Xác định kiểu gen các đột biến kháng thuốc của virus viêm gan b trên bệnh nhân tại TP hồ chí minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Vũ Thị Ngọc Hà XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN TẠI TP HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Vũ Thị Ngọc Hà XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN TẠI TP HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS CAO MINH NGA Thành phố Hồ Chí Minh – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin đảm bảo xác trung thực cơng trình nghiên cứu khoa học cá nhân Các số liệu, kết luận văn hoàn toàn khách quan chưa tác giả cơng bố cơng trình khoa học khác Tp Hồ Chí Minh, Ngày 18/03/2015 Học viên Vũ Thị Ngọc Hà LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn, tơi nhận quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện cấp lãnh đạo, đồng nghiệp, người thân bạn bè Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn kính trọng đến : PGS.TS Cao Minh Nga, tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện cho suốt q trình học tập hồn thành luận văn TS Cao Hữu Nghĩa, BS Trần Tôn, ThS Nguyễn Đức Trúc anh chị phòng HIV- Khoa LAM- Viện Pasteur Tp Hồ Chí Minh nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Viện Pasteur Quý thầy cô giảng dạy lớp Vi sinh vật học khóa 23, q thầy Phịng Sau đại học, quý thầy cô Khoa Sinh học nhiệt tình tổ chức, giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho Ban Giám hiệu đồng nghiệp tổ Sinh học trường THPT Hiệp Bình- Quận Thủ Đức tạo điều kiện thuận lợi thời gian công việc để tơi học tập hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè lớp Vi sinh vật học Khóa 23 góp ý, động viên giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tp Hồ Chí Minh, Ngày 18/03/2015 Học viên Vũ Thị Ngọc Hà MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lịch sử tình hình nghiên cứu bệnh viêm gan B .5 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Tình hình nghiên cứu 1.2 Phân loại đặc điểm sinh học .9 1.2.1 Phân loại 1.2.2 Các dạng cấu trúc 1.2.3 Thành phần cấu trúc kháng nguyên 10 1.2.4 Cấu trúc gen HBV 11 1.2.5 Các kiểu gen HBV 15 1.2.6 Quá trình nhân HBV 16 1.3 Tình hình nhiễm HBV dịch tễ học 18 1.3.1 Tình hình nhiễm virus HBV giới Việt Nam 18 1.3.2 Dịch tễ học bệnh viêm gan siêu vi B 19 1.4 Đặc điểm sinh bệnh học 21 1.4.1 Con đường lây nhiễm 21 1.4.2 Triệu chứng lâm sàng 24 1.5 Biện pháp phòng ngừa điều trị .25 1.5.1 Biện pháp phòng ngừa 25 1.5.2 Điều trị 28 1.6 Các biến thể virus viêm gan B 34 1.6.1 Khía cạnh sinh thái học vi sinh vật biến thể HBV 34 1.6.2 Những đột biến nghiên cứu 35 1.6.3 Các vùng gen đột biến có ý nghĩa lâm sàng 35 1.6.4 Một số ghi nhận tình trạng kháng thuốc 36 1.7 Cơ sở phân tử ý nghĩa tượng đột biến gen .37 1.7.1 Cơ sở phân tử 37 1.7.2 Ý nghĩa đột biến lâm sàng 39 1.8 Kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng nghiên cứu 41 1.8.1 Một số kỹ thuật sinh học phân tử thường dùng để nghiên cứu 41 1.8.2 Kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng đề tài 41 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Bệnh phẩm quy trình nghiên cứu 42 2.2 Phương pháp nghiên cứu 43 2.2.1 Thu thập thông tin bệnh nhân mẫu bệnh phẩm 43 2.2.2 Kỹ thuật ELISA phát HBsAg huyết 44 2.2.3 Phương pháp tách chiết HBV DNA 45 2.2.4 Phương pháp real-time PCR 46 2.2.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 50 2.2.6 Điện di dung dịch PCR: 53 2.2.7 Tinh sản phẩm PCR 57 2.2.8 Phản ứng PCR sequencing 58 2.2.9 Tủa sản phẩm PCR sequencing 59 2.3 Giải trình tự 61 Chương KẾT QUẢ 64 3.1 Thông tin kết xét nghiệm bệnh nhân 64 3.1.1 Thông tin cá nhân 64 3.1.2 Hàm lượng DNA HBV 64 3.1.3 Xác định genotype tình trạng kháng thuốc 65 3.2 Phân tích kết 71 3.2.1 Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân 71 3.2.2 Sự phân bố genotype theo hàm lượng DNA 72 3.2.3 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo giới tính bệnh nhân 72 3.2.4 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo hàm lượng DNA 73 3.2.5 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo genotype .74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 4.1 Kết luận .77 4.2 Kiến nghị .77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADV: Adeforvir dipivoxil ALT : Alamine aminotransferase cccDNA: covalently closed cicular DNA DNA: Deoxyribonucleic acid HBV: Hepatitis B virus- virus gây viêm gan siêu vi B HBsAg: Hepatitis B Surface Antigen – Kháng nguyên bề mặt virus gây viêm gan B HBcAg: Hepatitis B Core Antigen – Kháng nguyên lõi virus gây viêm gan B HBeAg: Hepatitis B Early Antigen – Kháng nguyên lõi virus gây viêm gan B HCV: Hepatitis C virus- virus gây viêm gan siêu vi B LAM: Lamivudine mRNA: RNA thông tin NER: nucleotide excision repair ORF: Open Reading Frame PCR: Polymerase Chain Reaction pgRNA: pregenomic RNA RNA: Ribonucleic acid RT: Reverse Transcriptase SGOT: serum glutamic pyruvic transaninase VG: viêm gan VG A: viêm gan A VG B: viêm gan B VGVR: viêm gan virus DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Kỹ thuật sinh học phân tử .41 Bảng 2.1 Hóa chất PCR1 51 Bảng 2.2 Hóa chất PCR2 52 Bảng 2.3 Quy trình PCR 53 Bảng 3.1 Tỉ lệ tải lượng HBV DNA .65 Bảng 3.2 Tỉ lệ genotype 68 Bảng 3.3 Sự phân bố genotype theo hàm lượng DNA 72 Bảng 3.4 Tình trạng kháng thuốc theo hàm lượng DNA .73 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Tỉ lệ nhiễm HBV theo giới tính 64 Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ kháng thuốc HBV 71 Biểu đồ 3.3 Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân .72 Biểu đồ 3.4 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo giới tính .73 Biểu đồ 3.5 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo Genotype 74 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Các dạng cấu trúc HBV 10 Cấu trúc loại kháng nguyên 11 Cấu trúc gen HBV 14 Sự phân bố kiểu gen HBV giới 15 Quá trình nhân lên HBV tế bào chủ 17 Bản đồ phân tán virus Viêm gan B 20 Hình 1.7 Hình 1.8 Hình 1.9 Hình 1.10 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Cơng thức hóa học LAM 31 Cơ chế tác động LAM 32 Cấu tạo ADV 33 Cơ chế tác động ADV 34 Đường chuẩn xây dựng từ nồng độ DNA standard biết 49 Kết real-time HBV DNA standard, mẫu chứng âm mẫu dương tính với HBV 50 Thang DNA 100bp 56 Hình 2.4 Hình 3.1 Hình 3.2 Thang DNA kb 57 Kết giải trình tự HBV genotype B hoang dại 66 Kết giải trình tự HBV genotype B đột biến 67 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Viêm gan vấn đề sức khỏe giới quan tâm Hiện có loại virus viêm gan, virus A, B, C, D, E G; virus HBV HCV nguy hiểm Theo ước tính Tổ chức Y tế giới (WHO), giới có khoảng tỷ người nhiễm virus viêm gan B 200 triệu người nhiễm virus viêm gan C HBV loại virus thuộc họ Hepdnavirus, có khả gây bệnh viêm gan, hoại tử gan cấp mạn tính, xơ gan đặc biệt ung thư biểu mô tế bào gan HBV có đường lây nhiễm giống HIV (lây truyền đường máu, đường mẹ sang con, qua đường tình dục khơng an tồn tiếp xúc với dịch tiết qua vết xước…) khả lây nhiễm gấp 100 lần so với HIV HBV yếu tố gây ung thư đứng thứ sau thuốc lá, nguyên nhân gây 60- 80% trường hợp ung thư gan nguyên phát 50% trường hợp xơ gan [59] Tỉ lệ nhiễm HBV thay đổi theo vùng địa lí khác nhau: 8% dân số Châu Phi Châu Á, 2-7% Nam Âu Đông Âu, khoảng 2% Tây Âu, Bắc Mỹ Châu Úc [18] Theo công bố Chủ tịch Hội Gan Mật Việt Nam Hội nghị Gan Mật toàn quốc khai mạc ngày 28/9/2013, có khoảng 20 triệu người Việt Nam nhiễm virus viêm gan, có khoảng 12-16 triệu người bị nhiễm viêm gan B (khoảng triệu người bị viêm gan mãn tính, xơ gan, ung thư gan) Như vậy, nước ta nằm vùng lưu hành cao với 8-15% dân số nhiễm HBV khoảng 47,6% dân số tiếp xúc với HBV Để phòng bệnh viêm gan HBV gây ra, có vacxin phịng bệnh cho trẻ em người có nguy lây nhiễm cao Thuốc kháng virus để điều trị viêm gan B mạn tính nghiên cứu đưa vào sử dụng rộng rãi thuốc chích interferon, thuốc uống thuộc nhóm L- Nucleoside, nhóm Acyclic Phosphonate, nhóm vịng Cyclopantatane/Pentene Hiện có ba nhóm thuốc kháng HBV (antiviral drugs) dạng uống sử dụng phổ biến để điều trị viêm gan virus B mạn là: (1) nhóm LNucleoside gồm Lamivudine (LMV), Telbivudine (LdT), Emtricitabine (FTC) Clevudine (L- FMAU); (2) nhóm Acyclic Phosphonate gồm: Adeforvir dipivoxil (ADV) Tenofovir (TDF); (3) nhóm vịng Cyclopantatane/Pentene gồm Entecavir (EBV), Abacavir/ Cabovir (ABC) Các thuốc có tác dụng ức chế enzyme reverse polymerase- enzyme xúc tác cho chép ngược từ mRNA thành DNA HBV làm giảm nhân lên HBV, từ làm giảm cách có ý nghĩa biến chứng xơ gan, ung thư biểu mô tế bào gan nguy tử vong bệnh nhân Tuy nhiên, việc điều trị thời gian dài với thuốc làm xuất đột biến kháng thuốc (HBV antiviral drug resistance mutations) gen P HBV, làm tác dụng thuốc, dẫn đến điều trị thất bại làm bệnh gan tiếp tục phát triển [19] Những tiến kỹ thuật sinh học phân tử vào năm cuối kỹ 20 giúp khám phá đa dạng trình tự chuỗi vi rút viêm gan B, từ dấu ấn (marker) HBV đời HBV genotype Chín kiểu gen HBV xác định (Từ A đến I) dựa vào khác 8% tồn trình tự chuỗi gen HBV, phân bố kiểu gen khác châu lục, nước khác Tuy nhiên phân loại HBV genotype cần dựa trình tự chuỗi (sequence) đoạn gen HBV phần trình tự chuỗi gen pre-S, S Có nhiều phương pháp nghiên cứu dùng việc xác định HBV genotype giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch enzyme (Enzyme-linked Immunoassay) Real –time PCR Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm khác nhau, nhiên phương pháp giải trình tự chuỗi có nhiều ưu điểm bật bên cạnh việc xác định trình tự chuỗi nucleotides gen HBV để từ so sánh với thư viện gen xác định HBV genotype mà dựa vào kết giải trình tự xác định số dạng đột biến kháng thuốc HBV để từ có phác đồ điều trị tối ưu [23] Xác định kiểu gen đột biến kháng thuốc cần thiết bệnh nhân điều trị Viêm gan siêu vi B thuốc uống Tuy nhiên, bệnh nhân nhiễm HBV chưa điều trị xét nghiệm chưa quan tâm Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài nghiên cứu: “XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN BỆNH NHÂN TẠI TP.HỒ CHÍ MINH” Mục tiêu nghiên cứu 69 HBeAg); trình bệnh sinh gan, trốn thoát khỏi hệ thống miễn dịch, đáp ứng thuốc điều trị kháng thuốc điều trị virus [43] Một nghiên cứu Nhật Bản bất thường chức gan (mức aminotransferase huyết bất thường) thường xuyên ghi nhận nhiễm kiểu gen B kiểu gen C; kiểu gen B có số hoạt tính mơ học (histological activity score - HAI score) thấp [47] Một nghiên cứu khác Nhật Bản thực 585 bệnh nhân viêm gan mạn người nhiễm kiểu gen B có tiến triển sang xơ gan chậm kiểu gen C [36] Kiểu gen B cho có liên quan cách tự nhiên với tồn HBeAg huyết người nhiễm độ tuổi trẻ bệnh lý gan trầm trọng so với kiểu gen C [29] Ba nghiên cứu khác thực 490 người Trung Quốc 155 người Nhật Bản đánh giá kiểu gen C phổ biến bệnh nhân xơ gan kiểu gen B [32],[38],[46] Nghiên cứu Mỹ cho thấy xơ gan người nhiễm kiểu gen B diễn chậm Ung thư gan diễn chậm với kiểu gen B; bệnh nhân có kiểu gen B phát triển thành ung thư gan độ tuổi già Giả thuyết đặt để lý giải cho quan sát kiểu gen B cần thời gian ngắn đế tái mức độ cao, mà hệ tính chất gây viêm sau tế bào gan [29] Tuy nhiên, nghiên cứu khác Đài Loan lại cho thấy kết ngược lại với công bố trước Nghiên cứu kiểu gen B xuất thường xuyên kiểu gen khác bệnh nhân ung thư gan trước 50 tuổi [38] Mối liên quan mức HBV DNA kiểu gen nghiên cứu khác cho thấy có kết qua trái ngược Một nghiên cứu HBV DNA máu cao người nhiễm kiểu gen C B [39] Ngược lại, số hồi cứu lại thất bại việc chứng minh tương quan mức độ HBV DNA kiểu gen nhiễm [28],[48],[53] Sự thay đổi cấu trúc vỏ bao (precore) HBV dường độc lập với kiểu gen Đột biến chiếm ưu vỏ bao ngồi G  A vị trí 1896 (G1896A), nucleotide vị trí cuống (stem) đối diện 1858 T (thay A) HBV kiểu gen 70 A hầu hết mang nucleotide C vị trí 1858 Điều giải thích hầu hết thay đổi vỏ bao ngồi G1896A khơng thường xun ghi nhận Mỳ Bắc Âu, kiểu gen A chiếm ưu [46] Ngược lại, kiểu gen B, C D thường xuyên mang nucleotide T vị trí 1858, kiểu đột biến G1896A thường xuyên ghi nhận kiểu gen này, tương tự Châu Á Địa Trung Hải [48] Hai thay đổi phổ biến nằm vùng promoter lõi (core) (từ nucleotide 1742 đến 1849) A1762T G1764A Ngày có nhiều chứng cho thấy có tương quan hình thức đột biến kiểu gen Đã có công bố cho thấy người châu Á mang kiểu gen C có kiểu đột biến A1762T G1764A kiểu gen B [41] Trên giới có nhiều cơng bố phân tích mối tương quan kiểu gen với cách đáp ứng thuốc kháng virus Kiểu gen nhiễm cho có ảnh hưởng đến đáp ứng điều trị với interferon Hai nghiên cứu 58 bệnh nhân Đài Loan 109 bệnh nhân Hồng Kông cho thấy, trình điều trị interferon, kiểu gen B có tốc độ lưu hành HBeAg cao kiểu gen C (41% so với 15%) [49],[54] Cho đến nay, nghiên cứu kiểu gen HBV rải rác, số liệu không nhiều kết công bố tương quan kiểu gen với yếu tố lâm sàng, cận lâm sàng chưa thống hồn tồn Chính nên bác sĩ thường không quan tâm tới xét nghiệm xác định kiểu gen 3.1.3.2 Xác định tình trạng kháng thuốc Có 51/65 mẫu bị nhiễm HBV dạng hoang dại chiếm 78,5%, 11 mẫu (16,9%) bệnh nhân nhiễm HBV dạng đột biến kháng Lamuvidime.Tỉ lệ đột biến kháng thuốc nghiên cứu cao nghiên cứu Nguyễn Thị Hải Yến ( 8%) [20] 71 4,6% 16,9% 78,5% Đột biến V207M Hoang dại Âm tính Biểu đồ 3.2 Tỉ lệ kháng thuốc HBV 3.2 Phân tích kết 3.2.1 Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân Nhóm bệnh nhân nam, tỉ lệ genotype B 70,0 % cao so với genotype C (25,0%) Ở nhóm bệnh nhân nữ, tỉ lệ genotype B 72%, genotype C 24% Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê phân bố loại genotype theo giới tính Tỉ lệ nghiên cứu gần tương đồng với nghiên cứu Đơng Thị Hồi An cộng đối tượng bệnh nhân xơ gan Tỉ lệ phân bố genotype theo giới Đơng Thị Hồi An cs là: Đối với nam, genotype B chiếm khoảng 73% (27/37 trường hợp), genotype C chiếm khoảng 27% (10/37 trường hợp); nữ, genotype B chiếm khoảng 80% (12/15 trường hợp), genotype C chiếm khoảng 20% (3/15 trường hợp) [9] 72 80 70% 72% 70 60 50 Nam (n=40) 40 Nữ ( n=25) 30 25% 24% 20 10 5% 4% Genotype B Genotype C Âm tính Biểu đồ 3.3 Sự phân bố genotype theo giới tính bệnh nhân 3.2.2 Sự phân bố genotype theo hàm lượng DNA Bệnh nhân nhóm hàm lượng HBV- DNA genotype B chiếm tỉ lệ cao (76,2%, 54,2%, 85,0%), genotype C chiếm tỉ lệ thấp (19,0%, 45,8%, 5,0%) Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê Bảng 3.3 Sự phân bố genotype theo hàm lượng DNA Lượng DNA Genotype B Genotype C Âm tính 102 -105 (n = 21) 76,2% 19,0% 4,8% 105 -108 (n = 24) 54,2% 45,8% >108 ( n= 20) 85,0% 5,0% 10.0% 3.2.3 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo giới tính bệnh nhân Trong 65 mẫu huyết đem giải trình tự, có 15,0% huyết nhóm bệnh nhân nam 20,0% huyết nhóm bệnh nhân nữ xuất đột biến kháng thuốc Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê.Tỉ lệ nghiên cứu cao nghiên cứu Nguyễn Thị Hải Yến: Nam 21/211 trường hợp, nữ 8/151 trường hợp phát đột biến [20] 73 90 80% 80 76% 70 60 Giới tính 50 Nam (n= 40) 40 Nữ 30 ( n= 25) 20% 15% 20 5% 10 4% Hoang dại Kháng thuốc Âm tính Biểu đồ 3.4 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo giới tính 3.2.4 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo hàm lượng DNA Trong nhóm bệnh nhân có hàm lượng HBV- DNA 102- 105 copie/ml, có tới 33.3% bệnh nhân có virus kháng thuốc Ở nhóm hàm lượng DNA 105- 108 copie/ml tỉ lệ kháng thuốc thấp (16,7%) Các bệnh nhân có lượng HBV- DNA 108- 109 copies/ml, khơng thấy tìm thấy tượng kháng thuốc Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê tình trạng kháng thuốc hàm lượng HBV- DNA Tỉ lệ phân bố đột biến kháng thuốc theo hàm lượng DNA nghiên cứu Nguyễn Thị Hải Yến 5/124 trường hợp có tải lượng DNA HBV < 105 copies/ml chiếm khoảng 4% 24/238 trường hợp có có tải lượng DNA HBV ≥ 105 copies/ml chiếm khoảng 10% Tỉ lệ phân bố đột biến V207M theo tải lượng DNA Nguyễn Thị Hải Yến có ý nghĩa mặt thống kê [20] Bảng 3.4 Tình trạng kháng thuốc theo hàm lượng DNA Hàm lượng DNA Hoang dại Kháng thuốc Âm tính 102- 105 (n= 21) 61,9% 33,3% 4,8% 105 – 108 (n= 24) 83,3% 16.7% 0% 108 – 109 (n= 20) 90,0% 0% 10,0% 74 3.2.5 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo genotype 120 100% 100% 100 80 76,1% Genotype Genotype B ( n= 46) 60 Genotype C ( n= 16) Âm tính 40 ( n= 3) 23,9% 20 0% 0% 0% 0% 0% Hoang dại Kháng thuốc Âm tính Biểu đồ 3.5 Sự phân bố tình trạng kháng thuốc theo Genotype Trong 65 bệnh nhân tham gia nghiên cứu, có 23,9% bệnh nhân thuộc genotype B xuất tình trạng kháng thuốc Sự kháng thuốc khơng tìm thấy nhóm bệnh nhân có HBV mang genotype C Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa mặt thống kê Để điều trị bệnh nhiễm virus viêm gan siêu vi B, nhóm thuốc tương tự nucleoside sử dụng nhiều có hiệu ức chế nhân lên virus Nhóm thuốc tương tự nucleoside thường sử dụng Lamivudine, Adefovir entecavir Nhóm thuốc ưa chuộng có nhiều tính tiện dụng dùng để uống, giá thành phải chăng, tác dụng phụ Tuy nhiên, để có hiệu kháng virus bệnh nhân cần tuân thủ nghiêm ngặt phác đồ điều trị bác sĩ phải điều trị thời gian dài Sau sử dụng thuốc năm lại phát sinh thêm vấn đề kháng thuốc tỉ lệ kháng thuốc tăng dần thời gian sử dụng Thông thường, LAM lựa chọn liệu pháp điều trị, sau phát có tượng kháng thuốc ADV liệu pháp điều trị kết hợp thay Hiện tượng kháng thuốc virus chủ yếu do: - Khả sinh sản nhanh virus: mức độ sinh sản hàng ngày hạt virus hoàn chỉnh nằm dãy 1012 - 1013 Trong nghiên cứu gần cho thấy chu kì bán sinh hạt HBV hồn chỉnh tự nằm khoảng 3- 24 đồng hồ Chu kì 75 bán sinh tế bào nhiễm HBV lên đến 100 ngày Vì vậy, để diều trị viêm gan B mãn tính hiệu phải dùng biện pháp lâu dài - Các đột biến xảy liên tục suốt chu kì sinh sản virus enzyme phiên mã ngược HBV tổng hợp acid nucleic có xu hướng polymer hóa sai lại thiếu khả sửa sai Theo lý thuyết ngày thể bệnh nhân nucleotide gen 3,2kb HBV bị thay - Khả gắn vào vùng đặc hiệu thuốc giảm đột biến xảy làm thay đổi cấu trúc vùng hoạt tính phiên mã ngược enzyme polymerase virus Việc xuất đột biến kháng thuốc không làm bùng phát virus thể bệnh nhân mà cịn có khả phát tán từ người sang người khác gây tình trạng kháng thuốc cộng đồng [45] Hiện nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu tình trạng kháng thuốc đối tượng chưa điều trị thuốc kháng virus viêm gan siêu vi B Chúng khảo sát nhóm đối tượng thu nhận tỉ lệ kháng thuốc 16,9% (11/65 mẫu huyết thanh) Các nghiên cứu nước đột biến kháng thuốc, tác giả thường quan tâm tới bệnh nhân điều trị thuốc kháng virus nên tỉ lệ đột biến cao nghiên cứu Như nghiên cứu tác giả Hồ Tấn Đạt cs (2009) đột biến kháng Lamivudine, tỉ lệ đột biến tăng dần theo thời gian điều trị 27,8%- 63,4%- 71,1% tương ứng với thời gian năm- năm- năm trở lên [13] Theo nghiên cứu Nguyễn Thị Nhã Đoan cộng sự, tỉ lệ đột biến kháng LAM tương ứng với thời gian 16%45%- 83% [21] Nghiên cứu Nguyễn Thị Nhã Đoan phát trường hợp mang đột biến kháng ADV Nghiên cứu Nguyễn Thị Nhã Đoan có phát đột biến rtV207M chiếm tỉ lệ 8,33% có trường hợp rtV207M xuất kèm theo đột biến kháng LAM rtM204I rtL80V/I Trong nghiên cứu, ghi nhận dạng đột biến rtV207M, dạng đột biến kháng LAM coi đột biến kháng thuốc khơng có ý nghĩa Theo nghiên cứu B.Zo”llner cs, V207I/M dạng đột biến kháng thuốc invitro chiếm khoảng 1% số bệnh nhân viêm gan B mạn, chúng xuất bệnh nhân chưa điều trị thuốc kháng virus Tuy vậy, vai trò dạng đột biến V207M/I chưa xác định rõ rệt nên tác giả 76 giới chưa xếp rtV207M/I vào bảng tổng kết chung mà coi đột biến xuất kèm theo [54] Kết nghiên cứu gần giống với kết tác giả Nguyen,M.H cs khu vực Châu Á (2009), tỉ lệ đột biến thu nhận 472 đối tượng chưa sử dụng thuốc, có tới 16,7% trường hợp đột biến rt V207M/I Ngoài ra, nghiên cứu tác giả phát thêm trường hợp đột biến rt A181A/S, rtA194S M250I mà nghiên cứu không thấy xuất [44] Gần đây, tác giả Nguyễn Thị Hải Yến công bố kết đột biến kháng thuốc đối tượng bệnh nhân viêm gan B mạn tính chưa điều trị thuốc kháng virus tới khám phòng khám Tp Cần Thơ; nghiên cứu phát loại đột biến rt V207M với tỉ lệ 8% [20] LAM lựa chọn phác đồ điều trị bác sĩ LAM đưa vào sử dụng trước giá thành LAM thấp 1/10 so với ADV nên tỉ lệ kháng LAM cao so với loại thuốc ADV, ETV Vì kháng LAM trở thành tác nhân chọn lọc với virus thời gian sớm hơn, bệnh nhân chưa điều trị thuốc đột biến kháng ADV, ETV khơng phát ngun nhân Nghiên cứu không phát đột biến kháng LAM có ý nghĩa như: I169T, V173L, L180M, A181T, T184S, M204I/S/V, Q215S tác dụng chọn lọc quần thể virus 77 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Chúng thu nhận 65 mẫu huyết bệnh nhân chưa điều trị thuốc kháng viêm gan siêu vi B có HBV- DNA từ 102 copie/mt trở lên để xác định kiểu gen tình trạng kháng thuốc, chúng tơi rút kết luận: Sự phân bố kiểu gen HBV bệnh nhân: gồm genotype B C genotype B chiếm tỉ lệ 70,8%, genotype C chiếm tỉ lệ thấp 24,6% Có trường hợp âm tính chiếm 4,6% Khơng có mối liên quan tỉ lệ genotype với giới tính, tải lượng HBV- DNA Tình trạng kháng thuốc nghiên cứu: xác định loại đột biến rtV207M chiếm 16,9% Đây dạng đột biến kháng thuốc khơng có ý nghĩa với Lamivudine Khơng có mối liên quan tình trạng kháng thuốc với giới tính, tải lượng HBV- DNA, genotype HBV 4.2 Kiến nghị Thực khảo sát vùng địa lý rộng hơn, số lượng mẫu lớn để có số liệu hoàn thiện dịch tễ học phân tử genotype HBV Việt Nam Điều tra thông tin bệnh nhân để xác định khả truyền nhiễm Phân tích thêm mối tương quan đột biến số xét nghiệm men gan dấu ấn miễn dịch HBV 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ môn nội (2000), Viêm gan siêu vi B: từ cấu trúc siêu vi đến điều trị, Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh Bùi Đại cộng (2002), Viêm gan B D, Nhà xuất Y học Bùi Hữu Hoàng, Đinh Dạ Lý Hương, Phạm Hoàng Phiệt, Erwin Sablon (2003), “Kiểu gen siêu vi viêm gan B bệnh nhân xơ gan ung thư gan nguyên phát”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 7, phụ số Bùi Xuân Trường, Nguyễn Văn Bàng (2009), “Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B/C kiểu gen virus viêm gan B thuộc khu vực biên giới Việt-Trung huyện Bát Xát tỉnh Lào Cai”, Tạp chí nghiên cứu Y học, 64(5),52-59 Cao Minh Nga (2014), Virus y học, Đại học Y dược Tp Hồ Chí Minh Cao Minh Nga, Nguyễn Thanh Bảo, Nguyễn Thị Hải Yến, Trần Thị Như Lê, Trần Thị Ngọc Anh, “Sự phân bố kiểu gen (Genotype) virus viêm gan B (HBV) trẻ em nhiễm HBV”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, Chuyên đề Nội khoa, tập 15, phụ số 1: 188- 192 Đơng Thị Hồi An, Cao Minh Nga, Phạm Hoàng Phiệt, Kenji Abe (2003), “Kỹ thuật định type gen siêu vi viêm gan B multiplex PCR bệnh nhân nhiễm siêu vi viêm gan B mãn tính”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, Chuyên đề Y học sở, tập 7, phụ số 1: 145- 150 Đơng Thị Hồi An, Nguyễn Hữu Chí, Đỗ Đình Hồ, Phạm Hồng Phiệt (2007), “Kiểu gen siêu vi viêm gan B viêm gan siêu vi B cấp”, Tạp chí Y học Thành phố Hồ Chí Minh, 11(3), 61-66 Đơng Thị Hồi An, Phạm Thị Thu Hà, Đường Thị Hồng Điệp, Phạm Trần Diệu Hiền, Vũ Thị Thúy Hà, Đỗ Đình Hồ, Phạm Hồng Phiệt (2007), “Xác định kiểu gen siêu vi viêm gan B bệnh nhân xơ gan”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, Chuyên đề Nội khoa, tập 11, phụ số 1: 147- 152 10 Đinh Lý Dạ Hương, Bùi Hữu Hoàng, Trần Thiện Tuấn Huy, Trần Ngọc Bảo (2000), Viêm gan siêu vi B – từ cấu trúc siêu vi đến điều trị, Nxb Đà Nẵng 11 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003), Sinh học phân tử, Nhà xuất Giáo dục 79 12 Hoàng Ngọc Bảo Mi (2012), Xây dựng quy trình phát đột biến basal core promoter precore virus viêm gan B kỹ thuật real- time PCR, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh 13 Hồ Tấn Đạt, Phạm Thị Thu Thủy, Nguyễn Bảo Toàn, Nguyễn Thị Kiều Oanh, Nguyễn Thanh Tòng (2007), “Xác định kiểu gen đột biến kháng thuốc siêu vi viêm gan B kỹ thuật giải trình tự chuỗi”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh Chuyên đề Nội khoa, tập 11, phụ số 11: 153- 158 14 Hồ Thị Thanh Thủy, Nguyễn Bảo Toàn, Lê Huyền Ái Thúy, Nguyễn Duy Khánh, Cao Minh Nga, Vũ Thị Tường Vân (2009), “Ứng dụng kỹ thuật realtime PCR realtime RT- PCR xác định kiểu gen virus gây viêm gan siêu vi B C”, Tuyển tập Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc khu vực phía Nam năm 2009, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật: 382- 386 15 Lê Thị Dung (2010), Xây dựng quy trình phát đột biến rtA181V/T rt N236T kháng Adefovir virus viêm gan B kỹ thuật real- time PCR, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh 16 Lê Thị Đỗ Quyên (2010), Đặc điểm kiểu gen siêu vi viêm gan B bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn tính, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh 17 Nguyễn Hữu Chí (2009), Điều trị bệnh viêm gan siêu vi mạn tính, Nxb Y học 18 Nguyễn Đức Mạnh, Lê Lương Tĩnh (2013), Tình hình kháng thuốc kháng virus virus viêm gan B biện pháp xử lý, Báo Quân đội nhân dân 19 Nguyễn Nghiêm Luật (2013), Virus viêm gan B(HBV): Các đột biến kháng thuốcchìa khóa để điều trị HBV kháng thuốc thành công, Bệnh viện Đa khoa MEDLATEC 20 Nguyễn Thị Hải Yến, Nguyễn Thanh Bảo, Cao Minh Nga (2015), ”Phát đột biến kháng thuốc HBV bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính chưa điều trị kỹ thuật giải trình tự”, Tạp chí Y học Tp Hồ Chí Minh, Tập 19, phụ số 1, p 365- 368 21 Nguyễn Thị Nhã Đoan, Bùi Hữu Hoàng, Phạm Hùng Vân (2011), “Đột biến kháng thuốc bệnh nhân viêm gan virus B mạn điều trị thuốc tương tự 80 nucleos(t)ide” Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, Chuyên đề Lão khoa, tập 15, phụ số 2: 87- 93 22 Phạm Hoàng Phiệt (1999), Diễn biến tự nhiên nhiễm siêu vi viêm gan B mạn tính, Sinh hoạt thường kỳ lần II Hội gan mật Tp.Hồ Chí Minh 23 Phạm Thị Thu Thủy, Hồ Tấn Đạt (2007), Xác định kiểu gen virus viêm gan B đột biến kháng thuốc kỹ thuật giải trình tự chuỗi, Trung tâm y khoa MEDICTp Hồ Chí Minh 24 Tierney, Mc Phee, Papadakis (2008), Chẩn đốn điều trị y học đại Tập 2, Nhà xuất Y học 25 Phí Đức Long (2014), Đánh giá đáp ứng tạo kháng thể vắc xin phịng viêm gan B trẻ có mẹ mang HBsAg, Luận án Tiến sĩ, Đại học Y Hà Nội 26 Trịnh Thị Ngọc (2008), “Lịch sử diễn tiến tự nhiên viêm gan vi rút B phác đồ điều trị”, Tạp chí gan mật học Việt Nam, số 6, tr.56-62 27 Trương Bá Trung (2006), Điều trị thêm Adefovir dipivoxyl bệnh nhân viêm gan B kháng Lamivudine, Hội nghị tiếp cận đa phương với bệnh viêm gan virus B/C Tp Hồ Chí Minh Tiếng Anh 28 Chu C.J., Hussain M., Lok A.s (2002), “Hepatitis B virus geneotype B is associated with earlier HBeAg seroconversion compared with hepatitis B virus geneotype C”, Hepatology, v 122, p 1756-1762 29 Chu C.J., Lok A.s (2005), “Hepatitis B virus geneotype and molecular variants”, Hepatology, 25, 1375- 1378 30 Chu CJ, Anna SF Lok (2002), “Clinical significance of hepatitis B virus genotypes”, Hepatology, 35, 1274-76 31 Das, K et al (2001), “Molecular Modeling and Biochemical Characterization Reveal the Mechanism of Hepatitis B Virus Polymerase Resistance to Lamivudine (3TC) and Emtricitabine (FTC)”, Journal of Virology, 75(10): 4771- 4779 32 Ding X., Mizokami M., Yao G., Xu B., Orito E., Ueda R (2001), “Hepatitis B virus geneotype distribution among chronic hepatitis B virus carriers in Shanghai Chin”, Interviology, v 44, p 43-47 81 33 Ghang M and Liang TJ (2007), “Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic Hepatitis B”, Gastroerology, 132(4), 1574 – 1585 34 Grandjacques C., Pradat P., Stuyver L., Chevallier M., Chevallier P., Pichoud C (2000), “Rapid detection of geneotypes and mutations in the pre-core promoter and the pre-core region of hepatitis B virus geneome: correlation with viralpersistence and disease severity”, J Hepatol, v 33, p 430-439 35 Hoofnagle JH, Doo E, Liang TJ, Fleischer R, Lok AS (2007) “Management of hepatitis B: Summary of a clinical research workshop”, Hepatology, 45(4), 10561075 36 Hwang EW, Cheung R (2011), “Global Epidemiology of Hepatitis B virus (HBV) Infection”, North American Journal of Medicine of Science, (1), 7-13 37 Jake Liang T, Michael Craig (2006), Summary of mutations associated with resistance to HBV drugs, Clinical Care Options 38 Kao J.H, Chen P.J, Lai M.Y, Chen D.s (2000), “Hepatitis B geneotypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B”, Gastroenterology, v 118, p 554-559 39 Kao J.H., Liu C.J., Chen D.s (2002), “Hepatitis B viral geneotypes and lamivudine resỉstanc”, J Hepatol, v 36, p 303-304 40 Liaw, Y.F (2002), “Management of YDDM mutations during lamivudine therapy in patients with chronic hepatitis B”, Jornal of Gastroenterology and Hepatology, (17): S333- S337 41 Lindh M., Hannoun, Dhillon A.P, Norkrans G., Horal P (1999), “Core promoter mutations and geneotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis B virus carriers”, J Infect Dis 1999, v 179, p 775-782 42 Mahoney FJ (1999), “Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection”, Clinical Microbiology Reviews, 12(2), 351- 366 43 Mamun-Al Mahtab, Salimur Rahman, Mobin Khan and Fazal Karim (2008), Hepatitis B virus geneotypes: an overview, Hepatobiliary Pancreat Dis Int 44 Nguyen, M H., Garcia,R T., Trinh, H N., Nguyen, H.A., Nguyen,K.K., Nguyen,L.H., et al (2009), “Prevalence of hepatitis B virus DNA polymerase 82 mutations in treatment-naïve patients with chronic hepatitis B”, Aliment Pharmacol Ther, 30(11-12), 1150- 1158 45 Phạm Hùng Vân (2005), “The complete solution using molecular biology tools for diagnostic and monitoring HBV and HCV infection, Proceedings of the 6th colloquium Asian Netword for Clinical Laboratory Standardization and Harmonization (Oct 27- 29/2005)”, VACB and University of Medicine and Pharmacy in HCM, p.31- 36 46 Sakugawa H., Nakasone, Nakayoshi T., Orito E., Mizokami M., Yamashiro T (2002), “Preponderance of hepatitis B virus geneotype B contributes to a better prognosis of chronic HBV infection in Okinawa, Japan”, J Med Virol, v 67, p 484-489 47 Shiina S., Fujino, Uta, Tagawa K., Unuma T., Yoneyama M (1991), “Relationship of HBeAg subtypes with HBeAg/anti-HBe status and chronic liver disease Part I: Analysis of 1744 HBeAg carriers”, Am J Gastroenterol, v 86, p 866-871 48 Sumi H., Yokosuka., Seki N., Arai, Imazeki, Kurihara T (2003), “Influence of hepatitis B virus geneotypes on the progression of chronic type B liver disease”, Hepatology, v 7, p 19-26 49 Wai C.T., Chu C.J., Hussain M., Lok A.S (2002), “HBV geneotype B is associated with better response to interferon therapy in HBeAg(+) chronic hepatitis than geneotype C”, Hepatology, v 36, p 1425-1430 50 Xin Ding, Hongxi Gu (2003), “Molecular epidemiology of Hepatitis virus and Geneotypic distribution Hepatitis B and C virus in Harbin China”, Jpn.J.Infect.Dis, p 19-22 51 Xu XW and Chen.YG (2006), “Current therapy with nucleoside/ nucleotide analogs for patients with chronic hepatitis B”, Hepatobiliary Pancreat Dis Int, (5), p 350 – 359 52 Yap S P., Sulaiman A., Lesmana I et al (2000), “Immunotherapy of chronic hepatitis B in Asian patients using a novel triple antigen hepatitis B (Hepacare)”, Antiviral therapy, 5(Suppl.1), p 68 53 Yuen M.F., Sablon E., Yuan H.J, Wong D.K (2003), “Significance of hepatitis B 83 geneotype in acute exacerbation, HBeAg seroconversion, cirrhosis- related complications and hepatocellular carcinoma”, Hepatology, p 537:562 54 Zollner, B., Sterneck, M., Wursthorn, K., Petersen, J., Schroter, M., Laufs, R., et al (2005), “Prevalence, incidence, and clinical relevance of the reverse transcriptase V207I mutation outside the YDDM motif of the hepatitis B virus polymerase during lamivudine therapy”, J Cin Microbiol, 43(5), 2503- 2505 55 Zuckerman JN (2007), “Review: Hepatitis B Immune Globulin for Prevention of Hepatitis B Infection”, Journal of Medical Virology, 79, 919-921 56 World Health Organization (2002), Hepatitis B, WH0/CDS/CSRL/LY0/2002 57 World Health Organization (2001), Introduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization services, WH0/V&B/01.31 Internet 58 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hepatitis_B_virus_v2.svg 59 http://hoiyhoctphcm.org.vn/index.php?mod=dt&act=ct&id_cate=13&id=197 60 http://www.camnangbenh.com 61 http://www.drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.html 62 http://www.nature.com/ajg/journal/v97/n7/fig_tab/ajg2002427f1.html 63 http://www.microbiologybytes.com/virology/HBV.html 64 http://www1.qiagen.com/Default.aspx 65 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/1356836?lang=en®ion 66 http://tbr.vn/san-pham/hoa-chat/hoa-chat-bioline/hyperladder%E2%84%A2-1kbplus 67 http://viemgansieuvitrung.blogspot.com ... nghiên cứu: “XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN B? ??NH NHÂN TẠI TP. HỒ CHÍ MINH? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định genotype HBV b? ??nh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B chưa điều.. .B? ?? GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Vũ Thị Ngọc Hà XÁC ĐỊNH KIỂU GEN, CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC CỦA VIRUS VIÊM GAN B TRÊN B? ??NH NHÂN TẠI TP HỒ CHÍ MINH Chuyên... điều trị thuốc kháng virus Mô tả phân b? ?? genotype HBV theo giới tính, lứa tuổi, số lượng HBV- DNA Khảo sát kiểu đột biến tỉ lệ đột biến kháng thuốc b? ??nh nhân chưa điều trị thuốc kháng virus Đối