- Tinh sạch cDNA Survivin
2.5.2.Kỹ thuật nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu được sử dụng trong thời gian khoảng 1 tháng sau khi thu thập.
► Kỹ thuật tách chiết RNA tổng số từ các mẫu bệnh phẩm của bờnh nhõn UTV.
Quá trình tách chiết RNA được thực hiện (theo Kit S.N.A.P của hãng Invitrogen) trong điều kiện các dụng cụ đều được xử lý bằng DEPC 0,1% qua đêm để loại bỏ RNase. Sau đó khử trùng hơi với nhiệt độ và áp suất cao (140oC; 0,9 atm; thời gian 45’).
• Mẫu máu của bệnh nhân UTV sau khi thu thập được tách RNA tổng số. Quá trình này gồm có 2 bước
Bước thứ nhất: Tách nucleic acid tổng số
- Lấy 200àl mỏu vào ống ependoft sạch RNase
- Bổ sung proteinase K. Vortex 30 giây, ủ 20 phút ở 37oC - Ly tâm 12.000v/p, thu dịch
- Bổ sung 400 àl isopropanol, đảo đều. Chuyển dịch sang cột S.N.A.P. - Ly tâm 1 phỳt,12.000v/p, bỏ dịch ly tâm.
- Rửa 2 lần bằng dung dịch 1 X
- Sau 2 lần rửa ly tâm cột, thời gian 2 phút để loại bỏ hết dịch. - Dùng 135 àl nước không chứa RNase để thu nucleic acid tổng số
Bước thứ hai: Loại DNA
- Thêm 15 àl đệm 10X và 1àl (2 đơn vị) DNase (không chứa RNase) - Ủ 37oC trong 10 phỳt. Thờm 450àl đệm gắn kết, đảo ngược ống 5-6
lần.
- Thêm 400 àl isopropanol và đảo ống 6 - 10 lần. - Chuyển dịch vào một cột S.N.A.P mới.
- Ly tâm tốc độ tối đa trong 1 phút, loại dịch ly tâm. - Rửa 2 lần bằng dung dịch 1 X
- Sau 2 lần rửa ly tâm cột, thời gian 2 phút để loại hết dịch. - Dùng 125 àl nước không chứa RNase để thu RNA tổng số.
• Mẫu mô của bệnh nhân UTV: Cân khoảng 120-150 mg, cho 1ml Isogen cùng với bệnh phẩm vào trong cối sứ nghiền nát tạo thành một dung dịch đồng nhất, Isogen có tác dụng phá vỡ tế bào, giải phóng ra nucleic acid. - Dịch thu được cho vào ống ependoft sạch RNase để ở nhiệt độ phòng 5
phút, sau đó ly tâm 12.000v/p ở 4oC trong 10 phút.
- Ly tâm, hút phần dịch ở giữa ống, loại bỏ phần trên cùng là lớp lipid và phần cặn xác tế bào ở đáy ống.
- Bổ xung 200àg chloroform, đảo đều 15 giây sau đó ủ 3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 12.000v/p ở 4oC trong 15 phút. Dịch sau ly tâm chia làm 3 lớp: + Lớp trờn cùng chứa RNA tổng số
+ Lớp giữa chứa DNA + Lớp cuối là protein.
- Dùng pipet hút phần dịch trên cùng và chuyển sang ống ependoft mới. - Thêm 500 àl isopropanol, đảo đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 12.000v/p ở 4oC trong 15 phút
- Loại dịch nổi sau ly tâm, RNA tổng số nằm ở phần đáy ống.
- Rửa cặn bằng 1ml dung dịch ethanol 75% lạnh sạch RNase, đảo nhẹ. - Ly tâm 12.000v/p ở 4oC trong 10 phút.
- Loại dịch nổi, giữ lại phần cặn, mở nắp ống để khô tự nhiên.
- Hòa tan lại bằng 25 àl nước không chứa RNase để thu RNA tổng số. Cất giữ RNA tổng số thu được ở - 80oC
► Kỹ thuật RT-PCR tổng hợp chuỗi cDNA
RT-PCR(hay còn gọi là phiờn mó ngược PCR) là một kỹ thuật sử dụng RNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên chuỗi DNA bổ sung (cDNA), gồm có 2 giai đoạn: 1) Giai đoạn thứ nhất tổng hợp cDNA (complementary DNA) từ RNA dưới tác dụng của enzyme phiờn mó ngược và các mồi oligo- (T) hoặc các mồi ngẫu nhiên; 2) giai đoạn nhân bản gen quan tâm từ cDNA bằng PCR với các mồi đặc hiệu dưới tác dụng của DNA polymerase.
Nguyên liệu của quá trình này là dNTP với sự tham gia của enzyme phiờn mã ngược MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse Trancriptase) và các thành phần khác như: Taq polymerase, dung dịch đệm PCR 5X, mồi ngẫu nhiên (Random primer), chất ức chế enzyme RNA (RNAase inhibitor), protease inhibitor (DTT), nước cất DEPC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiến hành như sau:
- Lấy 5àg RNA tổng số cho mỗi tube, hoàn thành vừa đủ 6àl với nước cất DEPC, ủ ở 65-70oC trong 5-10 phút để biến tính chuỗi RNA, sau đó cho vào đá lạnh 1 phút.
- Random primer: 2àl; đó được pha loãng 20 lần. - dNTP 10mM: 5àl
- Để hỗn hợp trên ở nhiệt độ 20- 25oC trong 10 phút, để primer gắn với RNA khuôn, sau đó để vào đá lạnh 1 phút.
- Tiếp tục cho vào :
+ PCR buffer 5X 4àl
+ Protease inhibitor 0,1M 1àl + RNAase inhibitor 1àl
+ MMLV-RT 1àl
Tổng thể tích của phản ứng : 20 àl
- Sau khi trộn đều các thành phần phản ứng bằng pipet, ly tâm thật nhanh khoảng 10-15 giây.
94oC : 5 phút 94°C : 30giây
55°C : 20giây 35-40 chu kỳ 72°C : 20giây
72oC : 5 phút
4 oC : bảo quản tạm thời
Sau khi kết thúc quá trình tổng hợp, lấy sản phẩm ra ly tâm nhanh, thu được c DNA, cất giữ ở -200C. Để kiểm tra chất lượng cDNA tách chiết từ RNA tổng số, sử dụng kỹ thuật PCR với mồi GAPDH
► Phản ứng PCR sử dụng mồi GAPDH
- 10X buffer : 2 àl.
- dNTP : 2 àl.
- Tag polymerase : 0,2 àl. - GAPDH primer (10 pmol/ml)
+ Forward : 1 àl
+ Reverse : 1 àl
- cDNA : 1 àl- 1,5 àl. - Nước cất : 11,8 àl- 8,8 àl
Tổng thể tích phản ứng : 20 àl
• Khi tiến hành kiểm tra chất lượng cDNA phải làm đồng thời với mẫu âm (nước cất).
• Chu trình nhiệt của phản ứng PCR như sau: 94oC : 5 phút
72oC : 5 phút
4oC : bảo quản tạm thời
• Sản phẩm PCR được chạy trên agarose 1,5 % để kiểm tra chất lượng cDNA.
Thành công trong tổng hợp cDNA có nghĩa là cDNA sẽ trở thành nguồn nguyên liệu quan trọng cho các quá trình tiếp theo, do đó ảnh hưởng trực tiếp đến rất nhiều các phản ứng PCR trong đó có phản ứng khi sử dụng mồi GAPDH để đánh giá cDNA.
► Phản ứng PCR sử dụng mồi Survivin (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sử dụng cặp mồi do phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học) cung cấp.
Mồi xuôi : 5’- AGGAACTGGCCCTTCTTGGAGG- 3’ Mồi ngược : 5’ - CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3’
94oC : 30giây
55°C : 20giây 35-40 chu kỳ 72°C : 20giây
Với cặp mồi này thực hiện phản ứng PCR với các thành phần sau:
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích
Dung dịch đệm 10X 2,5 àl
Mồi F 10 pmol/àl 1 àl
Mồi R 10 pmol/ àl 1 àl
DNA khuôn 10-100pmol/ àl 1 àl
Taq-polymerase 5 unit/ àl 0,5 àl
dNTPs 10nM 2,5 àl
Mgcl2 25mM 2,5 àl
BSA 1X 1mg/ml 4 àl
Bổ sung H2O đủ 10 àl
PCR dự định thực hiện với chu trình nhiệt như sau : Biến tính ở 94oC:2 phút; Thực hiện 30 chu kỳ phản ứng với chu trình nhiệt : Biến tính 94oC – 45 giây, bắt cặp 50-60oC – 45 giây, kéo dài 72oC- 8 phút để hoàn tất phản ứng; Sau đó mẫu được giữ ở 4oC. Tuy nhiên, đối với mỗi cặp primer cần xác định nhiệt độ bắt cặp thích hợp.
► Kỹ thuật điện di trên gel agarose 1,5%.
* Nguyên tắc
Dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic. Đó là các phân tử tích điện âm đều khắp bề mặt nên khi chịu tác động của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương. Phát hiện sản phẩm PCR qua quan sát dưới đèn UV nhờ phát màu của ethidium bromide gắn xen trong DNA [6].
- Cách chuẩn bị gel agarose 1,5%
Cân 1,5 g agarose hòa tan vừa đủ 10 ml Tris boric acid EDTA (TBE) ( sử dụng lò vi sóng). Sauk hi agarose tan hết để nguội 55-60oC, đổ vào khuôn gel, tùy thuộc vào số lượng giờngs cần cho điện di mà cài lược làm giếng từ 4-6-8-10 răng.
- Cách pha dung dịch TBE 10 X
- Kỹ thuật điện di trên gel agarose 1,5%.
Thành phần Ống chuẩn Ống bệnh phẩm
Dung dịch TLPT chuẩn(Hae III) 10 àl
cDNA - 9 àl
Loading buffer 10 X - 1 àl
Tổng số 10 àl 10 àl
- Đưa gel agarose vào máy điện di, cho TBE đến ngập gel.
- Dung pipet và đầu côn nhỏ hút lần lượt dung dịch ở mỗi ống đưa vào giếng (10 àl/ giếng). Điện di trong khoảng 30 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Nhuộm bản gel với ethidium bromide trong khoảng 20 phút rồi rửa lại bằng nước cất.
- Hiển thị sản phẩm khuếch đại dưới ánh sáng đèn cực tím (UV) của máy soi gel. Sản phẩm khuếch đại được nhận biết nhờ kích thước của chúng dựa vào thang DNA chuẩn.
- Chụp ảnh.
► Giải trình tự DNA
- Xác định trình tự gen Survivin dựa trên phương pháp của Sanger và cộng sự. Qui trình xác định trình tự gồm 3 bước:
• Bước 1: Thực hiện PCR với hỗn hợp phản ứng giải trình tự gồm: 14àl nước cất vô trùng
4àl DTCS
0,5àl mồi (10pmol/àl) 50-100ng DNA khuôn
Hỗn hợp trên được thực hiện 30 chu kỳ với chu trình luân nhiệt được thực hiện trờn mỏy PCR 9700 :
96oC trong 20 giây 50oC trong 20 giây 60oC trong 4 phút
• Bước 2 : Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự bằng ethanol:
Theo nguyên tắc: acid nucleic là chất tan trong nước và tích điện âm PO3, khi hòa tan với dung dịch muối Natri thì điện tích âm sẽ kết hợp với điện
tích dương (Na+) thành phân tử không tan trong nước và kết tủa. Nước có hằng số điện môi cao, do vậy làm cho Na+ và PO3- khó kết hợp với nhau. Ngược lại, ethanol có hằng số điện môi thấp, nên tạo điều kiện cho Na+ tương tác với PO3-, làm kết tủa acid nucleic [32].
- Bổ xung 5 àl EDTA 12,5mM, pH = 8. Ly tâm 4000 v/p trong 45 giây. - Thờm 60àl ethanol 95%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
- Ly tâm 4500 v/p trong 45 phút để thu cặn.
- Rửa cặn bằng 60àl ethanol 70%. Ly tâm 10.000v/p để thu cặn. - Để khô cặn ở nhiệt độ phòng trong 3 phút.
- Khi cặn khô, thêm vào 10àl Hidiformamide, trộn đều nhẹ nhàng. - Biến tính ở 95oC trong 3 phút.
• Xác định trình tự trờn mỏy:
Sản phẩm PCR giải trình tự sau khi đã tinh sạch được đưa vào máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied Biosystems) để đọc trình tự.
►So sánh với trình tự nucleotide gen Survivin đã công bố trong ngân hàng gen