Nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú (UTV) loại ung thư (UT) phổ biến phụ nữ nhiều nước giới, đặc biệt nước phát triển UTV chiếm gần 30% loại UT phụ nữ, ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ số loại ung thư [39] Theo hiệp hội ung thư Mỹ, năm 2008, toàn giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú chẩn đoán 458.503 ca tử vong [40] Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV Hà Nội khoảng 30/ 100.000 dân TP Hồ Chí Minh khoảng 20/ 100.000 dân, đứng đầu loại UT phụ nữ [17] Mặc dù có nhiều tiến tầm soát, phẫu thuật thuốc điều trị ngày có hiệu nhiều trường hợp bệnh nhân UTV nguyên phát giai đoạn sớm bị tái phát bệnh tử vong Các phương pháp cận lâm sàng áp dụng chẩn đoán UT phương pháp chẩn đoán hình ảnh, phương pháp sinh thiết phương pháp hóa sinh phát dấu ấn ung thư (tumor marker) Mỗi loại phương pháp chẩn đoán có ưu điểm hạn chế, thường phải kết hợp phương pháp chẩn đoán khác đem lại hiệu chẩn đoán xác chẩn đoán sớm UTV Trong năm gần đây, với phát triển mạnh mẽ ngành sinh học phân tử, có nhiều phương pháp giúp cho việc chẩn đoán phát sớm số loại UT nói chung UTV nói riêng ứng dụng Nguyên tắc chung phương pháp sử dụng kỹ thuật phân tích DNA xác định gen gây UT Việc phát gen UT lấy từ mô UT, hạch bạch huyết tủy xương thực sinh thiết sau phẫu thuật có nhược điểm phát muộn khối u lớn, gây đau đớn cho bệnh nhân, khó làm nhiều lần nên xem phương pháp thường quy để chẩn đoán theo dõi trình điều trị Do vậy, nghiên cứu phát thị UT máu đưa bước tiếp cận có sức thuyết phục nhằm phát di tiềm ẩn từ giai đoạn sớm bệnh nhân ung thư Các tế bào UT có nguồn gốc từ tế bào khối u nguyên phát khối u di căn, sau thâm nhập di chuyển máu ngoại vi gọi tế bào khối u di chuyển (Circulating Tumor Cell - CTC) Các CTC chứng di tế bào UT trước có biểu lâm sàng [58] Hơn nữa, việc phát gen UT lấy từ mẫu máu ngoại vi có ưu điểm gây đau đớn cho bệnh nhân, làm thường quy Vì vậy, việc sử dụng thị khối u để xác định tế bào khối u máu đóng vai trò quan trọng, góp phần xác định sớm trường hợp di căn, giúp cho việc chẩn đoán điều trị có hiệu Một số gen thị khối u phát nghiên cứu có mRNA survivin Gen survivin mã hóa protein ức chế trình chết theo chương trình tế bào (apoptosis) Gen biểu mạnh mô bào thai phát triển nhiều loại ung thư, có UTV, điều đặc biệt có ý nghĩa gen survivin không biểu mô bình thường [17] Do vậy, việc phát gen survivin máu xem công cụ hữu hiệu chẩn đoán sớm tiên lượng theo dõi điều trị bệnh nhân UTV [23][31] [36] Tuy nhiên, Việt Nam chưa có nghiên cứu vấn đề UT nói chung UTV nói riêng Chính vậy, để bước đầu góp phần nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định tế bào UT máu chẩn đoán UTV phụ nữ, tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát gen survivin từ tế bào ung thư vú” với mục tiêu: Xây dựng quy trình phát gen survivin từ tế bào ung thư vú Nhận xét bước đầu giá trị xét nghiệm phát gen survivin chẩn đoán ung thư vú Chương TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm bệnh dịch tễ học UTV 1.1.1 Khái niệm bệnh Ung thư từ dùng để u bướu ác tính phát triển biệt hóa tế bào mô thể tình trạng không kiểm soát Ung thư vú u ác tính phát sinh từ tế bào biểu mô nguồn gốc từ mô vú, phần lớn từ ống dẫn sữa tiểu thuỳ UT có nguồn gốc từ ống sữa gọi ung thư biểu mô tuyến sữa UT có nguồn gốc từ tiểu thuỳ gọi ung thư biểu mô tiểu thuỳ Có nhiều dạng UTV khác với trạng thái khác nhau, ác tính khác nhau, chất di truyền khác tỷ lệ sống sót khác phụ thuộc vào yếu tố 1.1.2 Dịch tễ học UTV Tình hình ung thư vú giới Ung thư vú bệnh ung thư hay gặp phụ nữ mà nguyên nhân gây tử vong phụ nữ nhiều nước Nguy mắc bệnh UTV theo suốt đời người phụ nữ Tỷ lệ mắc thay đổi nhiều, từ 25-35/100.000 dân Anh, Đan Mạch, Hà Lan Canada đến 15/100.000 dân Nhật Bản, Mexico, Venezuela [16] [18] [19] Bệnh có tỷ lệ mắc cao Mỹ Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình Nam Âu,Tây Âu thấp châu Á Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV tăng gấp lần so với năm 50 kỷ XX số nước có công nghiệp phát triển mạnh năm qua Nhật Bản, Singapore, số thành phố Trung Quốc Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc vùng phần giải thích thay đổi lối sống, kinh tế phát triển, ngày có nhiều phụ nữ làm việc lĩnh vực công nghiệp, tuổi thọ trung bình tăng, thay đổi sinh sản, chế độ ăn Theo hiệp hội nghiên cứu ung thư giới, năm2008, toàn giới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú chẩn đoán 458.503 ca tử vong [40] Ở Anh năm 2005 có 212.930 trường hợp mắc bệnh 40.840 ca tử vong [34] Ở Mỹ, năm 2010, 207.000 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú chẩn đoán ước tính có tới 39.800 ca tử vong [39] Tỷ lệ UTV tăng theo tuổi, gặp lứa tuổi 30 (khoảng 0,8%), sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng cách nhanh chóng (khoảng 6,5% tuổi 30-40) Theo thống kê hiệp hội phòng chống UT Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân độ tuổi 30-34 lên đến 200/100.000 dân độ tuổi từ 45-49 [5] Tuy nhiên người ta nhận thấy nguy mắc bệnh tăng chậm độ tuổi từ 45-50 Điều gợi ý UTV loại UT có liên quan mật thiết với nội tiết Tỷ lệ chết UTV tăng lên theo tỷ lệ mắc [5] Tuy nhiên, số nước phát triển tỷ lệ mắc UTV gia tăng nhanh chóng tỷ lệ chết giữ mức ổn định nhờ tiến sàng lọc phát bệnh sớm thành tựu đạt điều trị Tình hình ung thư vú Việt Nam Tại Việt Nam, theo ghi nhận tình hình UT Hà Nội, TP Hồ Chí Minh số tỉnh nhiều năm, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi năm 2000 17,4/100.000 dân Khác với nước phương tây, Việt Nam UTV bắt đầu tăng nhanh độ tuổi 35 đạt tỷ lệ cao độ tuổi trước sau mãn kinh (45-54 tuổi) sau có xu hướng giảm xuống rõ rệt Tại Việt Nam giai đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi Hà Nội 29,7/100.000 dân, TP Hồ Chí Minh Cần Thơ 19,4/100.000 dân, Hải phòng 10,5/100.000 dân, Thái Nguyên 11,6/100.000 dân, Huế 12,2/100.000 dân Đây loại UT có tỷ lệ mắc đứng đầu phụ nữ Việt Nam Tóm lại, UTV bệnh phổ biến tất loại ung thư phụ nữ giới Việt Nam 1.2 Tiến triển giai đoạn ung thư vú 1.2.1 Tiến triển ung thư vú Biểu lâm sàng UTV có đặc trưng kéo dài khác bệnh nhân Đa số trường hợp UTV xâm lấn phát sinh từ tế bào biểu mô thùy ống dẫn tuyến vú Các tế bào bị UT hóa nhân lên với tốc độ khoảng 60 ngày chu kỳ Ước tính, từ tế bào chuyển biến ác tính đến phát khối u có kích thước 1cm phải khoảng thời gian vài năm Chỉ số bệnh nhân (< 3%) sau xuất triệu chứng đầu tiên, UTV tiến triển nhanh tử vong vài tháng [3][4] UTV có khả chữa khỏi nhiều bệnh nhân bệnh chẩn đoán giai đoạn tiền lâm sàng (chưa có triệu chứng hay dấu hiệu lâm sàng) Green Wood, Bloom CS theo dõi trường hợp UTV không điều trị, thấy thời gian sống thêm trung bình kể từ chẩn đoán 31 tháng, tỷ lệ sống thêm năm 40% năm 18 - 20%, có 4% sống thêm 10 năm [5] Giai đoạn chỗ: Khối u nguyên phát xuất phát từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng, tức phần chế tiết tuyến vú Sau phát triển lan sang mô lân cận, xô đẩy tổ chức tuyến vú bình thường Xu hướng vượt khỏi mô tuyến vú xâm nhiễm mô xung quanh đến cấu trúc lân cận da, làm co rút da, sần da cam, phù nề da, đỏ loét da Khi chúng xâm nhiễm đến cân ngực thành ngực tạo thành khối cứng Giai đoạn lan tràn: + Theo đường bạch huyết: Nhờ mạng lưới mạch bạch huyết dày đặc, UTV lan tới chặng hạch hạch nách vị trí hay gặp vị trí dẫn lưu dịch, bạch huyết vú Tiếp theo hạch thượng đòn, vào hệ tuần hoàn tĩnh mạch cạnh sống, đám rối nối trực tiếp với vú qua mạch máu liên sườn + Theo đường máu: Các tế bào UTV di đến khắp nơi thể, nhiên UTV thường di tới xương, phổi, gan, não Khoảng 20 30% bệnh nhân hạch bạch huyết âm tính có di xa chứng tỏ di theo đường máu chủ yếu bệnh nhân [50] Đôi lan tràn xảy thêm từ hệ tĩnh mạch vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết da dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực sau đến màng phổi phổi Các tế bào UTV thường di sớm thời điểm chẩn đoán bệnh phát di phương pháp chẩn đoán có, việc nghiên cứu phát tế bào UTV thực cần thiết góp phần chẩn đoán sớm UTV 1.2.2 Các giai đoạn ung thư vú * Hệ thống xếp giai đoạn TNM Dưới hệ thống xếp giai đoạn (2004) ủy ban Liên kết chống Ung thư Mỹ (AJCC) [34] Hiện nay, hầu hết nghiên cứu có nghiên cứu đa quốc gia áp dụng hệ thống xếp giai đoạn T: U nguyên phát T0 Không có u nguyên phát Tis (UTBM chỗ): UTBM nội ống, UTBM thùy chỗ, bệnh Paget núm vú u T1 U có đường kính lớn ≤ 2cm T2 U có đường kính lớn > 2cm ≤ 5cm T3 U có đường kính lớn > 5cm T4 U xâm lấn thành ngực da kích thước (thành ngực gồm xương sườn, gian sườn, cưa trước, không tính ngực) N: Hạch vùng N0 Không di hạch vùng N1 Di hạch nách bên di động N2 Di hạch nách bên cố định dính di hạch vú bên không di hạch nách N3 Di hạch hạ đòn bên có không kèm hạch nách bên, di hạch vú bên kèm di hạch nách bên, di hạch thượng đòn bên có không kèm hạch nách hạch vú bên M: Di xa M0 Không di xa M1 Có di xa Phân loại có điểm mới: di hạch hạ đòn xếp vào N (trước không đề cập), di hạch thượng đòn không xếp M mà thành N3 Di hạch vú trước xếp vào N 3, phân không kèm di hạch nách (N2b) kèm di hạch nách (N3b) * Xếp giai đoạn lâm sàng Bảng 1.1 Phân chia giai đoạn UTV Giai đoạn I IIA IIB TNM tương ứng Tis N0 M0 T1 N0 M0 T0 N1 M0 T1 N1 M0 T2 N0 M0 T2 N1 M0 T3 N0 M0 T0 N2 M0 T1 N2 M0 IIIA T2 N2 M0 T3 N1 M0 T3 N2 M0 T4 N0 M0 IIIB T4 N1 M0 IIIC IV T4 N2 M0 T bất kỳ, N3, M0 T bất kỳ, N bất kỳ, M1 1.3 Chẩn đoán ung thư vú 1.3.1 Chẩn đoán xác định Chẩn đoán xác định UTV thiết phải có khẳng định giải phẫu bệnh học Giải phẫu bệnh coi “một tiêu chuẩn vàng” chẩn đoán ung thư vú Hiện Bệnh viện K, UTV chẩn đoán xác định dựa vào phương pháp: + Lâm sàng: khối u tính chất khối u + Chụp tuyến vú + Mô bệnh học: chọc hút kim nhỏ Nếu yếu tố nghi ngờ phải sinh thiết tức để chẩn đoán xác định Ngoài phương pháp thông dụng số phương pháp khác như: sinh thiết kim, sinh thiết mở, sinh thiết 48 giờ, chụp vú kỹ thuật số, siêu âm vú, chụp cộng hưởng từ hạt nhân áp dụng cho trường hợp Hiện nay, nhiều lý mà chẩn đoán UTV kỹ thuật sinh học phân tử chưa ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật thường cho kết chẩn đoán xác độ tin cậy cao Chính vậy, tiến hành đề tài nhằm nghiên cứu khả ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử góp phần vào việc phát hiện, chẩn đoán UTV phụ nữ 1.3.2 Chẩn đoán phân biệt - U xơ tuyến vú: thường gặp phụ nữ trẻ, u thường tròn nhẵn, ranh giới rõ ràng, di động Để chẩn đoán phân biệt phải chụp X-quang tuyến vú, làm xét nghiệm mô bệnh học - Viêm xơ tuyến vú nang hóa: gặp nang đơn độc nhiều nang to nhỏ rải rác hai bên vú Kích thước to từ vài mm đến 10cm, chẩn đoán phân biệt nhờ vào siêu âm - Viêm giãn tuyến vú: chảy dịch đầu vú dai dẳng lúc đầu dịch vàng trong, sau bội nhiễm thành dịch vàng mủ chất bã có mùi hôi, số khác chảy dịch máu - Áp xe tuyến vú: có triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau - Nang sữa: hình thành sau trình viêm tắc ống dẫn sữa, nang sữa lỏng đặc sền sệt 10 - U nhú nội ống: tổn thương lòng ống dẫn sữa thường gặp ống dẫn sữa chính, tính chất u tròn, mềm gây chảy dịch, máu qua núm vú - U mỡ hoại tử mỡ vú: gặp - U phyloide lành tuyến vú 1.3.3 Chẩn đoán mô bệnh học Carcinom chiểm khoảng 90% đó: - Carcinom ống tuyến xâm nhập : 78% - Carcinom tiểu thùy : 9% - Carcinomdạng tủy : 1,5% - Carcinom dạng kéo : 1,5% - Sarcom, paget không xếp loại, bệnh paget có khối u phân loại theo kích thước u 1.4 Các yếu tố tiên lượng bệnh UTV Các định điều trị bổ trợ UTV dựa vào yếu tố tiên lượng Bên cạnh việc đánh giá yếu tố tiên lượng kinh điển kích thước u, loại mô học, độ mô học, tình trạng hạch nách, nhà nghiên cứu có xu hướng sâu bệnh học phân tử gen để tìm chất phát triển khối u nhằm đưa phương thức điều trị tối ưu cho bệnh nhân 1.4.1 Hạch vùng Hạch nách: Tình trạng hạch nách coi yếu tố tiên lượng quan trọng liên quan đến tỷ lệ tái phát sống thêm bệnh nhân UTV Tỷ lệ sống thêm, tái phát, thời gian tái phát, thất bại điều trị liên quan chặt chẽ với số lượng hạch di [13] 1.4.2 Khối u nguyên phát 80 Vì vậy, phản ứng real-time RT-PCR, bước đầu định lượng số gen survivin có mẫu máu mô dựa vào đường biểu diễn chuẩn với nồng độ pha loãng dòng tế bào ung thư vú MCF7 Việc định lượng gen survivin mẫu nghiên cứu coi đáng tin cậy để đánh giá bước đầu việc phát gen survivin chẩn đoán UTV Từ kết nghiên cứu trên, xây dựng quy trình phát gen survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành (hình) 4.2 Nhận xét bước đầu giá trị xét nghiệm phát gen survivin chẩn đoán ung thư vú Mỗi năm, toàn giới có 1,000,000 phụ nữ mắc bệnh UTV chẩn đoán Việc phát sớm mục tiêu quan trọng hàng đầu chương trình tầm soát bệnh UTV Nhiều nghiên cứu việc chẩn đoán từ giai đoạn sớm bệnh UTV làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ tử vong loại ung thư ác tính Một bệnh nhân chẩn đoán ung thư từ giai đoạn sớm nhiều lựa chọn phương pháp điều trị mà có tỷ lệ khỏi bệnh cao Mặc dù có nhiều bước tiến chẩn đoán phương pháp phẫu thuật mới, nhiều bệnh nhân UTV nguyên phát chí giai đoạn sớm bị tái phát bệnh tử vong Sự có mặt tế bào ung thư hạch bạch huyết vùng xem số tiên lượng có giá trị UTV Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu khoảng 25- 30% bệnh nhân có hạch bạch huyết âm tính có khả tái phát bệnh di xa vòng 10 năm sau phẫu thuật [50] Sự tái phát ác tính chủ yếu tế bào khối u sót lại sau phẫu thuật điều trị mà không xác định bệnh nhân UTV Do vậy, điều quan trọng tìm marker lý tưởng để phát tế bào khối u vòng tuần hoàn thời điểm chẩn đoán Bởi CTC vào 81 máu từ giai đoạn sớm [58] Hơn nữa, việc phân loại bệnh nhân UTV thành nhóm nguy khác xác việc phân loại bệnh nhân yếu tố bệnh học lâm sàng Nhóm bệnh nhân có nguy thấp không cần thiết phải điều trị, tránh tác dụng phụ mang lại lợi ích kinh tế, nâng cao chất lượng sống cho người bệnh Nhóm bệnh nhân có nguy cao cần phải đưa cách thức điều trị tích cực Survivin protein ức chế apoptosis biểu mức nhiều loại ung thư có UTV [56] Survivin biểu chọn lọc mô ác tính, có chức ức chế apoptosis, đẩy mạnh chu kỳ tế bào tăng sinh mạch, nguyên nhân phát sinh ung thư [55] [57] Việc phát gen survivin máu góp phần tìm marker ung thư lý tưởng giúp cho chẩn đoán, tiên lượng theo dõi điều trị Việc định lượng gen survivin kỹ thuật real-time PCR có thuận lợi kỹ thuật RT-PCR có kết hợp hiệu cao kỹ thuật PCR, độ nhạy độ xác cao phép phân tích phổ sở quan trọng để xây dựng phương pháp xác định xác gen survivin mẫu máu mô nghiên cứu 4.2.1 Kết xét nghiệm sinh hóa dấu ấn ung thư Kết cho thấy khác biệt số sinh hóa CA15-3 nhóm bệnh nhân u xơ nhóm UTV Điều giải thích UTV bệnh chỗ giai đoạn chưa có di xa nên biến đổi giá trị sinh học chưa nhiều Mặc dù CA15-3 coi dấu ấn đặc hiệu cho ung thư vú nghiên cứu biểu tăng CA15-3 chưa rõ, có bệnh nhân có tăng CA15-3, điều phù hợp với đề tài “khảo sát giá trị ngưỡng số dấu ấn ung thư huyết người việt Nam khám điều trị bệnh viện K trung ương” bạn Trần Văn Khôi Chính biến đổi không rõ ràng mà nhà nghiên 82 cứu phải tìm dấu ấn ung thư có độ đặc hiệu cao để chẩn đoán, theo dõi điều trị UTV 4.2.2 Biểu gen survivin mẫu mô nghiên cứu Để đánh giá mức độ biểu gen survivin mô vú bệnh nhân UTV, thực kỹ thuật real-time PCR với cDNA tạo từ mô vú mẫu nghiên cứu Qua phân tích bước đầu, dựa vào kết thu từ việc xây dựng đường chuẩn nồng độ dựa vào dòng tế bào UTV, nhận có biểu gen survivin mô vú đặc biệt không thấy gen survivin biểu nhóm bệnh nhân u xơ vú lành tính Tỷ lệ phát gen survivin mô 9/ 13 bệnh nhân UTV, chiếm tỷ lệ 69.23% Điều đặc biệt có ý nghĩa bệnh nhân ung thư giai đoạn muộn III, IV phát biểu mức gen survivin Điều giải thích mô bệnh học ung thư, tế bào ung thư có lượng lớn tế bào nội mạc tăng sinh mạch tăng cường Các khối u giai đoạn muộn trình tăng sinh mạch mạnh để mang oxy chất dinh dưỡng đến nuôi khối u Chính tăng sinh đóng góp vào việc bảo tồn tính toàn vẹn vi cấu trúc hình ống ức chế apoptosis tế bào nội mạc, làm cho tế bào có khả tồn chức bảo vệ tế bào ung thư Tỷ lệ phát gen survivin mô hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu công bố [48] Tuy nhiên, với số lượng bệnh nhân hạn chế nghiên cứu nên chưa thể đánh giá hết mức độ bệnh dựa theo giai đoạn Như khẳng định lần có mặt mức độ biểu gen survivin mô bệnh nhân ung thư vú 83 4.2.3 Biểu gen survivin mẫu máu nghiên cứu Phát gen survivin biểu mẫu máu bệnh nhân UTV 3/10 bệnh nhân, chiếm tỷ lệ 23,07% Tỷ lệ thấp so với nghiên cứu biểu survivin máu bệnh nhân UTV công bố [38] Tuy nhiên, số lượng bệnh nhân nhóm nghiên cứu thấp, bệnh nhân giai đoạn không đồng việc sử dụng kỹ thuật khác Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu có bệnh nhân có biểu dương tính với survivin máu mô bệnh nhân UTV độ III IV Do biểu gen survivin máu có liên quan đến số bệnh học lâm sàng tình trạng hạch bạch huyết, kích thước khối u giai đoạn bệnh bệnh nhân Biểu survivin cao nhóm UTV thể ống xâm nhập so với nhóm UTV thể tủy, thể tiểu thùy Như thấy biểu survivin có liên quan tới mức độ ác tính bệnh nhân Bệnh nhân nặng biểu survivin nhiều Biểu survivin cao nhóm UTV thể ống xâm nhập so với nhóm UTV thể tủy, thể tiểu thùy Do vậy, sử dụng kỹ thuật real-time PCR định lượng xác mRNA survivin mà phát lưu hành tế bào UTV máu 4.2.4 Mối liên quan mức độ biểu gen survivin mẫu máu mô nghiên cứu Mức độ biểu gen survivin mẫu mô vú (69,23%) cao so với mẫu máu (23,07%) bệnh nhân UTV Tuy nhiên tỷ lệ phát chưa thể nói nhiều số lượng bệnh nhân thấp kỹ thuật phát phải hoàn thiện thêm nhiều bước trình thu thập mẫu máu bệnh nhân: phải lấy thêm đến 10ml máu để có tỷ lệ phát tế bào ung thư cao hơn, việc tách chiết RNA, tạo cDNA, cặp mồi sử dụng việc khuếch đại gen survivin, kỹ thuật real-time PCR 84 tạo đường chuẩn dựa vào dòng tế bào ung thư vú đặc hiệu với gen survivin, xây dựng độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật 4.2.5 Mối liên quan mức độ biểu gen survivin số lâm sàng Nhận thấy mức độ biểu gen survivin không liên quan đến số lâm sàng tuổi, tình trạng kinh nguyệt Trên bệnh nhân có biểu gen survivin mô máu bệnh nhân giai đoạn III, điều chứng tỏ mức độ biểu gen survivin có liên quan đến kích thước khối u, độ mô học, di hạch bạch huyết giai đoạn bệnh Mặc dù nghiên cứu số lượng số lượng bệnh nhân hạn chế song kết nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu công trình nghiên cứu công bố trước [32][38][48] Như vậy, với nghiên cứu phát gen survivin mức độ mRNA kỹ thuật real-time RT-PCR cho phép khẳng định biểu mức gen survivin bệnh nhân UTV Sự phát gen survivin máu lần có mặt tế bào UTV có liên quan mật thiết đến số lâm sàng bệnh nhân Từ kết nghiên cứu bước đầu, xây dựng quy trình phát gen survivin dựa vào cặp mồi survivin F/ R để phát biểu gen survivin thời gian ngắn (trong vòng ngày) xét nghiệm khác (trình bày mục kỹ thuật phát tế bào ung thư) sơ đánh giá giá trị phát gen survivin tế bào ung thư bệnh nhân UTV Tuy nhiên nghiên cứu lưu hành CTC máu trình phức tạp, đòi hỏi phải có nhiều kinh nghiệm, thời gian kinh phí để xây dựng quy trình hoàn thiện Vì vậy, kết nghiên cứu bộc lộ số hạn chế phản ứng real-time RT-PCR chưa thật đặc hiệu, số sản phẩm không đặc hiệu, chưa làm chứng dương GAPDH để so sánh kết quả, việc xây dựng đường chuẩn 85 phải hoàn thiện thêm, phải xây dựng độ đặc hiệu độ nhạy cho phản ứng real-time RT-PCR Việc phát gen survivin máu lần thực Việt Nam nghiên cứu thành công bước đầu khẳng định có mặt CTC máu, góp phần cho nghiên cứu để chẩn đoán, tiên lượng theo dõi điều trị bệnh nhân ung thư vú để đưa phương pháp điều trị tối ưu cho bệnh nhân ung thư vú nhằm nâng cao chất lượng bệnh nhân ung thư 86 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu phát gen survivin từ tế bào ung thư vú 13 mẫu máu 13 mẫu mô bệnh nhân UTV có đối chứng với 02 mẫu mô u xơ tuyến vú lành tính, có kết luận sau: Đã xây dựng quy trình phát gen survivin từ tế bào ung thư vú với cặp mồi survivin F/R Survivin F: 5’- AGAACTGGCCCTTCTTGGAGG - 3’ Survivin R: 5’- CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC - 3’ Nhận xét bước đầu giá trị xét nghiệm phát gen survivin chẩn đoán ung thư vú - Chúng xác định mức độ biểu gen survivin tế bào ung thư mô máu bệnh nhân ung thư vú Không phát có biểu gen survivin mô vú bệnh nhân u xơ tuyến vú lành tính Hơn nữa, xét nghiệm phát gen survivin nghiên cứu có giá trị đặc hiệu xét nghiệm dấu ấn ung thư thường làm CA 15-3 - Mức độ biểu gen survivin mẫu mô cao mẫu máu bệnh nhân UTV - Mức độ biểu gen survivin mẫu mô mẫu máu bệnh nhân ung thư giai đoạn III - Mức độ biểu gen survivin nhiều thể ống xâm nhập 87 KIẾN NGHỊ - Nên có nghiên cứu với số lượng bệnh nhân lớn để đánh giá xác biểu survivin nhóm bệnh nhân ung thư vú giai đoạn khác nhau, thể mô bệnh học khác Từ ứng dụng để chẩn đoán sớm, tiên lượng theo dõi điều trị - Cần nghiên cứu sâu loại mRNA survivin với cặp mồi khác để đánh giá xác dạng biểu gen survivin loại ung thư khác MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1.Khái niệm bệnh dịch tễ học UTV .3 1.1.1 Khái niệm bệnh 1.1.2 Dịch tễ học UTV .3 1.2.Tiến triển giai đoạn ung thư vú 1.2.1 Tiến triển ung thư vú .5 1.2.2 Các giai đoạn ung thư vú 1.3 Chẩn đoán ung thư vú 1.3.1 Chẩn đoán xác định .8 1.3.2 Chẩn đoán phân biệt .9 1.3.3 Chẩn đoán mô bệnh học 10 1.4 Các yếu tố tiên lượng bệnh UTV 10 1.4.1 Hạch vùng 10 1.4.2 Khối u nguyên phát 10 1.4.3 Vị trí u 11 1.4.4 Giai đoạn bệnh .11 1.4.5 Loại mô học 11 1.4.6 Độ mô học (ĐMH) 11 1.4.7 Tỷ lệ sống theo giai đoạn 12 1.5 Điều trị ung thư vú .12 1.6 Các dấu ấn ung thư chẩn đoán theo dõi điều trị UTV 12 1.6.1 Dấu ấn có chất protein 13 1.6.2 Dấu ấn có chất enzym .13 1.6.3 Dấu ấn có chất receptor 14 1.6.4 Gen đặc hiệu UTV .15 1.7 Gen survivin ung thư vú 18 1.7.1 Khái quát chết theo chương trình tế bào (apoptosis) 18 1.7.2 Survivin 19 1.7.3 Survivin ung thư vú 22 1.8 Các kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng để phát biểu tế bào ung thư 26 1.8.1 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry – IHC) 26 1.8.2 Kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch (Immunocytochemistry- ICC) 27 1.8.3 PCR 28 1.8.4 RT-PCR (Reverse Transcription-PCR) .30 1.8.5 Real-time PCR 31 1.8.6 Kỹ thuật Microarray (Microscopy arrays) 32 1.8.7 Northern blot 33 1.8.8 Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH: fluorescence in situ hybridization) 34 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .36 2.1 Đối tượng nghiên cứu 36 2.2.Thời gian địa điểm nghiên cứu 37 2.3 Phương pháp nghiên cứu 37 2.4 Phương tiện nghiên cứu 37 2.4.1.Dụng cụ 37 2.4.2 Hóa chất 38 2.5 Xây dựng quy trình nghiên cứu 39 2.5.1 Thiết kế mồi 39 2.5.2 Kỹ thuật nghiên cứu 40 2.5.3 Quy trình nghiên cứu 52 2.6 Vấn đề đạo đức đề tài 53 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 Xây dựng qui trình phát gen Survivin dựa vào việc khuếch đại gen survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu ngoại vi mô vú 54 3.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA .54 3.1.2 Kết xác định trình tự đoạn gen mã hóa gen survivin 58 3.1.3 Kết xác định mức độ biểu gen survivin mẫu nghiên cứu 59 3.1.4 Sử dụng phương pháp real-time RT-PCR để định lượng gen survivin mẫu nghiên cứu 61 3.1.5 Quy trình nghiên cứu (trình bày phần phương pháp) .66 3.2 Nhận xét bước đầu giá trị xét nghiệm phát gen survivin chẩn đoán ung thư vú .67 3.2.1 Phân loại mẫu nghiên cứu theo tuổi 67 3.2.2 Kết xét nghiệm sinh hóa bệnh nhân ung thư vú u xơ tuyến vú 67 3.2.3 Phân loại mẫu nghiên cứu theo TNM theo mô bệnh học bệnh UTV .67 3.2.4 Giá trị phát gen survivin bệnh nhân UTV .68 Chương 73 BÀN LUẬN 73 4.1 Xây dựng quy trình phát gen survivin từ tế bào ung thư vú 74 4.1.1 Kết tách chiết RNA tổng số tổng hợp cDNA .74 4.1.2 Kết xác định trình tự đoạn gen mã hóa gen survivin 76 4.1.3 Kết xác định mức độ biểu gen survivin mẫu nghiên cứu 76 4.1.4 Kết định lượng số gen survivin real-time PCR mẫu nghiên cứu 77 4.2 Nhận xét bước đầu giá trị xét nghiệm phát gen survivin chẩn đoán ung thư vú 80 4.2.1 Kết xét nghiệm sinh hóa dấu ấn ung thư 81 4.2.2 Biểu gen survivin mẫu mô nghiên cứu 82 4.2.3 Biểu gen survivin mẫu máu nghiên cứu .83 4.2.4 Mối liên quan mức độ biểu gen survivin mẫu máu mô nghiên cứu 83 4.2.5 Mối liên quan mức độ biểu gen survivin số lâm sàng 84 KẾT LUẬN 86 KIẾN NGHỊ 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân chia giai đoạn UTV .8 Bảng 1.2 Tỷ lệ sống thêm theo giai đoạn 12 Bảng 1.4 Cấu trúc cDNA loại biến thể ghép nối survivin 20 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR khuyếch đại gen GAPDH survivin .46 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng Real-time PCR 51 Bảng 3.1 Kết độ tinh nồng độ RNA tách chiết mẫu nghiên cứu 55 Bảng 3.1 Giá trị Cp số gen survivin mẫu có biểu dương tính với survivin 66 Bảng 3.2 Phân loại tuổi nhóm nghiên cứu 67 Bảng 3.3 Kết xét nghiệm sinh hóa bệnh nhân UTV u xơ vú 67 Bảng 3.4 Số lượng mẫu nghiên cứu theo phân loại mô bệnh học giai đoạn UTV 68 Bảng 3.5 Liên quan tỷ lệ phát gen survivin máu, mô số bệnh học lâm sàng bệnh nhân ung thư vú 71 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Apoptosis .19 Hình 1.2 Survivin 19 Hình 1.3 Sơ đồ NST 17 vị trí gen survivin 20 Hình 1.4 mRNA survivin tiền thân tạo thành mRNA trưởng thành với biến thể ghép nối 21 Hình 1.5 Kỹ thuật IHC 27 Hình 1.6 Các bước phản ứng PCR 30 Hình 1.7 RT-PCR .31 Hình 1.8 Kỹ thuật Microarray 33 Hình 1.9 Kỹ thuật Northern blot .34 Hình 1.10 Kỹ thuật FISH 35 Hình 2.1 Ba loại mRNA survivin: survivin, survivin 2B, survivin ∆Ex3 .39 Hình 2.2 Trình tự đoạn gen surviving 40 Hình 2.3 Ảnh chromas trình tự nucleotide đoạn gen survivin 48 Hình 2.4 Trình tự gen survivin đăng genbank 49 Hình 2.5 Biểu đồ khuếch đại đường biểu diển khuếch đại mẫu chuẩn đường biểu diễn mối quan hệ số lượng DNA đích có mẫu chuẩn số chu kỳ tương ứng 50 Hình 3.1 Hình ảnh điện di gel agarose 0,8% sản phẩm RNA tách chiết từ mẫu nghiên cứu 54 Hình 3.2 Đồ thị quang phổ RNA tách chiết .56 Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR với mồi GAPDH 57 Hình 3.4 Ảnh chromas trình tự nucleotide đoạn gen survivin 58 Hình 3.5 Trình tự nucleotide trình tự amino acid đoạn gen survivin minh họa từ mẫu máu bệnh nhân ung thư vú số 58 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR với mồi survivin 59 Hình 3.7 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR với mồi survivin 60 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm RT- PCR với mồi survivin 60 Hình 3.9 Kết real-time RT-PCR xây dựng đường chuẩn nồng độ .62 Hình 3.10 Kết realtime RT-PCR gen survivin PCR mẫu máu bệnhnhân ung thư vú 63 Hình 3.11 Kết realtime RT-PCR gen survivin PCR mẫu mô bệnh nhân u xơ vú ung thư vú 64 Hình 3.12 Hình ảnh phân tích với melting curve phản ứng real-time RT-PCR với cặp mồi survivin 65 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm real-time PCR với mồi survivin bệnh nhân UTV 69 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm real-time PCR với mồi survivin bệnh nhân UTV 70 ... phát gen survivin từ tế bào ung thư vú với mục tiêu: Xây dựng quy trình phát gen survivin từ tế bào ung thư vú Nhận xét bước đầu giá trị xét nghiệm phát gen survivin chẩn đoán ung thư vú 3... cho tế bào có khả tồn chức bảo vệ tế bào ung thư [59] 1.7.3 Survivin ung thư vú Ung thư vú xảy tế bào khả kiểm soát cân trình tăng trưởng chết tế bào Bình thư ng, tăng trưởng mạnh tế bào bị ức... Nghiên cứu phát gen survivin từ tế bào ung thư vú ” 26 1.8 Các kỹ thuật di truyền phân tử sử dụng để phát biểu tế bào ung thư Phát CTC máu tủy xương đòi hỏi kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao để phát