ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan B mạn tính hiện là một vấn đề sức khỏe toàn cầu do tỷ lệ người nhiễm cao và gây những biến chứng nguy hiểm. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, trên Thế giới có khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) với 400 triệu người nhiễm mạn tính và 1 triệu người tử vong hàng năm do các biến chứng của bệnh [39], [80], [114]. Diễn tiến đến xơ gan, suy gan mất bù và ung thư tế bào gan là những biến chứng nguy hiểm nếu bệnh nhân không được điều trị. Với sự hỗ trợ đắc lực của các kỹ thuật sinh học phân tử, các nhà khoa học trên Thế giới đã xác định được 10 kiểu gen (genotype) và các dưới kiểu gen (subgentype) của HBV [81], [112]. Các nghiên cứu gần đây trên Thế giới cho thấy có mối liên hệ giữa kiểu gen của HBV với đường lây nhiễm, diễn tiến bệnh, sự đáp ứng với điều trị và khả năng xuất hiện các loại đột biến [81], [112]. Mục đích của điều trị viêm gan B mạn tính nhằm ngăn ngừa biến chứng và giảm nguy cơ tử vong cho bệnh nhân. Hiện nay, có 2 nhóm thuốc được công nhận trong điều trị viêm gan B mạn tính là interferon (interferon-α 2a, interferon- α 2b) và các đồng phân nucleotides gồm 5 loại thuốc: Lamivudine, Adefovir, Entecavir, Telbivudine và Tenofovir [62]. Các đồng phân nucleotide có tác dụng ức chế sự tăng sinh của virus trong thời gian dài với mức độ khác nhau tùy loại thuốc, ít tác dụng phụ, làm chậm diễn tiến bệnh, cải thiện tỷ lệ sống và giảm nguy cơ biến chứng cho bệnh nhân. Tuy nhiên, khi sử dụng các thuốc kháng virus này kéo dài có thể xảy ra tình trạng kháng thuốc. Hậu quả lâm sàng của kháng thuốc là gia tăng nồng độ virus trong máu, đảo ngược mức độ cải thiện mô học, giảm tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh HBeAg [108]. Về mặt cơ chế, kháng thuốc trong điều trị viêm gan B là do đặc tính sao chép nhanh của virus, bộ gen virus thiếu cơ chế kiểm soát tính đột biến trong quá trình sao chép. Dưới áp lực chọn lọc của thuốc, các dòng virus có đột biến kháng thuốc sẽ xuất hiện và lan rộng trong quần thể virus tạo nên biểu hiện kháng thuốc [62]. Đã có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến đột biến kháng thuốc của HBV sau một thời gian điều trị. Tỷ lệ kháng thuốc đối với các loại thuốc nói chung đều gia tăng theo thời gian điều trị [62]. Với cơ các chế lây truyền HBV trong cộng đồng và sau một thời gian các đồng phân nucleotides được đưa vào điều trị thì trong cộng đồng có khả năng sẽ xuất hiện những người bị lây nhiễm bởi những chủng virus có sẳn đặc tính kháng thuốc. Những người này một khi có chỉ định điều trị thuốc kháng virus thì khả năng thất bại điều trị do kháng thuốc là hoàn toàn có thể xảy ra. Hiện nay các hướng dẫn điều trị viêm gan B mạn tính và tiên lượng khả năng đáp ứng với điều trị đều chưa đề cập đến việc phát hiện những người mang HBV có sẳn đặc tính kháng thuốc để có chỉ định phác đồ điều trị thích hợp và đạt hiệu quả cao. Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV vào khoảng 10 -20% [112], được xếp vào các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao. Các nghiên cứu liên quan đến sự phân bố kiểu gen cũng như sự kháng thuốc của HBV ở các đối tượng bệnh nhân khác nhau như bệnh nhân đang điều trị, sau khi điều trị, bệnh nhân đã có biến chứng của nhiễm HBV đã được nhiều tác giả thực hiện. Tuy nhiên, các nghiên cứu nêu trên ở đối tượng bệnh nhân chưa điều trị còn ít. Đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến nhiễm HBV ở các nơi trong nước, tuy nhiên vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long với dân số hơn 17 triệu người và với tỷ lệ nhiễm HBV chung của Việt Nam thì khu vực này có số người nhiễm HBVđáng kể. Mặc dù vậy, chưa có một nghiên cứu nào được thực hiện một cách đầy đủ về sự phân bố kiểu gen, dưới kiểu gen cũng như sự kháng thuốc của HBV trên người nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị nói riêng và bệnh nhân viêm gan B nói chung ở khu vực vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Đặc điểm kiểu gen và đột biến kháng thuốc của HBV ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị ” với 2 mục tiêu sau: 1. Mô tả sự phân bố kiểu gen, dưới kiểu gen của HBV và một số đặc điểm sinh học ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị tại TP. Cần Thơ từ tháng 1/2013 đến tháng 6/2014. 2. Xác định tỷ lệ đột biến kháng thuốc của HBV ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị.
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh viêm gan B mạn tính vấn đề sức khỏe toàn cầu tỷ lệ người nhiễm cao gây biến chứng nguy hiểm Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Thế giới có khoảng tỉ người nhiễm virus viêm gan B (HBV) với 400 triệu người nhiễm mạn tính triệu người tử vong hàng năm biến chứng bệnh [39], [80], [114] Diễn tiến đến xơ gan, suy gan bù ung thư tế bào gan biến chứng nguy hiểm bệnh nhân không điều trị Với hỗ trợ đắc lực kỹ thuật sinh học phân tử, nhà khoa học Thế giới xác định 10 kiểu gen (genotype) kiểu gen (subgentype) HBV [81], [112] Các nghiên cứu gần Thế giới cho thấy có mối liên hệ kiểu gen HBV với đường lây nhiễm, diễn tiến bệnh, đáp ứng với điều trị khả xuất loại đột biến [81], [112] Mục đích điều trị viêm gan B mạn tính nhằm ngăn ngừa biến chứng giảm nguy tử vong cho bệnh nhân Hiện nay, có nhóm thuốc công nhận điều trị viêm gan B mạn tính interferon (interferon-α 2a, interferon- α 2b) đồng phân nucleotides gồm loại thuốc: Lamivudine, Adefovir, Entecavir, Telbivudine Tenofovir [62] Các đồng phân nucleotide có tác dụng ức chế tăng sinh virus thời gian dài với mức độ khác tùy loại thuốc, tác dụng phụ, làm chậm diễn tiến bệnh, cải thiện tỷ lệ sống giảm nguy biến chứng cho bệnh nhân Tuy nhiên, sử dụng thuốc kháng virus kéo dài xảy tình trạng kháng thuốc Hậu lâm sàng kháng thuốc gia tăng nồng độ virus máu, đảo ngược mức độ cải thiện mô học, giảm tỷ lệ chuyển đổi huyết HBeAg [108] Về mặt chế, kháng thuốc điều trị viêm gan B đặc tính chép nhanh virus, gen virus thiếu chế kiểm soát tính đột biến trình chép Dưới áp lực chọn lọc thuốc, dòng virus có đột biến kháng thuốc xuất lan rộng quần thể virus tạo nên biểu kháng thuốc [62] Đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến đột biến kháng thuốc HBV sau thời gian điều trị Tỷ lệ kháng thuốc loại thuốc nói chung gia tăng theo thời gian điều trị [62] Với chế lây truyền HBV cộng đồng sau thời gian đồng phân nucleotides đưa vào điều trị cộng đồng có khả xuất người bị lây nhiễm chủng virus có sẳn đặc tính kháng thuốc Những người có định điều trị thuốc kháng virus khả thất bại điều trị kháng thuốc hoàn toàn xảy Hiện hướng dẫn điều trị viêm gan B mạn tính tiên lượng khả đáp ứng với điều trị chưa đề cập đến việc phát người mang HBV có sẳn đặc tính kháng thuốc để có định phác đồ điều trị thích hợp đạt hiệu cao Tại Việt Nam, tỷ lệ nhiễm HBV vào khoảng 10 -20% [112], xếp vào quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao Các nghiên cứu liên quan đến phân bố kiểu gen kháng thuốc HBV đối tượng bệnh nhân khác bệnh nhân điều trị, sau điều trị, bệnh nhân có biến chứng nhiễm HBV nhiều tác giả thực Tuy nhiên, nghiên cứu nêu đối tượng bệnh nhân chưa điều trị Đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến nhiễm HBV nơi nước, nhiên vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long với dân số 17 triệu người với tỷ lệ nhiễm HBV chung Việt Nam khu vực có số người nhiễm HBV đáng kể Mặc dù vậy, chưa có nghiên cứu thực cách đầy đủ phân bố kiểu gen, kiểu gen kháng thuốc HBV người nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị nói riêng bệnh nhân viêm gan B nói chung khu vực vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long Vì vậy, thực đề tài “Đặc điểm kiểu gen đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị ” với mục tiêu sau: Mô tả phân bố kiểu gen, kiểu gen HBV số đặc điểm sinh học bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị TP Cần Thơ từ tháng 1/2013 đến tháng 6/2014 Xác định tỷ lệ đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VIRUS VIÊM GAN B (HBV) 1.1.1 Cấu trúc virus HBV thuộc họ Hepadnaviridae, có cấu trúc DNA Hạt virus hoàn chỉnh có dạng hình cầu, đường kính 42 nm Vỏ protein bên tạo thành protein HBs Phần lõi bên nucleocapside có đường kính 34 nm, chứa protein HBc DNA Trong huyết người nhiễm HBV, virus tồn dạng: Hình 1.1 Cấu trúc HBV “ Nguồn : Don Ganem, 2009 ” [47] - Hạt Dane: virion hoàn chỉnh hình cầu, đường kính 42 nm, bên có vỏ bọc cấu tạo từ kháng nguyên bề mặt (HBsAg) với loại protein S, M, L, bên capside, đường kính 34 nm, cấu tạo từ kháng nguyên lõi (HBcAg) Bên capside có chứa nhân DNA enzyme DNA polymerase, protein kinase - Các hạt HBs: có dạng hình cầu hình ống, có kích thước thay đổi Đây protein HBs tạo cách dư thừa bào tương tế bào gan sau phóng thích vào máu, không chứa DNA virus không gây nhiễm [45], [51], [109] 1.1.2 Cấu trúc gen virus HBV có gen phân tử DNA dạng vòng, chiều dài khoảng 200 bases, gồm chuỗi có chiều dài khác Chuỗi dài (ký hiệu L) nằm ngoài, có cực âm, tạo nên vòng tròn liên tục có chiều dài cố định 200 bases gần khép kín, mã hóa cho thông tin di truyền virus Chuỗi ngắn (ký hiệu S), nằm trong, có cực dương, chiều dài thay đổi 50-80% chiều dài sợi âm DNA HBV không xoắn vòng DNA virus khác mà xoắn đoạn cuối cuộn lại thành hình tròn Sợi ngắn DNA có chiều dài khác hoạt động DNA polymererase bị gián đoạn phần capside bao bọc hình thành Bộ gen HBV có cấu tạo nhỏ gọn so với chiều dài gen mà chứa đựng có xếp vùng giao (chồng lấp) gen sợi DNA âm Trên sợi DNA âm, có đoạn gen tương tứng với khung đọc mở (opening reading frame) vùng mã hóa cho tổng hợp protein virus gồm protein bề mặt (HBsAg), protein lõi (HBeAg, HBcAg), polymerase protein X [46], [51], [109] Các gen gồm: - Gen S: bao gồm vùng S, Pre-S1, Pre-S2 mã hóa cho tổng hợp kháng nguyên bề mặt HBsAg Đoạn gen S tổng hợp nên Protein S (Small) gồm 226 acid amin Ở vùng S có định kháng nguyên HBsAg Đoạn gen S pre-S2 tổng hợp nên protein M (Medium) có chiều dài 108 acid amin Vùng Pre-S2 giúp cho virus bám dính xâm nhập vào tế bào gan nhờ liên kết với loại albumin trùng hợp huyết người Đoạn S, Pre-S1, Pre-S2 tổng hợp nên Protein L (Large) Vùng Pre-S1 có chiều dài thay đổi tùy theo phân type khác Đây vùng chủ yếu mà virus gắn lên thụ thể bề mặt tế bào gan, giúp virus xâm nhập vào bên tế bào [22], [61], [74], [76] Các đột biến gen S có liên quan đến diễn tiến nhiễm HBV Đột biến vùng pre-S làm biến đổi cách có ý nghĩa diễn tiến nhiễm HBV, thường gặp bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính, bệnh nhân viêm gan tối cấp sau ghép gan [32], [48], [67] Đột biến vùng S đưa đến tượng đào thoát vaccine (vaccine escape) [31], [47], [74], [105] - Gen C: gồm vùng C (Core) pre-C (Pre-core), mã hóa cho tổng hợp protein nucleocapsid Các nucleotide vùng Pre-core mã hóa cho việc tạo nên đoạn peptide tín hiệu Đoạn peptide tín hiệu có vai trò giúp cho kháng nguyên HBeAg tiết qua hệ thống lưới nội bào tế bào gan, hòa tan vào huyết Sự diện HBeAg phản ánh tình trạng nhân lên virus bên tế bào gan có liên quan đến tính lây nhiễm Nếu trình đọc mã hết đoạn gen C tổng hợp nên kháng nguyên HBcAg Kháng nguyên HBcAg tổng hợp đoạn peptide tín hiệu nên không tiết tế bào gan không tìm thấy huyết [31], [100] Các đột biến vùng Core Pre-core làm cho virus lẫn tránh nhận biết hệ miễn dịch có liên quan đến diễn tiến nặng bệnh gan Các đột biến vùng Pre- core làm cho virus tổng hợp protein HBeAg virus tăng sinh mạnh [42], [84] - Gen X: mã hóa cho tổng hợp protein HBx Chức đầy đủ protein HBx chưa biết rõ Protein HBx có vai trò chuyển hoạt hóa trình chép virus Do đó, protein HBx có vai trò quan trọng chế sinh ung thư tế bào gan bị nhiễm [45] Hình 1.2 Cấu trúc gen HBV “ Nguồn : William M Lee, 2014 ” [119] - Gen P (Polymerase): gen lớn chiếm 80% chiều dài gen mã hóa cho DNA-polymerase, chia làm vùng với chức riêng: Terminal protein, Spacer, reverse transcriptase (RT) RNAse H domains Ở đầu N tận polymerase có acid amin Tyrosin tương đối định Acid amin có vai trò làm mồi để khởi phát trình tổng hợp DNA virus Tiếp theo acid amin mồi vùng Spacer có trình tự acid amin thay đổi, có vai trò ổn định chức enzyme polymerase có đột biến xảy Tiếp theo vùng Spacer vùng RT, vùng hoạt tính men chép ngược Vùng bao gồm trình tự acid amin tương đối định (Tyrosin-Methionin-Asparagin-Asparagin) Trình tự vị trí xúc tác men chép ngược Vùng RT chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp DNA polymerase phụ thuộc RNA DNA polymerase phụ thuộc DNA Vùng RT chia làm vùng nhỏ gọi tên A-G, đích tác động thuốc nhóm đồng phân nucleotide nơi xuất đột biến kháng thuốc Cuối cùng, đầu C tận vùng RNase H có chức làm thoái biến khuôn lúc tổng hợp sợi DNA âm Như sản phẩm gen P có liên quan đến chế chép ngược virus đồng thời tham gia phần vào việc tạo capside bao bọc bên cấu trúc tiền genom [45], [51], [70], [109] Các đột biến vùng RT có liên quan đến kháng thuốc HBV [70], [123] 1.1.3 Chu kỳ nhân lên virus Chu kỳ nhân lên HBV có giai đoạn chép ngược từ RNA để tạo nên DNA nhờ men chép ngược HBV DNA có tỷ lệ đột biến cao men hay bị sai sót chép Khi virus nhân lên, DNA không chép trực tiếp thành DNA virus mà qua bước trung gian tạo sợi mRNA nhờ RNA tế bào ký chủ Hai sợi mRNA gọi tiền genome, chứa toàn thông tin di truyền virus Từ sợi mRNA tổng hợp thành phần virion DNA virion chép từ mRNA thành DNA virus Như vậy, DNA polymerase hoạt động men chép ngược Khi sợi DNA dài (L) hình thành sợi mRNA tự phá hủy Quá trình nhân đôi sợi DNA trình tự DR2 sợi dài tiếp tực nhờ khép vòng sợi DNA [47], [59] Hình 1.3 Chu kỳ nhân lên HBV “ Nguồn : Don Ganem, 2009 ” [47] Quá trình nhân lên HBV gồm nhiều giai đoạn: - Giai đoạn tạo DNA vòng xoắn cuộn: sau xâm nhập vào tế bào gan, nhờ chế nhập nội bào, virus phóng thích phần vỏ bọc, phần lõi có chứa phân tử DNA để vào nhân tế bào gan Ban đầu, cấu trúc DNA vòng có chuỗi cực dương ngắn chuỗi cực âm Enzyme DNA polymerase bổ sung chiều dài chuỗi để tạo DNA vòng khép kín với chuỗi có chiều dài xoắn cuộn lại nhờ liên kết đồng hóa trị DNA gọi cccDNA (covalently closed circular DNA) Sự diện cccDNA tế bào gan bị nhiễm giữ vai trò quan trọng việc trì tình trạng nhiễm HBV mạn tính - Giai đoạn tổng hợp sợi RNA tiền genom: sợi RNA tiền genom 10 tổng hợp từ sợi âm cccDNA nhờ xúc tác men RNA polymerase II tế bào Sợi RNA tiền genom dài genom virus bị dư đầu đoạn thừa R (redundant) từ 150-200 nucleotide bao gồm trình tự DR1 Sợi RNA tiền genom chứa toàn thông tin di truyền virus làm khuôn mẫu để tổng hợp nên sợi DNA cực âm gen virus sau Ở đầu 5’ sợi RNA tiền genom có tín hiệu khởi phát việc tạo vỏ trúc RNA tiền genom enzyme polymerase protein phần capside Các protein capside men polymerse tổng hợp từ sợi RNA thông tin thứ hai có chiều dài 3,2 Kb Ngoài ra, giai đoạn diễn tổng hợp sợi RNA bán phần genom (subgenomic) mang phần thông tin di truyền virus, có nhiệm vụ tổng hợp nên protein HBsAg protein X virus - Giai đoạn tổng hợp sợi DNA chuỗi dài cực âm: giai đoạn tổng hợp sợi DNA từ khuôn mẫu RNA nên gọi trình chép ngược, diễn bào tương tế bào gan Trong lúc sợi RNA tiền genom bao bọc bên phần capsid, trình chép ngược khởi phát nhờ việc sử dụng chất mồi nhóm hydroxyl Tyrosine men chép ngược DNA polymerase virus Men chép ngược đến tương tác với tín hiệu đặc hiệu đầu 5’ sợi RNA tiền genom nhập thêm nucleotide GTAA Tiếp theo đó, phức hợp men polymerase trình tự di chuyển đến vùng DR1 đầu 3’ sợi RNA tiền genom tiếp tục nối dài thêm để tổng hợp nên sợi DNA cực âm Trong lúc tổng hợp sợi DNA cực âm, sợi RNA tiền genom thoái biến dần nhờ RNAse H enzyme DNA polymerase - Giai đoạn tổng hợp sợi DNA chuỗi ngắn cực dương: tổng hợp chuỗi ngắn bắt đầu trình tự DR2 chuỗi dài nhờ sử dụng mồi 91 cách có ý nghĩa thống kê (p = 0,013) Ở nhóm không tăng men gan khác biệt 4.2.3.Sự phân bố kiểu gen HBV Ngoài 10 kiểu gen phát dựa khác biệt 8% trình tự nucleotide gen 4% trình tự nucleotide gen S HBV, người ta chia kiểu gen thành kiểu gen (subgenotype) khác khác biệt 4-8% trình tự nucleotide gen HBV [81], [112] Có kiểu gen HBV thường gặp A, B, C D Trong đó, kiểu gen A gồm kiểu gen A1 A2 Kiểu gen D có kiểu gen (D1-D7), [39], [99] Riêng kiểu gen B C kiểu gen cho thường gặp châu Á Việt Nam chia nhiểu kiểu gen khác Theo tác giả Beom Kyung Kim, số kiểu gen B B1 thường gặp Nhật, B2 gặp Trung Quốc Thái Lan, B3 Indonesia, B4 Việt Nam B5 Philippines Riêng B6 phát sau gặp số dân tộc Alaska, Canada Greenland [39] Kiểu gen C gồm có C1- C5 C2 với C1 thường gặp Việt Nam, Thái Lan Myanmar, C2 thường gặp Nhật Bản, Hàn Quốc Trung Quốc, C3 New Caledonia Polynesia, C4 Úc C5 Philippines [39] Theo Takako Utsumi, kiểu gen gặp Việt Nam gồm B2, B4, C1 C5 [112] Trong nghiên cứu này, ghi nhận kiểu gen gồm B1 (19%), B2 (3,6%), B3 (10,3%), B4 (39,8%), C1 (0,4%) C2 (26,9%) Như kết nghiên cứu kiểu gen HBV phân bố thành phố Cần Thơ tỉnh thành vùng vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long phù hợp với số liệu tác giả khác nói phân bố kiểu gen HBV Việt Nam Bảng 4.4: Các kiểu gen HBV Việt Nam qua nghiên cứu 92 Dưới kiểu gen Tác giả Phùng Thị Bích Thủy [99] B2, B4, C1 Weifeng Shi [104] B4 Beom Kyung Kim [39] B4, C1 Takako Utsumi [112] B2, B4, C1, C5 NC B1, B2, B3, B4, C1, C2 So sánh với nghiên cứu tác giả khác nước, nhận thấy số điểm khác biệt Trong nghiên cứu chúng tôi, ghi nhận diện kiểu gen B (từ B1 đến B4) kiểu gen C (C1 C2) Trong kiểu gen B4 chiếm tỷ lệ cao (39,8%), C2 (26,9%) Tác giả Phùng Thị Bích Thủy nghiên cứu 87 bệnh nhân viêm gan B mạn tính Hà Nội ghi nhận kiểu gen B4 B2, kiểu gen B4 chủ yếu, kiểu gen C có kiểu gen C1 Các kiểu gen B1, B3 C2 không ghi nhận nghiên cứu tác giả Sự khác biệt cỡ mẫu chưa đủ lớn để phát kiểu gen khác Các kiểu gen HBV có liên quan đến diễn tiến bệnh đáp ứng với điều trị Một số nghiên cứu giới cho thấy kiểu gen B1 có chuyển đổi huyết HBeAg sớm B2, B6 gây tổn thương gan [81], [99] Một nghiên cứu Hong Kong cho thấy kiểu gen C1 có liên quan đến nguy cao bị ung thư tế bào gan nhiều C2 [39] Tuy nhiên trình nghiên cứu, chưa tìm tài liệu từ nghiên cứu nước liên quan đến phân bố kiểu gen đối tượng bệnh nhân khác xơ gan, ung thư gan để so sánh với số liệu bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính 93 Theo tác giả Yueming Chen nghiên cứu nhóm bệnh nhân Trung Quốc gồm nhiễm HBV mạn tính, xơ gan ung thư gan cho thấy kiểu gen xác định gồm B2, C1 C2 Trong đó, kiểu gen B2 chiếm tỷ lệ cao nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính kiểu gen C2 chiếm tỷ lệ tương đương nhóm bệnh nhân xơ gan, ung thư gan cao nhóm bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính Không có khác biệt tần suất kiểu gen C1 nhóm bệnh nhân nêu [124] Khi phân tích mối liên hệ phân bố kiểu gen HBV với yếu tố tuổi, giới, tình trạng mang kháng nguyên HBeAg, tình trạng tăng men gan tải lượng HBV DNA máu, không ghi nhận mối liên quan có ý nghĩa (p > 0,05) 4.3.ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC 4.3.1.Đột biến kháng thuốc Bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen gen P có chiều dài 388416 bps, không phát đột biến kháng thuốc, đặc biệt đột biến kháng Lamivudine, Adefovir Entecavir Trong trình tự nhân lên virus, nhiều đột biến gen phát sinh Tùy vào vị trí đột biến gen mà đưa đến biểu khác virus Các đột biến gen P HBV đặc biệt có ảnh hưởng đến mức độ nhạy cảm thuốc kháng virus đường uống vị trí tác động thuốc thuộc nhóm HBV virus có khả tự nhân đôi mạnh với tốc độ 1012 - 1013 hạt virus / ngày [59], [123] Bên cạnh đó, đột biến xảy liên tục suốt chu kỳ nhân lên virus virus thiếu khả sửa sai trình nhân lên Hậu đột biến xuất với tần suất cao, khoảng 1,4 – 3,2 x 10-5 đột biến /chu kỳ/ vị trí nucleotide [111], [123] Những đột biến rải rác tạo nên thay đổi 94 gen HBV, chọn lọc ưu đáp ứng miễn dịch vật chủ yếu tố khác thuốc kháng virus Những đột biến xảy vùng tác động thuốc (gen P) làm thay đổi cấu trúc vùng hoạt tính phiên mã ngược (vùng rt) enzyme polymerase dẫn đến giảm khả gắn kết thuốc vào vùng đặc hiệu Về mặt cấu trúc gen P chia vùng : Terminal Protein, Spacer, Reverse transcriptase (RT) RNaseH Vùng tác động thuốc, vùng RT lại chia thành vùng nhỏ A, B, C, D, E, F G Trong đó, vùng A, B, C D nơi xuất đột biến liên quan đến kháng thuốc [47], [110], [123] Các vị trí đột biến có liên quan đến thuốc đồng phân nucleotide công bố thể hình 4.1 Hình 4.1 Các vị trí đột biến kháng thuốc gen RT HBV ( Nguồn : Yogesh Chawla, 2011 [123] ) Nghiên cứu đột biến kháng thuốc bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính 95 hay bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị thuốc kháng virus thực giới chưa nhiều Các nghiên cứu nhằm tìm hiểu khả mang gen kháng thuốc HBV bệnh nhân chưa điều trị thuốc kháng virus từ có liệu để hiểu biết sâu khả kháng thuốc HBV để có biện pháp chẩn đoán, theo dõi có phác đồ điều trị thích hợp Một số nghiên cứu bệnh nhân chưa điều trị cho thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc thấp (< 10 %) [53], [73], [98] [107] Một số nghiên cứu không phát đột biến liên quan đến kháng thuốc [75], [115] Tuy nhiên nghiên cứu đầy đủ với cỡ mẫu đủ lớn Tại Mỹ, tác giả Severine Margeridon nghiên cứu 17 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị không phát đột biến kháng thuốc [82] Tác giả Nguyen Long H nghiên cứu đối tượng bệnh nhân người châu Á (chủ yếu người Việt Nam Trung Quốc) sống Mỹ ghi nhận tỷ lệ đột biến kháng thuốc 1% [93] Theo Elizabeth C Reuman, tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine 45 bệnh nhân nhiễm HBV chưa điều trị 2,9% [53] Tác giả Philip Vutien nghiên đối tượng người Việt Nam Trung Quốc sống Mỹ ghi nhận tỷ lệ đội biến kháng thuốc 1% [98] Tại Trung Quốc, Tác giả Jie Ma nghiên cứu 75 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị (29 bệnh nhân ) thất bại điều trị (46 bệnh nhân ) nhận thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc nhóm bệnh nhân chưa điều trị % [73] Tại Ấn Độ, tác giả Ismail A M.nghiên cứu 97 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị ghi nhận bệnh nhân mang virus có đột biến kháng Adefovir bệnh nhân mang virus có đột biến ,kháng Lamivudine [72] 96 Tác giả Bhupesh Singla nghiên cứu 71 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị cho kết đột biến kháng thuốc bệnh nhân 8,8% [106] Tại Ý, nghiên cứu 286 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị, tác giả Mirandola S ghi nhận đột biến kháng thuốc 13 bệnh nhân (5%) gồm đột biến kháng Lamivudine, Adefovir Entecavir [87] Tại Việt Nam, nghiên cứu đột biến kháng thuốc trình điều trị thực nhiều cung cấp chứng xác thực diễn tiến kháng thuốc sau khoảng thời gian điều trị khác (1 năm, năm, năm, năm, …) Tuy nhiên, nghiên cứu đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV viêm gan B mạn tính chưa điều trị chưa nhiều chưa có nghiên cứu tiến hành cách đầy đủ với cỡ mẫu đủ lớn Một số tác giả nước nghiên cứu bệnh nhân chưa điều trị bệnh nhân điều trị lẫn chưa điều trị phát đột biến kháng thuốc với tỷ lệ thấp Tác giả Nguyễn Hùng Cường nghiên cứu 67 đối tượng nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị phát đột biến kháng thuốc Lamivudine 3,84% , kháng Adefovir Entecavir 0% [8] Tác giả Đặng Mai Anh Tuấn tiến hành nghiên cứu đột biến kháng thuốc HBV từ 894 mẫu máu bệnh nhân bệnh viện TP Hồ Chí Minh gồm bệnh nhân điều trị chưa điều trị ghi nhận tỷ lệ đột biến kháng thuốc chung 9,28%, kháng Lamivudine chiếm 4,7% Tuy nhiên tác giả không ghi nhận tần suất đột biến kháng thuốc nhóm bệnh nhân chưa điều trị [27] Tóm lại, kết nghiên cứu thực đối tượng bệnh nhân chưa điều trị, với cỡ mẫu tương đối lớn (505 bệnh nhân) có 97 thể xem phù hợp với kết nghiên cứu tác giả nước, cho thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân chưa điều trị thuốc kháng virus thấp Kết quan trọng để bác sĩ lâm sàng tham khảo việc chọn lựa phác đồ điều trị cho bệnh nhân bắt đầu điều trị thuốc kháng virus đường uống Khi so sánh tỷ lệ đột biến kháng thuốc HBV thời điểm gồm trước điều trị, sau điều trị năm, năm, năm kết nghiên cứu xem thời điểm trước điều trị, nhận thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc tăng dần theo thời gian điều trị mức độ gia tăng đột biến kháng thuốc phụ thuộc vào nhiều yếu tố, yếu tố đặc điểm rào cản kháng thuốc thuốc dùng điều trị đóng vai trò quan trọng Bảng 4.5: So sánh tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine HBV thời điểm khác Thời gian điều trị Lamivudine năm năm năm > năm (%) (%) (%) (%) Bùi Hữu Hoàng [11] 16,0 45,0 83,0 83,0 Hồ Tấn Đạt [10] 27,8 63,4 71,1 83,3 Tác giả Bảng 4.5 cho thấy so sánh tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine thời điểm điều trị khác với tỷ lệ kháng thuốc chưa điều trị (trong nghiên cứu chúng tôi), tần suất kháng thuốc tăng nhanh theo thời gian Lamivudine thuốc kháng virus có hàng rào kháng thuốc thấp thuốc có tác dụng ức chế virus tốt, dung nạp tốt tác dụng phụ [97], [109] 98 4.3.2 Kỹ thuật giải trình tự xác định kiểu gen, kiểu gen phát đột biến kháng thuốc HBV Có nhiều kỹ thuật sử dụng để phát đột biến kháng thuốc HBV, kỹ thuật có ưu nhược điểm riêng sử dụng điều kiện khác Các kỹ thuật sử dụng phổ biến Real-time PCR, PCR kết hợp lai phân tử (INNO-LiPA), PCR kết hợp sử dụng enzyme cắt giới hạn (RFLP), giải trình tự,….[26], [27], [28], 87], [98] Trong số kỹ thuật này, giải trình tự xem kỹ thuật tối ưu cho việc nghiên cứu đột biến gen virus bao gồm đột biến có liên quan đến tính kháng thuốc virus [53], [72], [86], [107], [116] Kỹ thuật giải trình tự giúp phát thay đổi trình tự nucleotide vùng gen nghiên cứu, thay đổi có ý nghĩa không Dựa thông tin có từ trình tự nucleotide, nhà nghiên cứu biết đặc điểm kiểu gen, nhóm kiểu gen tất đột biến xuất đoạn gen giải trình tự bao gồm đột biến biết đột biến chưa biết đến Máy giải trình tự tự động hoạt động dựa theo nguyên lý phương pháp Sanger có cải biến Trong ddNTP không đánh dấu đồng vị phóng xạ mà đánh dấu chất huỳnh quang khác cho loại ddNTP [29], [96] Máy giải trình tự bao gồm thành phần như: hệ mao quản, phận chiếu sáng laser, phận nhận xử lý tín hiệu Các vạch điện di mao quản phát sáng qua chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu ghi lại mã hóa thành nucleotide A, T, C, G Trong nghiên cứu này, chọn kỹ thuật giải trình tự để phát đột biến kháng thuốc ưu điểm nêu kỹ thuật Chỉ kỹ thuật giải trình tự có thông tin đột biến kháng 99 thuốc, kiểu gen, kiểu gen virus từ phân tích thông tin cách độc lập mối liên hệ lẫn Tuy nhiên, hạn chế kỹ thuật giải trình tự kỹ thuật không phát đột biến chiếm tỷ lệ nhỏ (< 20%) quần thể hỗn hợp chứa dạng virus hoang dại virus có mang đột biến [54], [98] Liên quan đến kết giải trình tự phát đột biến kháng thuốc gen P HBV vị trí chiều dài đoạn gen giải trình tự Trên sơ đồ cấu trúc gen P HBV, vi trí đột biến liên quan đến kháng thuốc tập trung vùng A, B, C, D E, (hình 4.1) Các đột biến kháng thuốc HBV công bố nằm vị trí codon 80, 169, 173, 180, 181, 184, 202, 204, 236 250, đột biến thường gặp thuộc vị trí codon 180, 181 204 [51], [59], [62] Đoạn gen tiến hành giải trình tự có chiều dài từ 388 bps đến 416 bps , chứa vị trí codon từ 124 đến vị trí codon 263 gen RT Đoạn gen chứa phần vùng A vùng B, C, D E gen RT (Hình 4.1), nơi có khả xuất hầu hết đột biến kháng thuốc HBV Trong đó, hầu hết đột biến kháng Lamivudine phát đoạn gen giải trình tự này, đặc biệt kiểu đột biến rt M204I/V/S, kiểu đột biến kháng Lamivudine thường gặp Chỉ có kiểu đột biến kháng Lamivudine nằm đoạn gen giải trình tự, đột biến rt L80V/I, nằm phần đầu vùng A gen RT mà phát Đây xem hạn chế nghiên cứu khảo sát đột biến kháng thuốc HBV 4.3.2 Đột biến rtV207M phát Trong nghiên cứu này, không phát đột biến số đột biến công bố liên quan đến kháng thuốc 100 HBV Tuy nhiên, giải trình tự lưu ý đến đột biến rtV207M Đây vị trí đột biến chưa thức ghi nhận có liên quan đến tính kháng thuốc HBV phát đột biến với tần suất đáng kể (10,7%) số nghiên cứu tác giả khác đề cập đến diện đột biến [9], [10], [93], [102] nên ghi nhận phân tích mối liên hệ đột biến với số yếu tố khác Ngoài ra, vị trí đột biến nằm vùng domain B gen P gần với vị trí 204 vị trí đột biến thường gặp liên quan đến kháng Lamivudine (đột biến rtM204I/V) Có thể có khả đột biến rtV207M có mang ý nghĩa liên quan đến tính kháng thuốc khả làm xuất đột biến kháng thuốc virus tiếp xúc với thuốc trình điều trị Đây câu hỏi đặt từ kết nghiên cứu cần có thêm nghiên cứu khác sâu để giải đáp câu hỏi Tương tự nghiên cứu chúng tôi, số đột biến chưa công nhận có ý nghĩa kháng thuốc số tác giả phát ghi nhận Tác giả Nguyen Long H ghi nhận diện số đột biến ý nghĩa kháng thuốc sau: đột biến rtV207M/L/I (16,7%), rtA181T/S, rtA194S, rtM250I [93] Tác giả Salpini R ghi nhận số đột biến gồm có rtQ215S (12,8%), rtI233V (4,3%), rtV214A (3,6%), rtV191I (0,7%) rtV207L (0,7%) [102] 4.3.3 Mối liên quan đột biến rtV207M tình trạng tăng men gan, kháng nguyên HBeAg tải lượng HBV DNA máu Khi phân tích mối liên quan xuất đột biến rtV207M tình trạng tăng men gan, tình trạng mang kháng nguyên HBeAg tải lượng 101 HBV DNA máu, không ghi nhận khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Trong nghiên cứu số tác giả khác có ghi nhận diện đột biến rtV207M/L/I không đề cập đến mối liên quan nên sở để so sánh [93], [102] 4.3.4 Mối liên quan đột biến rtV207M kiểu gen HBV Khi phân tích mối liên hệ tỷ lệ đột biến rtV207M kiểu gen HBV, nhận thấy tỷ lệ đột biến phát kiểu gen B cao kiểu gen C cách có ý nghĩa thống kê với p < 0,001 Đây ghi nhận bước đầu diện đột biến rtV207M Kết phù hợp với kết nghiên cứu Nguyên Long H 472 bệnh nhân viêm gan B chưa điều trị ghi nhận có 59/60 đột biến rtV207M thuộc kiểu gen B [93] Như có mối liên hệ rõ đột biến rtV207M với kiểu gen B đối tượng bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị (p 105 copies/ml, tỷ lệ kiểu gen C bệnh nhân có HBeAg(-) 48,6%, cao bệnh nhân có HBeAg(+) (22%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê - Ở bệnh nhân có men gan tăng, tỷ lệ kiểu gen C bệnh nhân có HBeAg (-) 35%, cao bệnh nhân có HBeAg (+) (22,3%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê 103 - Ở bệnh nhân nam ≥ 40 tuổi , kiểu gen C chiếm 32,7%, cao bệnh nhân nam < 40 tuổi (22%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê - kiểu gen xác định B1, B2, B3, B4, C1, C2 với tỷ lệ sau : B4 (39,8%), C2 (26,9%), B1 (19%), B3 (10,3%), B2 (3,6%), C1 (0,4%) 2.Đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân chưa điều trị - Không phát đột biến công bố có liên quan đến kháng thuốc nhóm đồng phân nucleotide - Phát đột biến rtV207M vùng B gen P với tỷ lệ 10,7% - Tỷ lệ đột biến rtV207M kiểu gen B 13,9%, nhiều so với kiểu gen C (2,2%) cách có ý nghĩa thống kê 104 KIẾN NGHỊ Trong khuôn khổ nghiên cứu giới hạn chúng tôi, từ kết thu được, có kiến nghị sau: Chúng không tìm thấy đột biến kháng thuốc, đặc biết đột biến kháng Lamivudine, Adefovir Entecavir HBV bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị Do đó, xét nghiệm tìm đột biến kháng thuốc trước bắt đầu điều trị không cần thiết thực rộng rãi mà nên thực bệnh nhân có biểu kháng thuốc thất bại điều trị với kế hoạch trị liệu ban đầu nhằm giúp bác sĩ điều trị chọn lựa thuốc thay phù hợp Lamivudine thuốc có rào cản kháng thuốc thấp lại an toàn, dung nạp tốt, có tác dụng ức chế virus mạnh giá thành chấp nhận cho đa số bệnh nhân nghèo Hiện tượng kháng thuốc xảy trình điều trị áp lực chọn lọc thuốc Do đó, Lamivudine nên sử dụng điều trị HBV cho bệnh nhân bắt đầu điều trị cách thích hợp Có thêm nghiên cứu liên quan đến vai trò đột biến rtV207M 105 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ĐÃ CÔNG BỐ Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2015) “Sự phân bố kiểu gen HBV người nhiễm HBV mạn tính TP Cần Thơ” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Tập 19, Phụ số 1, chuyên đề Nội khoa, tr 374 - 377 Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2015) “Phát đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị kỹ thuật giải trình tự chuỗi” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh Tập 19, Phụ số 1, chuyên đề Nội khoa, tr 365 - 368 [...]... nghiên cứu trên 75 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị (29 bệnh nhân ) và thất bại điều trị (46 bệnh nhân ) nhận thấy tỷ lệ đột biến kháng thuốc trên nhóm bệnh nhân chưa điều trị dưới 2 %[73] Tại Ấn Độ, tác giả Ismail A M.nghiên cứu trên 97 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị ghi nhận 4 bệnh nhân mang virus có đột biến kháng Adefovir và 3 bệnh nhân mang virus có đột biến kháng Lamivudine... trên 71 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị cho kết quả đột biến kháng thuốc trên những bệnh nhân này là 8,8% [106] 31 Tại Ý, nghiên cứu trên 286 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị, tác giả Mirandola S ghi nhận được đột biến kháng thuốc ở 13 bệnh nhân (5%) gồm các đột biến kháng Lamivudine, Adefovir và Entecavir [87] Bên cạnh các đột biến có ý nghĩa kháng thuốc, một số đột biến chưa. .. của đột biến rtV207M bên cạnh các đột biến có ý nghĩa kháng thuốc [11] Ngoài các đột biến kháng Lamivudine thường gặp như rtM204V/I và rtL180M, tác giả Hồ tấn Đạt còn ghi nhận sự xuất hiện của đột biến phối hợp rt M204I + rtL180M + rtV207I với tỷ lệ 0,8%[10] - Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân chưa điều trị Nghiên cứu về đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân nhiễm HBV và viêm gan B mạn. .. phổ biến ở khu vực hạ Sahara (châu Phi), Đông Âu và Tây Phi trong khi kiểu gen B và C gặp chủ yếu ở châu Á [127] Kiểu gen D gặp phổ biến ở khu vực Địa Trung Hải, Trung Đông và Ấn Độ Kiểu gen E hay gặp ở Tây Phi Kiểu gen F và H thường chỉ gặp ở Trung và Nam Mỹ Kiểu gen G được tìm thấy ở Pháp và Đức Kiểu gen A, D và F chiếm ưu thế ở Brazil Gần đây, kiểu gen I đã được tìm thấy ở Việt Nam và Lào Kiểu gen. .. - Đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân đang điều trị Các nghiên cứu về đột biến kháng thuốc trên bệnh nhân viêm gan B đang điều trị được thực hiện khá nhiều nhằm khảo sát các kiểu đột biến kháng thuốc và làm cơ sở cho việc lựa chọn phác đồ điều trị thay thế phù hợp Ngoài ra, những dữ liệu từ các nghiên cứu này còn là nguồn tham khảo quan trọng cho những nghiên cứu đột biến kháng thuốc trên bệnh. .. độ và kiểu kháng thuốc khác nhau của các chủng HBV kháng thuốc [59], [68], [120], [128] - Đột biến kháng Lamivudine Nhiều nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ xuất hiện đột biến kháng Lamivudine của HBV tăng dần theo thời gian điều trị Ở bệnh nhân có HBeAg (+), tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine sau 1 năm điều trị 20%, sau 5 năm là 80% [32], [45], [49], [109] Các đột biến kháng Lamivudine xảy ra trên vùng C và. .. Đạt cũng ghi nhận trên bệnh nhân đang điều trị bằng Lamivudine, tỷ lệ nhiễm kiểu gen B là 62,3%, kiểu gen C là 37,7% [10] Một nghiên cứu khác được thực hiện ở Hà Nội trên người mang HBsAg cho thấy kiểu gen B là 77% và kiểu gen C là 22% [99] Sự phân bố kiểu gen HBV trên bệnh nhân nhiễm HBV nói chung bao gồm người nhiễm HBV không triệu chứng, viêm gan B mạn tính, cấp tính và có biến chứng tại Việt Nam... Margeridon nghiên cứu trên 17 bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị không phát hiện được đột biến kháng thuốc [82] Tác giả Nguyen M H nghiên cứu trên đối tượng bệnh nhân người châu Á (chủ yếu là người Việt Nam và Trung Quốc) sống tại Mỹ chỉ ghi nhận tỷ lệ đột biến kháng thuốc dưới 1% [93] Theo Elizabeth C, tỷ lệ đột biến kháng Lamivudine ở 45 bệnh nhân nhiễm HBV chưa điều trị được nghiên cứu là 2,9%[53]... HBV gồm có B2, B4 và C2, trong đó B4 là phổ biến nhất [99] 1.6.2 .Đột biến kháng thuốc của HBV ở người nhiễm HBV chưa điều trị 1.6.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Một số nghiên cứu của các tác giả nước ngoài về đột biến kháng thuốc của HBV trên bệnh nhân chưa điều trị thuốc kháng virus nhóm đồng phân Nucleotide cho thấy tỷ lệ đột biến thấp dưới 10% Tuy nhiên các nghiên cứu đầy đủ với cỡ mẫu đủ lớn... trọng [43] Trong số các kiểu gen của HBV đã được xác định, có 24 dưới kiểu gen (subgenotypes) đã được mô tả với sự khác biệt của 4-8% trình tự của bộ gen Kiểu gen A có hai dưới kiểu gen là Aa (A1) gặp ở Châu Phi, Châu Á và Ae (A2) gặp Châu Âu và Hoa Kỳ [35], [121] Kiểu gen B có sự phân bố các dưới kiểu gen ở 2 vùng địa lý riêng biệt: Bj (B1) gặp ở Nhật và Ba (B2) gặp ở châu Á Kiểu gen Ba được chia thành ... gen đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị ” với mục tiêu sau: Mô tả phân bố kiểu gen, kiểu gen HBV số đặc điểm sinh học bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị. .. nghiên cứu nước - Đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân điều trị Các nghiên cứu đột biến kháng thuốc bệnh nhân viêm gan B điều trị thực nhiều nhằm khảo sát kiểu đột biến kháng thuốc làm sở cho việc lựa... xuất đột biến phối hợp rt M204I + rtL180M + rtV207I với tỷ lệ 0,8%[10] - Đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân chưa điều trị Nghiên cứu đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV viêm gan B mạn tính