Phát hiện đột biến DNA ti thể trong bệnh lý thần kinh thị giác di truyền Leber bằng kỹ thuật giải trình tự gen

Nội dung của bài viết trình bày về bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER - một rối loạn di truyền ti thể gây mất thị lực hoàn toàn mà không gây đau. Kết quả nghiên cứu cho thấy, bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR và kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể trong bệnh LHON.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN DNA TI THỂ TRONG BỆNH LÝ THẦN KINH THỊ GIÁC DI TRUYỀN LEBER BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Hồng Hiếu Ngọc*, Phạm Hùng Vân**, Huỳnh Viết Lộc** TÓMTẮT Đặt vấn đề: Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER rối loạn di truyền ti thể gây thị lực hoàn toàn mà không gây đau Bệnh đột biến điểm DNA ti thể làm thay đổi protein thuộc chuỗi vận chuyển điện tử thuộc ti thể Mục tiêu: Phát điểm đột biến DNA ti thể thường gặp G11778A, T14484C, G3460A DNA ti thể người cách giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR Phương pháp: DNA bệnh nhân bị giảm thị lực hoàn toàn tách chiết từ mẫu máu tồn phần Sau đó, dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại vùng gen có chứa điểm đột biến thường gặp Sản phẩm khuếch đại sau giải trình tự trực tiếp kit BigDye®Terminator Phân tích kết giải trình tự cách so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn để phát điểm đột biến Kết quả: Từ tháng 08/2011 đến tháng 12/2012 thu thập 37 ca nghi ngờ bệnh LHON Trong phát 18 trường hợp có đột biến DNA ti thể, 14 trường hợp mang đột biến G11778A đột biến nặng thường gặp nhất, trường hợp lại mang đột biến T14484C Kết luận: Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tơi xây dựng thành cơng qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể bệnh LHON; đồng thời mở hướng nghiên cứu bệnh di truyền theo DNA ti thể Từ khóa: bệnh Lebel, đột biến DNA ti thể, LHON, PCR ABSTRACT DETECT MUTATION IN MITOCHONDRIAL DNA IN PATIENTS WITH LEBER’S HEREDITARY OPTIC NEUROPATHY BY GENE SEQUENCING Hoang Hieu Ngoc, Pham Hung Van, Huynh Viet Loc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No - 2014: 81 - 85 Background: Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is a mitochondrial inherited disorder that causes completely loss vision without pain in healthy adults This disease caused by point mutations in human mitochondrial DNA that lead to change protein in the electron transfer chain of the mitochondria Objective: Detecting highly prevalent mutation points such as G11778A, T14484C, G3460A in human mitochondrial DNA by direct sequencing PCR products Method: Patients’ DNA were extracted from whole blood samples and then perform PCR reactions of which primers designed to amplify DNA fragments that include mitochondrial point mutations Amplified products will be sequenced directly by using BigDye®Terminator kit Analyse results to detect point mutations of patients Result: From 08/2011 to 12/2012, we have 37 patients who loss vision without pain There are 18 cases which have point mutations; 14 cases have severe point mutation of G11778A and the last four cases have point * Bộ mơn Hố Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM , ** Công ty Nam Khoa Tác giả liên lạc: ThS BS Hoàng Hiếu Ngọc ĐT: 0988937406 Email: hoanghieungoc@yahoo.com Mắt 81 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 mutation of T14484C Conclusion: By using PCR and gene sequencing, we build up the examination to detect point mutations in LHON successfully Since, we open up the new trend of research mitochondrial inherited disorders in Vietnam Keywords: Lebel, mutations in mitochondrial DNA, LHON, PCR chung cách xác nhanh chóng; từ ĐẶT VẤNĐỀ mở thêm hướng nghiên cứu Bệnh thần kinh thị giác di truyền LEBER bệnh di truyền Việt Nam xác định mặt lâm sàng teo thần ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU kinh thị giác gây thị lực trung tâm(7) Bệnh thường xuất nam độ tuổi 20 – Mẫu bệnh phẩm 40(7,8) xuất độ tuổi từ Mẫu máu tồn phần chống đơng đến 65(8,2) Triệu chứng bệnh thường gặp EDTA bệnh nhân nghi ngờ bệnh thị lực trung tâm cấp bán cấp LHON cần chẩn đốn phân biệt với người trẻ đơi triệu chứng thần kinh, bệnh gây xơ hóa võng mạc khác tim mạch xương kèm Nam giới Trích biệt DNA bạch cầu từ máu toàn phần mắc bệnh chiếm đến 80% trường hợp chống đông EDTA bệnh(2) Nguyên nhân gây bệnh xác định Chúng sử dụng tách chiết DNA đột biến DNA ti thể thuộc vùng kit thương mại QIAGEN DNA Blood Mini kit gen ND (mitochondrial encoded NADH Phương pháp tách chiết DNA thực dehydrogenase genes) mtND1, mtND2, theo hướng dẫn nhà sản xuất Lấy 200 µl mtND3, mtND4, mtND4L, mtND5, mtND6 máu toàn phần cho vào tube Eppendorf, lần gây thay đổi protein thuộc phức hợp I lượt cho vào tube 20 µl proteinase K 200 µl chuỗi hơ hấp tế bào(9) Các nghiên cứu bệnh AL buffer Lắc trộn mẫu thật kỹ 15 giây, LHON giới cho thấy 95% ca bệnh sau đem ủ 560C 10 phút Thêm vào mang ba điểm đột biến 200 µl ethanol 100%, lắc trộn thật cho G11778A, T14484C, G3460A; tồn hỗn hợp vào cột silica cung cấp G11778A chiếm tỉ lệ cao bệnh nhân hãng Qiagen Ly tâm 8000 rpm phút, đổ mang đột biến có khả tiến triển bỏ dịch lọc tube thu thập, giữ lại cột Đặt cột bệnh nặng không hồi phục Cả điểm vào tube thu thập mới, rửa cột lần thứ đột biến có liên quan đến gen ND (4) cách cho 500 µl dung dịch rửa có bổ sung mã hóa protein cho phức hợp ethanol 100% (theo hướng dẫn nhà sản xuất) Nhiều nghiên cứu dịch tễ bệnh LHON vào cột ly tâm 8000 rpm phút, đổ bỏ giới cho thấy tỉ lệ bệnh LHON dịch rửa tube thu thập, giữ lại cột, đặt vào khác tùy dân số chẳng hạn Phần Lan tube thu thập Rửa cột lần thứ nhì với 1:50,000(2) Anh 1:25,000(4) Tại Việt 500 µl dung dịch rửa có bổ sung ethanol Nam chưa có nghiên cứu khảo sát tỉ lệ bệnh 100% (theo hướng dẫn nhà sản xuất) ly LHON dân số kỹ thuật sinh học tâm 14000 rpm phút Đổ bỏ dịch rửa phân tử chưa triển khai để nghiên cứu với tube thu thập Đặt cột vào tube thu bệnh Chính vậy, chúng tơi xây thập khác, quay ly tâm 14000 rpm phút dựng đề tài với mục đích phát đột biến để làm khô cột Cuối cùng, đặt cột vào tube DNA ti thể gây thị lực teo thần kinh thị Eppendorf tinh sạch, cho 200 µl dung dịch thoi đồng thời cung cấp cho bác sĩ lâm sàng Việt DNA, ủ nhiệt độ phòng phút, ly tâm Nam có cơng cụ chẩn đoán bệnh 14000 rpm phút Dịch cuối thu LHON nói riêng bệnh di truyền ti thể nói 82 Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 DNA bạch cầu hòa tan đệm thoi DNA, dùng để thực phản ứng PCR Khuếch đại đoạn gen DNA ti thể có chứa vị trí đột biến Chúng tơi sử dụng loại hóa chất sau: (1) PCR master mix 2X công ty Nam Khoa (được pha sẵn từ nguồn nguyên liệu mua từ hãng BioRad, Merck, Sigma, Proligo); (2) MgCl2 50mM BioRad sản xuất; (3) UNG Invitrogen; (4) dUTP Promega; (5) Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu vùng gen có chứa điểm đột biến ti thể 3460F/R phát đột biến G3460A (gen MT-ND1), 11778F/R phát đột biến G11778A (gen MT-ND4), 10663F/R phát đột biến T10663C (gen MT-ND4L), 14484F/R phát đột biến T14484C (gen MT-ND6), 9804F/R phát đột biến G9804A, 15257F/R phát đột biến G15257A Như vậy, với mẫu bệnh phẩm, thực phản ứng PCR Sản phẩm khuếch đại có kích thước sau: 417 bp, 297 bp, 410 bp, 210 bp, 470 bp, 250 bp Phương pháp khuếch đại DNA thực tube PCR 0.2 ml với thể tích dung dịch phản ứng 50 µl bao gồm 2.5U Taq Polymerase, 3,5mM MgCl2, 50 µM mồi xi, 50 µM mồi ngược, UNG 0.1U, dNTP 25mM, dUTP 20mM Phản ứng thực máy luân nhiệt MyCycler BioRad có buồng ủ nhiệt 96 giếng với chu kỳ nhiệt sau: chu kỳ 40oC 10 phút, chu kỳ 95oC phút, 40 chu kỳ 950C 30 giây – 55oC 30 giây – 72oC phút, chu kỳ 72oC 10 phút Sản phẩm PCR phát gel agarose 2% Giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại từ vùng gen ti thể Sau xác định có diện sản phẩm khuếch đại, thực tinh sản phẩm PCR cách sử dụng enzym tinh Exonuclease (IllustraTM) Alkaline Mắt Nghiên cứu Y học Phosphatase (IllustraTM) Sản phẩm PCR sau tinh lấy µl điện di gel agarose để kiểm tra diện băng DNA sau xác định hàm lượng DNA máy BioPhotometer hãng Eppendorf Sau đó, chúng tơi thực phản ứng giải trình tự cách sử dụng thuốc thử hãng ABI BigDye®Terminator v3.1 Cycler Sequencing Kit với mồi xuôi mồi ngược thiết kế Sản phẩm giải trình tự làm tủa tinh phương pháp tủa với ethanol Cuối thực điện di mao quản sản phẩm giải trình tự máy ABI3130XL Kết giải trình tự sau so sánh với trình tự DNA chuẩn ti thể công bố ngân hàng gen NBCI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) trang web www.mitomap.org từ phát điểm đột biến gen ti thể bệnh nhân phần mềm SeqScape hãng ABI KẾT QUẢ Trong thời gian từ tháng 08/2011 đến tháng 12/2012, thu thập 37 mẫu máu bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh LHON cần chẩn đoán phân biệt bệnh LHON với bệnh gây xơ hóa võng mạc khác Hình 1: Kết điện di gel agarose 2% sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen ti thể có chứa điểm đột biến tương ứng (A) đoạn khuếch đại chứa vị trí nucleotid 3460, (B) chứa vị trí 9804, (C) chứa vị trí 10663, (D) chứa vị trí 11778, (E) chứa vị trí 83 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 14484, (F) chứa vị trí 15257 (A) (B) Hình 2: Kết giải trình tự so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn người (A) mẫu giải trình tự có điểm đột biến T14484C (B) mẫu giải trình tự có điểm đột biến G11778A trình tự DNA chuẩn ti thể phần mềm Sau ly trích DNA bạch cầu từ SeqScape hãng ABI mẫu máu toàn phần, nồng độ DNA tách chiết đo nằm khoảng 30 – 60 ng/µl với độ tinh OD 260/280 từ 1.8 đến Nồng độ độ tinh đảm bảo cho phản ứng PCR thực tốt Những sản phẩm PCR sau tiến hành giải trình tự hệ thống ABI 3130XL Kết giải trình tự so sánh với 84 Khảo sát 37 mẫu máu bệnh nhân nghi ngờ bệnh LHON, chúng tơi nhận thấy có 18 trường hợp mang đột biến Trong đó, 14 mẫu mang đột biến G11778A trường hợp lại mang đột biến T14484C Chuyên Đề Mắt – Tai Mũi Họng – Răng Hàm Mặt Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ Số * 2014 KẾT LUẬN Kỹ thuật sinh học sinh tử nói chung kỹ thuật giải trình tự nói riêng trở thành cơng cụ hữu ích việc chẩn đốn xác định bệnh lý di truyền nói chung bệnh ty thể nói riêng, có bệnh di truyền thần kinh thị giác Leber Bằng việc ứng dụng kỹ thuật PCR kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, chúng tơi xây dựng thành cơng qui trình xét nghiệm chẩn đoán đột biến DNA ti thể bệnh LHON Điều giúp ích nhiều cho bác sĩ lâm sàng Việt Nam việc chẩn đốn bệnh LHON, đồng thời bệnh nhân khơng phải tốn cơng nước ngồi để làm xét nghiệm Ưu điểm kỹ thuật giải trình tự khảo sát tồn trình tự vùng gen mong muốn, từ so sánh với trình tự gen chuẩn để tìm điểm đột biến Đây lợi so với việc dùng men cắt giới hạn gây sai sót xuất đột biến nằm ngồi vị trí cần tìm làm thay đổi khả cắt không cắt men cắt vị trí đột biến Trong số 18 trường hợp phát đột biến (48,7%), 14 ca mang đột biến điểm G11778A điểm đột biến chiếm tỉ lệ cao bệnh LHON (77,78%) bệnh mắt tiến triển khả hồi phục thấp Kết nghiên cứu cho thấy tỉ lệ mang đột biến chiếm đa số phù hợp với y văn giới Chính thế, với việc xây dựng thành công kỹ thuật sinh học phân tử dùng chẩn đốn bệnh LHON, chúng tơi mong muốn mở nghiên cứu lớn nhằm tầm soát bệnh LHON dân số Việt Nam đồng thời Mắt Nghiên cứu Y học tư vấn di truyền cho người mang gen bệnh để định hướng nghề nghiệp chế độ ăn uống nhằm hạn chế phát triển bệnh tương lai TÀI LIỆU THAMKHẢO 10 Hsu TK, Wang AG, Yen MY, Liu JH (2013) “Leber's hereditary optic neuropathy masquerading as optic neuritis with spontaneous visual recovery” Clin Exp Optom doi: 10.1111/cxo.12100 Huoponen K (2001) “Leber hereditary optic neuropathy: clinical and molecular genetic findings” Neurogenetics 3: 119 – 125 Istikharah R, et al (2013).”Identification of the variants in PARL, the nuclear modifier gene, responsible for the expression of LHON patients in Thailand” Exp Eye Res 116: 55-57 Johns DR et al (1993) “Pitfalls in the molecular genetic diagnosis of Leber’s hereditary optic neuropathy Am” J Hum Genet, 53: 916 – 920 Mackey DA, Oostra RJ, Rosenberg T, et al (1996) “Primary pathogenic mtDNA mutations in multigeneration pedigrees with Leber hereditary optic neuropathy” Am J Hum Genet; 59:481 – 485 Man PY, Turnbull DM, Chinnery PF (2002) “Leber hereditary optic neuropathy” J Med Genet; 39:162 – 169 Oostra RJ, et al (1993) “Mitochondrial DNA analysis as a diagnostic tool in singleton cases of Leber’s hereditary optic neuropathy” Ophthalmic Paediatrics and Genetic, Vol 14, No3, pp 109 – 115 Oostra RJ, et al (1994) “Leber’s hereditary optic neuropathy: correlations between mitochondrial genotype and visual outcome” J Med Genet; 31: 280 – 286 Spruijt L (2008) Leber’s hereditary optic neuropathy – an interaction between two genomes Maastricht University, Netherlands Ziccardi L, Sadun F, et al (2013) “Retinal function and neural conduction along the visual pathways in affected and unaffected carriers with Leber's hereditary optic neuropathy” Invest Ophthalmol Vis Sci.2013 Ngày nhận báo:01/11/2013 Ngày phản biện nhận xét báo:26/11/2013 Ngày báo đăng: 05/01/2014 85 ... Hình 2: Kết giải trình tự so sánh với trình tự DNA ti thể chuẩn người (A) mẫu giải trình tự có điểm đột biến T14484C (B) mẫu giải trình tự có điểm đột biến G11778A trình tự DNA chuẩn ti thể phần... chung kỹ thuật giải trình tự nói riêng trở thành cơng cụ hữu ích việc chẩn đốn xác định bệnh lý di truyền nói chung bệnh ty thể nói riêng, có bệnh di truyền thần kinh thị giác Leber Bằng việc... Sản phẩm giải trình tự làm tủa tinh phương pháp tủa với ethanol Cuối thực điện di mao quản sản phẩm giải trình tự máy ABI3130XL Kết giải trình tự sau so sánh với trình tự DNA chuẩn ti thể công