưởng bình quân năm về sản lượng 5,1%/năm, trong đó

cá biển tăng 38,1%/năm Tổng diêṇ tích nuôi trồng hải sản trên biển và hải đảo Việt Nam năm 2005 là 34.174 ha, đến năm 2010 tăng lên đaṭ 38.800 ha,

6

trong đó: tốc độ tăng trưởng nuôi vùng biển hở là 15,4%/năm, diện tích nuôi vịnh, đảo và eo ngách tăng bình quân là 4,86%/năm; diện tích nuôi bãi triều ven biển là 1,8%/năm [22]

Các loài cá biển được nuôi chủ hiêṇ nay bao gồm cá song, cá giò, cá cam, chép biển, tráp đỏ, hồng mỹ, cá vược, đối mục, cá dìa, cá chim vây vàng, trong đó cá song, cá giò, cá vược được xem là một trong những đối tượng được nuôi phố biến nhất Riêng khu vực Quần đảo Trường Sa chủ yếu nuôi cá chim trắng, cá hồng và cá vược mõn nhọn

Trong giai đoạn năm 2005 - 2010, số lượng lồng, bè nuôi cá lồng liên tục tăng Tổng số ô lồng năm 2005 là 13.172 ô lồng, đến năm 2010 đạt 30.031

ô lồng; số ô lồng tăng bình quân năm trong giai đoạn năm 2005-2010 đạt 17,92%/năm Số bè nuôi năm 2005 là 1.461 bè, tăng lên 2.142 bè năm 2010, đạt tốc độ tăng trưởng bình quân là 7,96%/năm (bảng 1.3) Trong năm 2010,

có 1.019 bè cá nuôi ở khu vực vùng biển vịnh Bắc bộ (chủ yếu ở Hải Phòng, Quảng Ninh, Thanh Hóa và Nghệ An), 630 bè ở vùng biển miền Trung (Chủ yếu Phú Yên, Khánh Hòa và Ninh Thuận), 140 bè ở vùng biển Đông Nam Bộ (chủ yếu ở Bình Thuận và Bà Rịa-Vũng Tàu) và 353 bè ở Tây Nam Bộ (chủ yếu ở Kiên Giang) Khu vực cụm đảo Đá Tây - Quần đảo Trường Sa-Khánh Hóa đã nuôi 8 lồng công nghiệp kiểu Nauy cải tiến (thể tích 218 m3/lồng

Về sản lượng cá biển nuôi, năm 2005 sản lượng nuôi cá biển đạt 3.141 tấn, đến năm 2010 sản lượng tăng lên 15.751 tấn (đạt tốc độ tăng trưởng bình quân 38,1%/năm) Năm 2010, tổng sản lượng cá biển là 15.751 tấn, trong đó

cá song 7.786 tấn (chiếm 49%), cá giò 4.734 tấn (chiếm 30%), cá vược 1.096 tấn (chiếm 7%), cá biển khác 2.135 tấn (chiếm 14%) Riêng khu vực nuôi cá biển của Úc (ở vịnh Nha Trang) năm 2010 đã nuôi gần 3.000 tấn cá biển (chủ yếu cá giò, song)

Đến năm 2014 (sau 3 năm Quy hoạch cá biển được phê duyệt 2011) sản lượng nuôi cá biển ở các loại hình chỉ đạt 63.460 tấn, nhìn chung tốc độ

7

tăng trưởng về quy mô diện tích và sản lượng nuôi khá chậm so với quy hoạch Sản lượng nuôi cá biển trong lồng bè đến năm 2015 có thể đạt được chỉ tiêu theo quy hoạch là 44.000 tấn Riêng sản lượng nuôi ao đầm nước mặn

lợ chỉ đạt được 50% so với quy hoạch và sản lượng nuôi công nghiệp gần như không thể đạt được chỉ tiêu trong quy hoạch đến năm 2015 đề ra (Bảng 1.3) Đối tượng nuôi cá biển cũng khá đa dạng, tuy nhiên tập trung chủ yếu vẫn là

cá vược (chẽm), cá song, cá bớp và cá hồng Mỹ Diện tích nuôi cá biển trong

ao đất cũng đã được mở rộng, tập trung ở một số tỉnh trọng điểm như Quảng Ninh, Phú Yên, Bà Rịa-Vũng Tàu và Kiên Giang Nuôi lồng bè nhỏ nằm rải rác trong eo, vịnh ở các tỉnh ven biển Nuôi cá biển quy mô công nghiệp dạng lồng bè lớn trên 1.000m3 ở các vùng eo vịnh, biển mở, có thể chịu được sống gió lớn cấp 11 -12 hầu như chưa được các thành phần kinh tế quan tâm đầu tư sản xuất

Bảng 1.3 Báo cáo quy hoạch nuôi cá biển ở Việt Nam

- Nuôi trong ao nước mặn lợ, ao nuôi

tôm chuyển đổi (tấn)

Theo quy hoạch phát triển nuôi cá biển đến năm 2015 và định hướng đến năm 2020 ban hành kèm theo Quyết định số 1523/QĐ-BNN-TCTS ngày

08 tháng 07 năm 2011 của Bộ trưởng Bộ NN và PTNT [16]:

8

+ Phát triển nuôi trồng ở tất cả các loại hình mặt nước biển,bao gồm: khu vực bãi triều ven biển, eo vịnh, quanh các đảo (ưu tiên các đảo có dân cư sinh sống) và vùng biển mở, biển khơi ở các vùng biển Vịnh Bắc bộ (Quảng Ninh - Quảng Trị), biển miền Trung (Thừa Thiên Huế - Khánh Hòa), biển Đông Nam bộ (Ninh Thuận - Cà Mau, biển Tây Nam bộ (Cà Mau - Kiên Giang, giữa Biển Đông

+ Đa dạng hóa đối tượng nuôi và phương thức nuôi với cơ cấu diện tích

và sản lượng phù hợp với từng vùng kinh tế, sinh thái trên cơ sở phát huy lợi thế so sánh của từng sản phẩm Phát triển nuôi các đối tượng có lợi thế cạnh trạnh và có thị trường tiêu thụ lớn như: cá song, cá giò, cá chim vây vàng, cá hồng mỹ, cá vược, cá ngừ, cá măng biển; nhuyễn thể (ngao, hàu, tu hài ); rong biển (rong câu, rong sụn, rong mứt), giáp xác (tôm hùm, ghẹ xanh) và các loài bản địa có giá trị kinh tế cao như hải sâm, bào ngư

+ Phát triển nuôi cá biển trên tất cả các khu vực được qui hoạch, từng bước nâng dần mật độ lồng bè, năng suất và sản lượng của từng khu vực khi

đã đáp ứng được yêu cầu về con giống, thức ăn và nhu cầu thị trường

+ Đến năm 2020, tổng sản lượng nuôi cá biển đạt 200.000 tấn, trong đó: sản lượng nuôi cá biển trong hệ thống lồng nhỏ đạt 60.000 tấn, sản lượng nuôi quy mô công nghiệp tập trung đạt 140.000 tấn

1.2 Một số bệnh thường gặp trên cá biển nuôi lồng

* Bệnh do ký sinh trùng

Bệnh do ký sinh trùng gây ra rất phổ biến ở cá biển nuôi, đặc biệt là cá biển nuôi lồng Theo kết quả khảo sát trên 80% nông hộ cho biết cá biển nuôi đều có các biểu hiện liên quan đến bệnh nhiễm ký sinh trùng Các loài ký sinh trung gặp nhiều nhất trên cá biển nuôi là sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo

và động vật đơn bào Chủ yếu là ngoại ký sinh trên da, trong miệng, gây tổn thương mang làm cá khó thở, bỏ ăn, chậm lớn và thường gây chết giai đoạn

cá nhỏ [5], [79]

* Bệnh do vi khuẩn

Ở cá biển vi khuẩn chủ yếu gây bệnh là vi khuẩn gram (-), chúng chủ

yếu là vi khuẩn thuộc họ Vibrionacea (Vibrio alginolyticus, V vunificus, V cholerea, V parahaemolyticus, V anguilarum, V ordalii, V carchriae, V harveyi) Ngoài ra còn có một số loài như Photobacterium damselea, Edwardsiella tarda, Pseudomonas sp [91]

Tại Việt Nam nhiều nghiên cứu cũng đã phát hiện vi khuẩn V parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, V carchriae, V vunificus là tác nhân

gây bệnh xuất huyết lở loét cho cá biển nói chung và cá mú nói riêng ở cả 3 miền Bắc, Trung, Nam Dấu hiệu bệnh lý đặc trưng là các vết xuất huyết lở loét trên thân, bệnh lây lan nhanh và có thể gây chết đến 30% đàn cá nuôi [4], [5], [17], [18]

Trong các bệnh thường gặp ở cá biển nuôi thì bệnh xuất huyết do vi

khuẩn P damselea gây nên, vi khuẩn P damselae có thể tấn công và gây bệnh

trên cá biển nuôi ở tất cả các giai đoạn phát triển của cá từ giai đoạn ấu trùng,

cá giống đến cá nuôi thương phẩm Khi bị bệnh cá có thể biểu hiện ở dạng mãn

10

tính và cấp tính, biểu hiện bệnh như: gây loét trên da, xuất hiện các nốt trắng hoặc u hạt màu trắng ở một số cơ quan nội tạng, gây hoại tử trong nội tạng , tập trung ở thận và lách [58], [145] [41] Cá bệnh có thể chết sau 5-10 ngày với tỷ

lệ chết cao từ 80-100% gây thiệt hại kinh tế ở các nước như: Nhật, Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Hy Lạp, Thổ Nhĩ Kỳ, Ở Việt Nam, bệnh phân bố ở hầu hết các vùng nuôi trên cả nước, đã gây thiệt hại lớn cho người nuôi cá biển [5]

1.3 Vi khuẩn Photobacterium damselae và bệnh do vi khuẩn P damselae

gây ra trên cá biển

1.3.1.Vi khuẩn Photobacterium damselae

công nhận là một tác nhân gây bệnh cơ hội có khả năng gây bệnh ở cá và động vật có vú McDonell và Colwell (1985) đã phân loại lại, xem như một

thành viên của chi Listonella dựa trên việc nghiên cứu các mối quan hệ phát

sinh loài bằng cách phân tích chuỗi 5S rRNA [117] Các nghiên cứu di truyền

và kiểu hình tiếp theo cho thấy các dòng V damselae có quan hệ mật thiết với các loài thuộc họ Photobacterium và tên P damselae đã được đề xuất [156] Sau đó, Smith et al (1991) dựa trên đặc điểm kiểu hình đã chuyển các loài này vào chi Photobacterium Trong nghiên cứu của Gauthier et al (1995) về tác nhân gây bệnh Photobacteriosis (xuất huyết nhiễm trùng) ở một số loài cá đã

11

chứng minh và xác định chủng vi khuẩn này là P damselae bằng phương pháp

phân tích trình tự 16S rDNA và DNA [73]

1.3.1.2 Đặc điểm hình thái

Theo nghiên cừu của Austin et al., (1997) vi khuẩn P damselae là trực

khuẩn Gram âm, kích thước khoảng 0.5 – 0.8 µm x 0.7 – 2.6 µm, lưỡng cực (khi nhuộm thường thấy vi khuẩn bắt màu sẫm ở hai đầu, ở giữa nhạt hơn do hiện tượng nguyên sinh chất bị dung giải về hai đầu của vi khuẩn), không có roi và không di động [33]

Hình 1.1 Hình thái của vi khuẩn P damselae

(Nguồn: Austin et al., 1997)[33]

1.3.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá

P damselae là vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện Vi khuẩn P damselae

phản ứng tích cực với Metyl đỏ (1%NaCl), Arginene (1%NaCl), khử Nitrat thành Nitrit, sinh acid nhưng không sinh khí gas từ các loại đường glucose, mannose, maltose, fructose, và galactose, sinh khí từ D-glucose, lipase,

esculin Vi khuẩn P damselae dương tính với oxidase, catalase, methyl red và

âm tính với indol, nitrate, citrate, H2S [33], [67]

1.3.1.4 Đặc điểm nuôi cấy

từ 15ºC – 32,5ºC Môi trường nuôi cấy vi khuẩn P damselae tốt nhất là BHI

Agar, TCBS, Marine Agar hoặc môi trường thạch máu (2% máu cừu) bổ sung thêm muối Khuẩn lạc trên môi trường thạch máu có màu xám, đục, đường kính khoảng 1mm, viền trơn, gây dung huyết β và quan sát được rõ ràng sau 48h ở 28ºC [33], [67]

1.3.1.5 Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P damselae

Theo nghiên cứu của Pasqualina et al (2011), thử nghiệm tính mẫn cảm với kháng sinh của các chủng P damselae phân lập từ một số trang trại nuôi trồng thủy sản ở Ý cho thấy các chủng P damselae phân lập có khả năng

kháng một số loại kháng sinh như: ampicillin, carbenicillin, kanamycin, cefalothin; trong khi đó lại mẫn cảm với các loại kháng sinh như: chloramphenicol, nitrofurantoin và tobramycin [133]

Theo nghiên cứu của Toranzo et al., (1991); Bakopoulos et al., (1995);

Sano (1998), các kháng sinh được sử dụng rộng rãi nhất để điều trị xuất huyết nhiễm trùng bao gồm amoxicillin, chloramphenicol, erythromycin, florfenicol, flumequine, acid oxolinic, oxytetracycline, nitrofurazone, trimethoprim sulfadiazine và tetracycline [167], [35], [151]

Tuy nhiên, Thyssen et al., (2000) đã nghiên cứu tính nhạy cảm của vi khuẩn P damselae phân lập từ các khu vực địa lý khác nhau với một số

kháng sinh, cho thấy phần lớn (93%) các chủng kháng với erythromycin và một tỷ lệ thấp (dưới 10%) kháng với amoxicillin, ampicillin, florfenicol và trimethoprim- sulfamethoxazole Trong khi đó các chủng vi khuẩn lại rất nhạy cảm với kanamycin, florfenicol và trimethoprim-sulfamethoxazole [166]

13

Nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh,

là cơ sở quan trọng để đưa ra các biện pháp trong phòng và điều trị bệnh trên cá biển nuôi Hiện nay, chưa có một công trình nghiên cứu trong nước công bố về

khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn P damselae phân lập tại Việt Nam 1.3.1.6 Gen độc tố và các yếu tố gây bệnh

P damselae subsp damselae là một vi khuẩn biển, gây ra các bệnh trên

cá biển với độc lực cao Các chủng gây dung huyết cao, sản xuất damselysin

một cytolysin được mã hoá bởi gen dly Nghiên cứu của Amable et al., (2011)

đã xác định được gen này nằm trên plasmid được ký hiệu là pPHDD1 có kích thước là 153.429bp Bên cạnh đó, các tác giả này đã chỉ ra rằng, trên plasmid

pPHDD1 còn chứa gen hlyA mã hóa độc tố gây thủng tế bào vật chủ Bằng

phương pháp gây đột biến, các tác giả đã phát hiện có mối tương quan chặt

chẽ giữa 2 gen độc tố dly và hlyA, các dòng vi khuẩn bị gây đột biến cả hai gen dly và hlyA đều không gây dung huyết hồng cầu cừu và hồng cầu người,

tuy nhiên ở các dòng vi khuẩn đột biến đơn lẻ 1 trong 2 gen này đều không bị giảm khả năng gây dung huyết [28]

Amable et al., (2011) đã xác định được khả năng gây dung huyết của vi khuẩn P damselae subsp Damselae được quyết định bởi sự phối hợp của 2 gen dly và hlyA [28]

Các nghiên cứu khác cho rằng thành phần chính trong các sản phẩm ngoại bào có liên quan đến độc lực bao gồm các protease, hemolysins [128], [168] Những cơ chế này có thể gây phá hủy mô tế bào và gây xuất huyết, đóng một vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh

trong cơ thể cá [62], [160] Tuy nhiên, Osorio et al., (2000) đã chứng minh

rằng sự có mặt của các sản phẩm ngoại bào này không phải là điều kiện quyết định cho khả năng phát sinh độc lực gây bệnh của chủng vi khuẩn này [130] Một số protease trong sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn cũng được coi là yếu

tố độc lực ở nhiều vi khuẩn gây bệnh [66] Protease hạn chế sự hoạt động của

14

enzym đã được phát hiện ở P damselae bao gồm cả phosphatases, esteraza,

amylase và glycosidases

Rất ít thông tin về các yếu tố độc lực của P damselae gây xuất huyết

nhiễm trùng ở động vật thủy sản và con người Một thông tin ban đầu đã được

quan sát thấy giữa khả năng gây bệnh của P damselae ở chuột và cho sản lượng lớn độc tố tiêu tế bào Mẫu gen dly lấy từ phần tinh khiết trong môi

trường nuôi cấy cho thấy khả năng chống lại hồng cầu của 16 loài động vật homeotherm, và chuột là loài động vật nhạy cảm hơn Các nghiên cứu khác

đã báo cáo rằng các sản phẩm ngoại bào của vi khuẩn này cũng có hoạt tính gây dung huyết trên hồng cầu cá bơn

Phân tích sầu về gen dly cho thấy nó có hoạt động D-phospholipase chống

sphingomyelin, phosphatidylcholine và phosphatidylethanolamine Các gen độc

tố dly được nhân bản và trình tự của nó đã được xác định Tuy nhiên, bộ gen của gevf n dly vẫn khó nắm bắt, các quan sát ban đầu thấy rằng chủng gây

dung huyết cao mang lại đột biến tự phát và giảm đáng kể hoạt động gây dung

huyết khi đã bị mất gen dly [33]

Có công trình nghiên cứu ban đầu đã chứng minh rằng, ảnh hưởng lớn

nhất của khả năng dung huyết của P damselae gây nguy hiểm cho chuột

Trên thực tế, các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng liều gây tử vong cho người, cá gần như giống nhau đến 50% liều gây tử vong cho chuột Các

nghiên cứu khác đã báo cáo rằng, các chủng thiếu gen dly vẫn cho thấy độc tính đối với chuột và cá, điều này chỉ ra rằng gen dly không phải là điều kiện

tiên quyết cho độc lực vi khuẩn này [66], [100], [132] Ngoài ra, các sản

phẩm ngoại bào của chủng độc lực không có sự hiện diện của gen dly cũng

gây chết cho cá và chuột, cũng như gây độc cho người Điều này cho thấy các

yếu tố độc lực khác không phải là gen dly, có thể đóng một vai trò quan trọng

Nhìn chung các nghiên cứu đã tập trung nghiên cứu xác định các gen quy định các độc lực của vi khuẩn và các sản phẩm ngoại bào liên quan đến

15

độc tố Kết quả đạt được mang lại nhiều ý nghĩa trong y học giúp chuẩn đoán

và điều trị bệnh do vi khuẩn khuẩn P damselae gây ra Tuy nhiên, số lượng

các công trình nghiên cứu cơ bản về các loài vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản vẫn còn hạn chế, đặc biệt ở Việt Nam rất ít nghiên cứu Việc phân

lập, tìm hiểu về đặc điểm sinh học, cơ chế gây độc và tác hại của P damselae

trên đối tượng cá biển nuôi là rất cần thiết nhằm tìm ra các biện pháp hạn chế thiệt hại cho nghề nuôi thủy sản

1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Photobacterium damselae gây ra trên cá biển

1.3.2.1 Đặc điểm dịch tễ

Vi khuẩn P damselae tồn tại quanh năm trong môi trường nước mặn,

nước lợ và bắt buộc phải có ion Na+ cho sự sống Mật độ vi khuẩn tăng lên tương quan với nhiệt độ nước, vào mùa đông mật độ vi khuẩn ít hơn nhiều so

với mùa ấm Vi khuẩn P damselae có thể phân lập được từ lớp dịch nhầy,

chất bẩn tích tụ trong lồng nuôi, hoặc từ mẫu nước nuôi cá bị bệnh [52] Cá

sống sót sau dịch bệnh có thể là nguồn mang mầm bệnh P damselae trong

nước Cá có thể được gây nhiễm bằng cách tiêm, ngâm, cho ăn thức ăn chứa

vi khuẩn, nuôi chung cá khoẻ với cá bệnh

Rất nhiều báo cáo của các nhà nghiên cứu đề cập đến bệnh do P damselae gây ra trên cá biển nuôi công nghiệp tại nhiều quốc gia trên thế giới

Các loài cá tự nhiên như cá trinh nữ, cá da trơn, cá mập, cá đuối gai độc cũng như các loài cá nuôi như cá mú, cá giò, cá tráp, cá bớp, cá vược đều có khả

năng nhiễm P damselae [145]

Các loài cá biển nuôi bị ảnh hưởng bởi mầm bệnh này bao gồm cá bơn

(Potta maxima), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá chim vây vàng (Trachinotus ovatus), cá bống biển (Sparus aurata), cá chình (Dicentrarchus labrax), cá đuối vàng (Seriola quinqueradiata), cá biển đỏ (Pagrus auriga),

cá biển trắng (Diplodus sargus) và (Argyrosomus regius) [65], [134], [182],

[172], [98]

16

Các nghiên cứu khác đã phân lập vi khuẩn P damselae trên cá mập nâu (Carcharhinus plumbeus), trên rùa da nắng (Dermochelys coriacea), trên nhuyễn thể (Octopus joubini), trên cá heo (Tursiops truncatus và Delphinus delphis),

trên cá voi Bryde và trên các loài giáp xác [46]

P damselae lây truyền theo đường truyền ngang, vi khuẩn có thể lây

nhiễm từ loài cá này sang các loài cá khác hoặc từ cá thể này sang cá thể khác thông qua nước và sự lây lan của căn bệnh này phụ thuộc phần lớn vào nhiệt

độ, độ mặn của môi trường nước [69] Bệnh thường xảy ra với tỷ lệ chết rất cao vào các tháng mùa hè, khi nhiệt độ nước tăng lên trên 18oC Tại các thời điểm khác trong năm cá chết rải rác, ở nhiệt độ thấp cá ở tình trạng ủ bệnh và là nguồn lây lan bệnh trong quần thể

Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng dịch bệnh thường xảy ra khi

cá nuôi tiếp điều kiện bất lợi (stress) như khi nhiệt độ nước tăng, môi trường nước ô nhiễm, lượng oxy trong nước thấp dưới mức cho phép hoặc

cá nuôi ở mật độ cao trong thời gian dài [17], [18] Về mặt lý thuyết thì bệnh lây nhiễm cho cá ở mọi lứa tuổi, kích cỡ, từ giai đoạn ấu trùng, cá giống, đến cá nuôi thương phẩm

1.3.2.2 Dấu hiệu bệnh lý

Dấu hiệu điển hình của bệnh ở cá nhiễm P damselae là xuất hiện vùng

xuất huyết và tổn thương loét trên bề mặt cơ thể Cá bệnh hầu hết có triệu chứng chung khá điển hình trên nhiều loài như: xuất hiện vết loét trên da, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, da sẫm màu, bơi dữ dội Giải phẫu bên trong cơ thể thận

bị sưng, xuất hiện các đốm trắng dạng hạt trong mô thận, gan tuỵ, mang và nội tạng xuất huyết, hoại tử trong nội tạng, hoại tử tập trung ở thận và lá lách, gây nhiễm trùng Bệnh cấp tính cá chết sau 5 - 10 ngày với tỉ lệ cao, có thể từ

80 - 100% Cá trinh nữ bị bệnh, vết loét thường xảy ra trong khu vực của các vây ngực và cuống đuôi và có thể đạt 5 - 20 mm Trong khi ở cá bơn các triệu chứng đáng chú ý nhất là xuất huyết sâu rộng trong mắt, miệng, và hàm [65],

17

[66] Ở cá ngừ, các u hạt bao quanh mô hoại tử và vi khuẩn thường xuất hiện nhiều trong lá lách, thận và gan của cá nhiễm [143]

Trong các loài vi khuẩn thì P damselae được nhiều tác giả mô tả như là

một tác nhân nguy hiểm và gây tỷ lệ chết khoảng 80% ở cá giò nuôi[5], [108], [109], [139]

1.3.2.3 Các phương pháp phát hiện P damselae

Có nhiều phương pháp được sử dụng để phát hiện P damselae tuy nhiên

tập trung vào 2 nhóm: vi sinh vật học và sinh học phân tử

Thyssen et al., (2000) sử dụng AFLP để phân loại và nghiên cứu dịch tễ học của các dòng P damselae subsp piscicida và P damselae subsp damselae [166] Osorio et al (2000), sử dụng phương multiplex-PCR với 2 cặp mồi khuếch đại gen 16S rRNA và gen ureC để phân tích 25 dòng của phân loài piscicida và

15 dòng của phân loài damselae Với phương pháp này, tất cả các dòng P damselae subsp damselae đều xuất hiện 2 sản phẩm khuếch đại có kích thước

267 bp và 448 bp, tương ứng kích thước lý thuyết của gen của 16S rRNA và

ureC Các dòng P damselae subsp piscicida chỉ 1 sản phẩm khuếch đại có kích

thước 267 bp tương ứng kích thước lý thuyết của gen của 16S rRNA, tất cả các dòng này đều không có gen ureC trong bộ gen của nó [131]

Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose

(TCBS), khuẩn lạc của P damselae có màu xanh lá cây [97] Trên môi trường Marine Agar, P damselae hình thành các khuẩn lạc có màu nâu vàng hoặc

trắng hơi đục, tròn và lồi [97]

Ngoài ra, P damselae subsp Piscicida còn được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch học, Monique et al (2013) đã sử dụng kỹ thuật kháng thể

huỳnh quang (FA) để phát hiện vi khuẩn trong nước biển, kết quả thí nghiệm

cho thấy phương pháp này có thể phát hiện sớm bệnh Photobacteriosis trong

môi trường nước thậm chí ngay cả khi vi khuẩn chưa gây ra các triệu chứng lâm sàng [119]

18

Francesca và Magnani (2014) cho rằng phương pháp phân tử đại diện cho

sự cải tiến so với các kỹ thuật vi sinh cổ điển để xác định P damselae subsp piscicida và chẩn đoán bệnh Việc sắp xếp, ghi chú và phân tích bộ gen gây

bệnh hoàn chỉnh sẽ cung cấp những hiểu biết sâu về tác nhân gây bệnh làm cơ

sở cho việc phát triển vắc xin và các phương pháp chẩn đoán [70]

Các mô cá nhiễm bệnh P damselae phân loài piscicida ở Ai Cập đã

được nhận diện vi khuẩn thông thường và được phân tích bằng cách sử dụng phản ứng PCR và kỹ thuật miễn dịch mô học Kết quả cho thấy mồi chọn lọc

đã được thiết kế để phát hiện các gen mã hóa protein apoptosis gây ra, AIP56, đại diện cho một công cụ mạnh mẽ để phát hiện nhạy cảm và cụ thể của chủng độc lực của Phdp[127]

1.3.2.4 Phòng và điều trị bệnh

Giảm cho ăn trong thời gian dịch bệnh bùng phát: Ở giai đoạn cấp tính nên giảm một phần thức ăn hoặc giảm hoàn toàn thức ăn có thể giúp kiểm soát và giảm tỷ lệ tử vong Một trong những giả thuyết giải thích cho việc này

là vi khuẩn có mặt trong nước và xâm nhập thuận lợi vào cơ thể theo đường thức ăn [17], [18]

Giảm mật độ nuôi: Khi tỷ lệ tử vong tăng thì việc giảm mật độ nuôi sẽ giúp giảm bớt đi sự căng thẳng và sự lây lan của mầm bệnh trong đàn cá Luôn giữ mức oxy hoà tan ở mức tối ưu bằng cách sử dụng quạt nước thường xuyên [17], [18]

Giảm nhiệt độ của nước: Khi nhiệt độ nước cao dễ tạo căng thẳng cho

cá và là điều kiện thuận lợi để vi khuẩn phát triển Vì vậy, việc hạ thấp nhiệt

độ nước có thể được thực hiện trong hệ thống nuôi nước tuần hoàn nơi mà nhiệt độ nước được kiểm soát Đối với những ao nuôi có kích thước nhỏ có thể dùng lưới che nắng để giảm bớt nhiệt độ nước Sử dụng máy quạt nước vào ban đêm cũng là cách làm giảm nhiệt độ nước và tăng lượng oxy (Bùi Quang Tề, 1998) [17]

19

Điều trị bằng kháng sinh: Kháng sinh chỉ có thể điều trị bệnh ở giai đoạn sớm của bệnh Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp cho cá ăn kháng sinh không hiệu quả bởi cá bị nhiễm bệnh sẽ chán ăn, giảm ăn Hơn nữa những người nuôi cá cho biết thuốc kháng sinh chỉ có thể làm giảm tỷ lệ tử vong trong thời gian sử dụng và khi thuốc kháng sinh đã hết thì tỷ lệ chết lại tăng trở lại Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh cần được chú ý vì sử dụng kháng sinh liên tục với liều lượng cao dần sẽ gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và

ảnh hưởng đến dư lượng kháng sinh tồn dư trong thịt cá [17], [18]

Các loại kháng sinh diệt khuẩn phổ rộng hay diệt khuẩn gram âm với

tác dụng toàn thân có hiệu quả điều trị tốt bệnh do bệnh do vi khuẩn P damselae gây ra như: Amoxicillin, Chloramphenicol, Romycin eryth,

Florfenicol, Flumequine, Acid oxolinic, Oxytetracycline, Nitrofurazone,

Trimethoprim sulfadiazine- và Tetracycline [100]

Các nghiên cứu vắc xin phòng bệnh do P damselae gây ra thường

sử dụng phương pháp làm chết, hoặc bất hoạt vi khuẩn đã được công bố, tuy

nhiêu hiệu chưa cao, hiện nay vẫn còn rất ít vắc xin thương mại

1.4 Tổng quan về tạo chủng vi khuẩn nhược độc

- Các phương pháp làm giảm độc vi khuẩn:

Vi sinh vật giảm độc lực là những vi sinh vật đã được làm giảm độc lực không còn khả năng gây bệnh, nhưng có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh, thời gian duy trì đáp ứng miễn dịch dài [2], [19], [53]

1.4.1 Phương pháp vật lý

- Giảm độc lực bằng nhiệt độ

Vi sinh vật gây bệnh thường mẫn cảm với yếu tố nhiệt độ, nếu nuôi cấy chúng ở nhiệt độ không phù hợp, vi sinh vật sẽ giảm độc lực nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên

20

Vắc xin nhiệt thán: Nuôi vi khuẩn nhiệt thán ở nhiệt độ 42,5- 43ºC từ 15-20 ngày, vi khuẩn mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng làm giống gốc sản xuất vắc xin

Vắc xin Sabin dạng uống chống bại liệt: Chọn các chủng virus bại liệt

đã đột biến, cho nhân lên nhiều lần trong tế bào thận khỉ, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp Virus có thể nhân lên trong tuyến nước bọt đường tiêu hóa nhưng không xâm nhập được vào mô thần kinh do đó không gây chứng bại liệt nữa

- Tia cực tím:

Tia cực tím có thể khử khuẩn vì tác dụng rất mạnh, nó có thể làm biến dạng hoặc giết chết vi khuẩn Hiệu lực diệt khuẩn của tia cực tím không những tuỳ thuộc mật độ, thời gian chiếu tia, điều kiện môi trường mà còn tùy thuộc vào sức chịu đựng của vi khuẩn Ngoài ra do tác dụng của tia cực tím, không khí có thể sinh ra Ozon cũng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn [2]

Trong tế bào, các chất hữu cơ có mạch vòng chủ yếu như purin và pyrimidin hấp thu trực tiếp tia cực tím Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của DNA đã được chứng minh DNA hấp thu tia cực tím mạnh nhất ở bước sống 2537Ǻ (~254nm), đây chính là bước sống làm tăng tần số đột biến Tia UV gây ra sự biến đổi quang oxy hóa các gốc purin

và pirimidin Tác động của tia UV làm cho adenine (A) bị biến thành hypoxantin, dẫn đến những thay đổi hóa học của DNA Tia UV làm cho các base thymin gần nhau bị đứt liên kết C = C mạch vòng nối 2 phân tử tạo dimer thymin, phân tử DNA có nhiều dimer thynin có thể làm mất khả năng tái bản của DNA [2], [19]

21

Hình 1.2 Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine

Ston et al đã nhận thấy tần số đột biến tăng lên ở Staphylococcus aureus khi môi trường nuôi chúng được chiếu tia UV trong thời gian ngắn

trước khi nuôi cấy Mức độ sống sót của các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào liều lượng hấp thụ tia UV Độ đậm đặc của dịch huyền phù được chiếu tia UV ảnh hưởng rõ rệt đến tần số đột biến Dịch huyền phù quá đậm đặc (lớn hơn 1.108 tế bào/ml) tia UV bị các tế bào che lấp lẫn nhau hiệu quả hấp thụ tia UV không cao, ngược lại dịch huyền phù quá loãng dễ gây chết các tế bào khi chiếu Tác động gây chết tế bào và gây đột biến của tia UV còn phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của các tế bào, tuổi giống, loài sinh vật…

1.4.2 Các phương pháp vi sinh vật học

Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển, phần lớn vắc xin virus sử dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này Vi sinh vật gây bệnh được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường ít mẫn cảm (động vật thí nghiệm hoặc môi trường nuôi tế bào hoặc phôi gia cầm) Vi sinh vật không đủ điều kiện để thực hiện đầy đủ chu kỳ sống nên thay đổi bộ gen

để thích nghi với điều kiện sống mới, do đó vi sinh vật thay đổi về độc lực và khả năng gây bệnh [2]

22

- Vắc xin BCG (Bacillus Calmette Guerin) là chủng trực khuẩn lao bò

Mycobacterium tuberculosis bovis có độc lực cao, nuôi cấy trong môi trường

có mật bò trong 13 năm sau 231 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã không còn độc, được sử dụng để sản xuất vắc xin BCG phòng bệnh lao cho con người

- Vắc xin nhiệt thán nhược độc giáp mô được chế bằng cách: Vi khuẩn nhiệt thán nuôi cấy trong môi trường CO2, vi khuẩn không có khả năng hình thành giáp mô Nếu đem vi khuẩn đó nuôi cấy tiếp ở môi trường có đủ O2 thì

vi khuẩn lại hình thành giáp mô, nhưng độc lực yếu không có khả năng gây bệnh được sử dụng làm vắc xin [2]

1.4.3 Đột biến bằng kháng sinh rifampicin

Rifampicin (Rif) lần đầu tiên được thu nhận năm 1957 từ quá trình lên

men của Streptomyces mediterranei , tại phòng thí nghiệm của Gruppo Lepetit

SpA tại Milan Đây là kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh lao và có tác dụng rút ngắn thời gian điều trị bệnh lao bằng liệu pháp hóa học [56], [106]

Rif được sử dụng khá phổ biến trong việc gây nhược độc vi

khuẩn Escherichia coli, Flavobacterium psychrophilum, E ictaluri,… [43], [56] Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri kháng Rif (RE–33) đã được đăng ký bản

quyền (US patent No 6019981) và sử dụng để sản xuất vắc xin sống nhược độc ở dạng thương mại với tên gọi AQUAVAC – ESC™ Bên cạnh đó nhóm

tác giả Benjamin et al., (2008) nghiên cứu đề tài “Phân lập chủng Flavobacterium psychrophilum kháng Rifampicin và hiệu lực của vắc xin sống nhược độc” đã chứng minh chủng Flavobacterium psychrophilum

259-93B.17 kháng Rifampicin có thể đáp ứng như một vắc xin sống nhược

độc cho việc ngăn chặn nhiễm Flavobacterium psychrophilum gây bệnh ở họ

cá hồi [43]

Từ các kết quả nghiên cứu trên các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết: Rif tác động gây đột biến RNA polymerase (RNAP) của chủng vi khuẩn

23

Chính những đột biến gây ảnh hưởng tới hoạt tính của RNAP, tác động đến gen biểu hiện và hình thành đến khả năng nhược độc của vi khuẩn [43], [56] Các đột biến liên quan đến kháng Rif chỉ xảy ra đối với đoạn gen rpoB – mã hóa cho tiểu đơn vị β của phân tử RNAP Đột biến kháng rifampicin xảy ra ở

4 vùng của gen rpoB: vùng N, vùng I, vùng II, vùng III, tuy nhiên những vị trí đột biến chính, xảy ra ở vùng I [96]

Hình 1.3 Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [56]

Hình 1.4 Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB [56]

Những vị trí thay thế amino acid xảy ra ở B anthracis (màu đỏ), B cereus (màu xanh), B subtilis (màu xanh lá cây), E coli (màu tím), và M tuberculosis (xanh lợt), những vị trí mất amino acid là những khung được

24

khoanh lại (ví dụ amino acid V được thay thế cho những vị trí amino acid bị

mất ở E coli), mũi tên chỉ sự chèn thêm amino acid (DQ) ở E coli 10 trong số

12 vị trí amino acid phản ứng trực tiếp với Rif là phần bôi đậm màu xám [96]

So sánh trình tự bốn vùng riêng biệt kháng Rif cho thấy mức độ bảo tồn

cao giữa các prokaryote trong đó giữa vi khuẩn E coli, M tuberculosis Tuy

nhiên, mức độ bảo tồn của trình tự gen rpoB giữa prokaryote và eukaryotic rất thấp nên Rif không có khả năng tác động lên RNAP của eukaryotic

1.4.4 Giảm độc bằng kỹ thuật gen

+ Tái tổ hợp bộ gen (genome):

Virus tái tổ hợp bộ gen được tạo ra bởi kỹ thuật gây nhiễm đồng thời hai chủng virus khác nhau vào cùng một cơ thể vật chủ, virus mới tạo thành sẽ

có bộ gen chứa cả gen của hai chủng virus bố mẹ Ví dụ chủng Rotaviruses tái

tổ hợp sử dụng làm vắc xin tiêm phòng cho con người được tạo thành từ sự trao đổi gen của các chủng gây bệnh trên động vật, hoặc virus cúm tái tổ hợp được tạo ra từ một chủng virus cúm cung cấp các gen mã hóa các glycoprotein

bề mặt miễn dịch (hemagglutinin và neuraminidase) và một chủng nhược độc Tuy nhiên, vắc xin Rotavirus tái tổ hợp theo phương pháp này có khả năng gây hội chứng lồng ruột với tỷ lệ cao (1/10.000) ở người được tiêm phòng, vì vậy, vắc xin này đã bị ngừng cấp phép sản xuất Tác dụng không mong muốn này

cho thấy an toàn là một thách thức lớn trong quy trình sản xuất vắc xin sống

+ Xóa hoặc cắt gen độc:

Chủng nhược độc tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sửa đổi hoặc xóa bỏ các gen độc tố vì vậy khó có khả năng tái trở lại tính độc Đây là giải pháp khắc phục được nhược điểm của vi sinh vật được gây nhược độc bằng phương pháp truyền thống Các kỹ thuật tạo chủng vi khuẩn nhược độc tái tổ hợp phức tạp hơn so với virus do kích thước lớn hơn của bộ gen vi khuẩn

25

+ Tạo vector tái tổ hợp:

Vector tái tổ hợp được tạo ra trên nguyên lý sử dụng một chủng virus làm vector để gắn đoạn gen mã hóa polypeptid từ các tác nhân gây bệnh khác Polypeptid tái tổ hợp được biểu hiện trong các tế bào bị nhiễm virus và được vận chuyển đến bề mặt tế bào để kích thích sản xuất kháng thể dịch thể hoặc

bị phá vỡ thành các mảnh peptid để trình diện cho tế bào lympho T độc Mục đích của việc tạo ra vector là để trình diện kháng nguyên với hệ thống miễn dịch thông qua việc gây nhiễm với một vi sinh vật tái tổ hợp sống, từ đó kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra đáp ứng mạnh hơn, bao gồm cả miễn dịch dịch thể và tế bào [2]

Vi khuẩn gây bệnh cũng có thể được thiết kế thành vector sống tái tổ hợp để biểu hiện các kháng nguyên có bản chất polypeptid Các loài vi khuẩn

được sử dụng làm vector là Salmonella typhimurium, V cholerae và S flexneri chủ yếu để sản xuất các vắc xin đường uống Vắc xin tái tổ hợp nhược

độc được sản xuất theo công nghệ này đòi hỏi phải có hai đặc tính: 1) giữ được khả năng lây nhiễm trong đường ruột và 2) biểu hiện ở mức thích hợp các polypeptid kháng nguyên để kích thích tạo ra đáp ứng miễn dịch bảo hộ vật chủ Bên cạnh đó, một số các loài vi khuẩn nội bào cũng đang được nghiên cứu để thiết kế thành vector tái tổ hợp, tạo đáp ứng miễn dịch tế bào [2]

1.5 Đáp ứng miễn dịch của cá và vắc xin phòng bệnh

1.5.1 Đáp ứng miễn dịch của cá

- Đáp ứng miễn dịch bẩm sinh

Ở cá, đáp ứng miễn dịch bẩm sinh có vai trò quan trọng hơn ở động vật

có vú, đặc biệt là do đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá được hình thành chậm hơn, yếu hơn khi nhiệt độ môi trường sống thấp hơn nhiệt độ tối ưu đối với sinh lý cá [123]

* Interferon

di truyền và nhân lên trong tế bào vật chủ Nhiều nhà khoa học cho rằng, mạch kép này được nhận diện bởi tế bào vật chủ và kích thích các tế bào này tăng tiết cytokine Các cytokine được sinh ra sẽ khuếch tán ra khỏi tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập và nhân lên của virus ở các tế bào lân cận thông qua

cơ chế kích thích các tế bào này sản xuất các protein như 2,5-oligoadenylate synthetase, kinase P1 và Mx Axit polyinosinic: polycytidylic (Poly I: C) là một chất tổng hợp tương tự với dsRNA của virus được chứng minh có khả năng hoạt động như interferon là tạo ra quá trình biểu hiện gen Mx trong cơ

thể cá [161] Rogel-Gaillard et al (1993) đã chứng minh được rằng cá và

các dòng tế bào cá được bảo vệ chống lại một số loài virus khi tiếp xúc với chế phẩm IFN [144]

* Bổ thể

Bổ thể là yếu tố miễn dịch không đặc hiệu có hoạt tính tiêu bào, hóa

ứng động, opsonin và thúc đẩy quá trình thực bào Lorenzen et al., (1999) đã

chứng minh được bổ thể là yếu tố miễn dịch không đặc hiệu có khả năng hạn chế gây nhiễm virus IHN và VSH ở cá thông qua con đường cổ điển được hoạt hóa bởi Ig đặc hiệu [110] Ở cá xương, lớp C3 của bổ thể tồn tại ở nhiều đồng dạng khác nhau, do nhiều gen quy định tổng hợp Vì vậy, quá trình hoạt

hóa bổ thể cao gấp 5-10 lần so với ở động vật có vú Silerendrecht et al.,

(1995) đã phát hiện được 4 dạng C3 ở cá hồi cầu vồng, 5 dạng C3 ở cá chẽm

và 8 dạng C3 ở cá chép Những phân tử đồng dạng của C3 có khả năng tăng cường sự nhận biết và hoạt tính của bổ thể với tác nhân gây bệnh [155]

số thụ thể bề mặt như CD8 tương tự nhau nhưng hoạt động của NK là không đặc hiệu Các tế bào này bảo vệ vật chủ thông qua việc ly giải các tế bào bị nhiễm virus và các tế bào khối u, giúp bảo vệ vật chủ trong giai đoạn đầu của quá trình nhiễm virus cho tới khi các tế bào lympho T độc (Tc) được biệt hóa hoàn chỉnh Hoạt động gây độc không đặc hiệu qua trung gian tế bào (non-specific Cell-Mediated cytotoxic -CMC) đã được chứng minh ở nhiều loài cá khác nhau Ở cá hồi Đại Tây Dương nhiễm virus gây bệnh hoại

tử tuyến tụy (IPNV) đã phát hiện thấy có sự gia tăng tác dụng gây độc tế bào của bạch cầu thận [121], [126] Ở cá da trơn, cả tế bào gây độc không đặc hiệu (NCC) và tế bào NK đều hoạt động gây độc theo cơ chế không đặc hiệu qua trung gian tế bào [153]

* Glucanβ-glucans là các polysaccharide được tạo thành từ glucose với

các liên kết glucosidic Chúng được tìm thấy trong thành tế bào của vi khuẩn, thực vật và nấm Các hoạt động kích thích miễn dịch của β-glucans ở cá và

các động vật khác chứng minh bởi Ai Q et al., (2007); MasudaY et al., (2009)

[26], [116] Tỷ lệ nhiễm IHNV ở cá hồi vân được tiêm glucan thấp hơn so với những lô đối chứng được tiêm bằng nước muối sinh lý trong trường hợp cá thí

nghiệm và đối chứng đều không có kháng thể trung hòa virus (LaPatra et al., 1989) [101] Yu-sin et al., (2009) đã chứng minh sự kích thích biểu hiện gen

Mx của β-glucan trong cá trắm cỏ gây nhiễm virus gây bệnh xuất huyết (Grass Carp Hemorrhage Virus -GCHV) trong vòng 12 giờ Sự duy trì biểu hiện gen Mx ở cá thí nghiệm vẫn ở mức cao cho tới ngày thứ 10 cho thấy quá