Vi sinh vật giảm độc lực là những vi sinh vật đã được làm giảm độc lực không còn khả năng gây bệnh, nhưng có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch mạnh, thời gian duy trì đáp ứng miễn dịch dài [2], [19], [53].
1.4.1. Phương pháp vật lý
- Giảm độc lực bằng nhiệt độ
Vi sinh vật gây bệnh thường mẫn cảm với yếu tố nhiệt độ, nếu nuôi cấy chúng ở nhiệt độ không phù hợp, vi sinh vật sẽ giảm độc lực nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên.
20
Vắc xin nhiệt thán: Nuôi vi khuẩn nhiệt thán ở nhiệt độ 42,5- 43ºC từ 15-20 ngày, vi khuẩn mất khả năng hình thành giáp mô, độc lực giảm, sử dụng làm giống gốc sản xuất vắc xin.
Vắc xin Sabin dạng uống chống bại liệt: Chọn các chủng virus bại liệt đã đột biến, cho nhân lên nhiều lần trong tế bào thận khỉ, nuôi cấy ở nhiệt độ thấp. Virus có thể nhân lên trong tuyến nước bọt đường tiêu hóa nhưng không xâm nhập được vào mô thần kinh do đó không gây chứng bại liệt nữa.
- Tia cực tím:
Tia cực tím có thể khử khuẩn vì tác dụng rất mạnh, nó có thể làm biến dạng hoặc giết chết vi khuẩn. Hiệu lực diệt khuẩn của tia cực tím không những tuỳ thuộc mật độ, thời gian chiếu tia, điều kiện môi trường mà còn tùy thuộc vào sức chịu đựng của vi khuẩn. Ngoài ra do tác dụng của tia cực tím, không khí có thể sinh ra Ozon cũng có khả năng tiêu diệt vi khuẩn [2].
Trong tế bào, các chất hữu cơ có mạch vòng chủ yếu như purin và pyrimidin hấp thu trực tiếp tia cực tím. Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của DNA đã được chứng minh. DNA hấp thu tia cực tím mạnh nhất ở bước sống 2537Ǻ (~254nm), đây chính là bước sống làm tăng tần số đột biến. Tia UV gây ra sự biến đổi quang oxy hóa các gốc purin và pirimidin. Tác động của tia UV làm cho adenine (A) bị biến thành hypoxantin, dẫn đến những thay đổi hóa học của DNA. Tia UV làm cho các base thymin gần nhau bị đứt liên kết C = C mạch vòng nối 2 phân tử tạo dimer thymin, phân tử DNA có nhiều dimer thynin có thể làm mất khả năng tái bản của DNA [2], [19].
21
Hình 1.2. Tác động của tia tử ngoại tạo các dimer thymine.
Ston et al. đã nhận thấy tần số đột biến tăng lên ở Staphylococcus aureus khi môi trường nuôi chúng được chiếu tia UV trong thời gian ngắn trước khi nuôi cấy. Mức độ sống sót của các tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào liều lượng hấp thụ tia UV. Độ đậm đặc của dịch huyền phù được chiếu tia UV ảnh hưởng rõ rệt đến tần số đột biến. Dịch huyền phù quá đậm đặc (lớn hơn 1.108 tế bào/ml) tia UV bị các tế bào che lấp lẫn nhau hiệu quả hấp thụ tia UV không cao, ngược lại dịch huyền phù quá loãng dễ gây chết các tế bào khi chiếu. Tác động gây chết tế bào và gây đột biến của tia UV còn phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của các tế bào, tuổi giống, loài sinh vật…
1.4.2. Các phương pháp vi sinh vật học
Đây là phương pháp giảm độc vi sinh vật cổ điển, phần lớn vắc xin virus sử dụng cho người, động vật được sản xuất theo phương pháp này. Vi sinh vật gây bệnh được cấy chuyển nhiều đời qua môi trường ít mẫn cảm (động vật thí nghiệm hoặc môi trường nuôi tế bào hoặc phôi gia cầm). Vi sinh vật không đủ điều kiện để thực hiện đầy đủ chu kỳ sống nên thay đổi bộ gen để thích nghi với điều kiện sống mới, do đó vi sinh vật thay đổi về độc lực và khả năng gây bệnh [2].
22
- Vắc xin BCG (Bacillus Calmette Guerin) là chủng trực khuẩn lao bò Mycobacterium tuberculosis bovis có độc lực cao, nuôi cấy trong môi trường có mật bò trong 13 năm sau 231 lần cấy chuyển, vi khuẩn đã không còn độc, được sử dụng để sản xuất vắc xin BCG phòng bệnh lao cho con người.
- Vắc xin nhiệt thán nhược độc giáp mô được chế bằng cách: Vi khuẩn nhiệt thán nuôi cấy trong môi trường CO2, vi khuẩn không có khả năng hình thành giáp mô. Nếu đem vi khuẩn đó nuôi cấy tiếp ở môi trường có đủ O2 thì vi khuẩn lại hình thành giáp mô, nhưng độc lực yếu không có khả năng gây bệnh được sử dụng làm vắc xin [2].
1.4.3. Đột biến bằng kháng sinh rifampicin
Rifampicin (Rif) lần đầu tiên được thu nhận năm 1957 từ quá trình lên men của Streptomyces mediterranei , tại phòng thí nghiệm của Gruppo Lepetit SpA tại Milan. Đây là kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, được sử dụng làm thuốc chữa bệnh lao và có tác dụng rút ngắn thời gian điều trị bệnh lao bằng liệu pháp hóa học [56], [106].
Rif được sử dụng khá phổ biến trong việc gây nhược độc vi khuẩn Escherichia coli, Flavobacterium psychrophilum, E. ictaluri,… [43], [56]. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri kháng Rif (RE–33) đã được đăng ký bản quyền (US patent No. 6019981) và sử dụng để sản xuất vắc xin sống nhược độc ở dạng thương mại với tên gọi AQUAVAC – ESC™. Bên cạnh đó nhóm tác giả Benjamin et al., (2008) nghiên cứu đề tài “Phân lập chủng Flavobacterium psychrophilum kháng Rifampicin và hiệu lực của vắc xin sống nhược độc” đã chứng minh chủng Flavobacterium psychrophilum 259-93B.17 kháng Rifampicin có thể đáp ứng như một vắc xin sống nhược độc cho việc ngăn chặn nhiễm Flavobacterium psychrophilum gây bệnh ở họ cá hồi [43].
Từ các kết quả nghiên cứu trên các nhà khoa học đã đưa ra giả thuyết:
Rif tác động gây đột biến RNA polymerase (RNAP) của chủng vi khuẩn.
23
Chính những đột biến gây ảnh hưởng tới hoạt tính của RNAP, tác động đến gen biểu hiện và hình thành đến khả năng nhược độc của vi khuẩn [43], [56].
Các đột biến liên quan đến kháng Rif chỉ xảy ra đối với đoạn gen rpoB – mã hóa cho tiểu đơn vị β của phân tử RNAP. Đột biến kháng rifampicin xảy ra ở 4 vùng của gen rpoB: vùng N, vùng I, vùng II, vùng III, tuy nhiên những vị trí đột biến chính, xảy ra ở vùng I [96].
Hình 1.3. Vùng kháng Rif của tiểu đơn vị β RNAP [56].
Hình 1.4. Đột biến kháng Rif ở vùng I của gen rpoB [56].
Những vị trí thay thế amino acid xảy ra ở B. anthracis (màu đỏ), B.
cereus (màu xanh), B. subtilis (màu xanh lá cây), E. coli (màu tím), và M.
tuberculosis (xanh lợt), những vị trí mất amino acid là những khung được
24
khoanh lại (ví dụ amino acid V được thay thế cho những vị trí amino acid bị mất ở E. coli), mũi tên chỉ sự chèn thêm amino acid (DQ) ở E. coli. 10 trong số 12 vị trí amino acid phản ứng trực tiếp với Rif là phần bôi đậm màu xám [96].
So sánh trình tự bốn vùng riêng biệt kháng Rif cho thấy mức độ bảo tồn cao giữa các prokaryote trong đó giữa vi khuẩn E. coli, M. tuberculosis. Tuy nhiên, mức độ bảo tồn của trình tự gen rpoB giữa prokaryote và eukaryotic rất thấp nên Rif không có khả năng tác động lên RNAP của eukaryotic.
1.4.4. Giảm độc bằng kỹ thuật gen + Tái tổ hợp bộ gen (genome):
Virus tái tổ hợp bộ gen được tạo ra bởi kỹ thuật gây nhiễm đồng thời hai chủng virus khác nhau vào cùng một cơ thể vật chủ, virus mới tạo thành sẽ có bộ gen chứa cả gen của hai chủng virus bố mẹ. Ví dụ chủng Rotaviruses tái tổ hợp sử dụng làm vắc xin tiêm phòng cho con người được tạo thành từ sự trao đổi gen của các chủng gây bệnh trên động vật, hoặc virus cúm tái tổ hợp được tạo ra từ một chủng virus cúm cung cấp các gen mã hóa các glycoprotein bề mặt miễn dịch (hemagglutinin và neuraminidase) và một chủng nhược độc.
Tuy nhiên, vắc xin Rotavirus tái tổ hợp theo phương pháp này có khả năng gây hội chứng lồng ruột với tỷ lệ cao (1/10.000) ở người được tiêm phòng, vì vậy, vắc xin này đã bị ngừng cấp phép sản xuất. Tác dụng không mong muốn này cho thấy an toàn là một thách thức lớn trong quy trình sản xuất vắc xin sống.
+ Xóa hoặc cắt gen độc:
Chủng nhược độc tái tổ hợp được tạo ra bằng cách sửa đổi hoặc xóa bỏ các gen độc tố vì vậy khó có khả năng tái trở lại tính độc. Đây là giải pháp khắc phục được nhược điểm của vi sinh vật được gây nhược độc bằng phương pháp truyền thống. Các kỹ thuật tạo chủng vi khuẩn nhược độc tái tổ hợp phức tạp hơn so với virus do kích thước lớn hơn của bộ gen vi khuẩn.
25 + Tạo vector tái tổ hợp:
Vector tái tổ hợp được tạo ra trên nguyên lý sử dụng một chủng virus làm vector để gắn đoạn gen mã hóa polypeptid từ các tác nhân gây bệnh khác.
Polypeptid tái tổ hợp được biểu hiện trong các tế bào bị nhiễm virus và được vận chuyển đến bề mặt tế bào để kích thích sản xuất kháng thể dịch thể hoặc bị phá vỡ thành các mảnh peptid để trình diện cho tế bào lympho T độc. Mục đích của việc tạo ra vector là để trình diện kháng nguyên với hệ thống miễn dịch thông qua việc gây nhiễm với một vi sinh vật tái tổ hợp sống, từ đó kích thích hệ thống miễn dịch tạo ra đáp ứng mạnh hơn, bao gồm cả miễn dịch dịch thể và tế bào [2].
Vi khuẩn gây bệnh cũng có thể được thiết kế thành vector sống tái tổ hợp để biểu hiện các kháng nguyên có bản chất polypeptid. Các loài vi khuẩn được sử dụng làm vector là Salmonella typhimurium, V. cholerae và S.
flexneri chủ yếu để sản xuất các vắc xin đường uống. Vắc xin tái tổ hợp nhược độc được sản xuất theo công nghệ này đòi hỏi phải có hai đặc tính: 1) giữ được khả năng lây nhiễm trong đường ruột và 2) biểu hiện ở mức thích hợp các polypeptid kháng nguyên để kích thích tạo ra đáp ứng miễn dịch bảo hộ vật chủ. Bên cạnh đó, một số các loài vi khuẩn nội bào cũng đang được nghiên cứu để thiết kế thành vector tái tổ hợp, tạo đáp ứng miễn dịch tế bào [2].