2.1. Đối tượng nghiên cứu
+ Nhóm bệnh
- Mẫu máu : 10 mẫu máu của bệnh nhân UTV giai đoạn, III, IV đã được chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học.
- Mẫu mô : 10 mẫu mô của bệnh nhân UTV giai đoạn,III, IV đã được chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học
Các bệnh nhân được làm các xét nghiệm hoá sinh, huyết học, X- quang, tại viện K.
*Tiêu chuẩn loại trừ : Có bất kỳ một khối u hay ung thư một cơ quan nào khác ngoài ung thư vú.
+ Nhóm chứng
- Mẫu máu : 01của người phụ nữ khỏe mạnh bình thường làm chứng âm mỗi lần thử nghiệm.
- Mẫu máu : 05 của bệnh nhân u vú lành tính dùng làm mẫu chứng.Cỏc bệnh nhân này cũng được chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học tại viện K. Bệnh nhân không mắc bất kỳ một loại hình bệnh tật hay ung thư nào khác.
Lấy mẫu
Sau khi có kết quả chẩn đoán của lâm sàng và cận lâm sàng, những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn của nghiên cứu sẽ được lựa chọn. Bệnh nhân được hẹn ngày lấy máu và phẫu thuật cắt bỏ khối u ung thư.
- Mẫu máu: Bệnh nhân được lấy máu theo đường tĩnh mạch, số lượng khoảng 5ml vào ống chống đông Heparin.
- Mẫu mô: Được lấy trên cùng bệnh nhân lấy máu, ngay sau khi bệnh nhân được phẫu thuật cắt bỏ khối u, mẫu được chuyển về khoa giải phẫu
bệnh, tại đây mẫu mô được làm chẩn đoán mô bệnh học nhanh, cho kết quả trong vòng 30 phỳt.Mẫu được lấy vào lọ vô trùng. Việc lấy mẫu được tiến hành bởi các nhà mô bệnh học, mẫu phải được lấy đúng vào mô ung thư nhằm đảm bảo độ chính xác cho kết quả nghiên cứu.
Quy trình lấy mẫu phải được đảm bảo vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ - 800C
2.2.Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ 3/2011 đến tháng 10/2011
- Địa điểm nghiên cứu:
+ Phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen Viện Công nghệ sinh học. + Phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa sinh Đại Học Y Hà Nội.
+Trung tâm nghiên cứu gen và protein – Trường Đại học Y Hà Nội
2.3. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang. Kết quả thu được được xử lý trên hệ thống máy tính bằng các thuật toán y sinh học.
2.4. Phương tiện nghiên cứu 2.4.1.Dụng cụ: 2.4.1.Dụng cụ:
Dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (hấp ướt 1200C trong vòng 20 phút). - Máy Gene Amp PCR System 9700(USA); Effpendorf (Đức)
- Tủ lạnh sâu: -300 C; - 800C ( Sanyo), tủ ấm
- Máy điện di ngang Mupid ( Nhật Bản), Máy điện di mao quản Agilent 2100 Bioanalyzer
- Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm để bàn Effpendorf (Đức) - Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)
- Máy xác định trình tự DNA tự động :ABI 3100, Applied Biosystems, USA - Pipet định mức, đầu cụn cỏc loại, ống PCR, ống effpendorf 1,5ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm đã được vô trùng tuyệt đối.
- Lò vi súng,tủ sấy, tủ đá, nồi hấp thanh trùng và các thiết bị khác thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen (Viện Công nghệ sinh học), khoa hoa sinh Đại Học Y Hà Nội, Trung tâm nghiên cứu gen và Protein Trường Đại Học Y Hà Nội.
2.4.2. Hóa chất
- Húa chất dùng để tách chiết RNA tổng số : Isogen,cloroform, Isopropannol, Ethanol 75%, DEPC – water.
- Húa chất dùng để tổng hợp cDNA : Random primer, dNTP 10mM, PCR buffer 5X, DTT 0,1M (proteinase inhibitor), HPRI (RNAase inhibitor), MMLV-RT (Enzym phiờn mó ngược).
- Hóa chất dùng cho PCR : 10X buffer, dNTP mix, Taq polymerase, GAPDH primer (10pmol/àl), nước cất.
*Mồi GAPDH (kiểm tra chất lượng cDNA).
Mồi xuôi : 5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC- 3’ Mồi ngược: 5’- GAAGATGGTGATGGGATTC- 3’ + Mồi Survivin.
Mồi xuôi : 5’- AGGAACTGGCCCTTCTTGGAGG- 3’ Mồi ngược: 5’ - CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3’
2.5. Quy trình và kỹ thuật nghiên cứu2.5.1. Quy trình nghiên cứu 2.5.1. Quy trình nghiên cứu
BN nghi ngờ UTV
BN có u xơ vú BN UTV giai đoạn khác
Máu Mô
(Lấy ngay khi mổ)
Gen cDNA survivin theo các đk
Kết quả
So sánh trình tự gen survivin với ngân hàng gen đã biết Giải trình tự gen survivin
Lâm sàng