Định genotype và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene rt của HBV Phạm Hùng Vân* (1) , Nguyễn Thị Minh Thư (2) , Võ Đức Xuyên An (2) , Lê Thị Phi Yến (2) , Đỗ Thị Thanh Thủy (1) Tóm tắt Đặt vấn đề: Thất bại trong điều trị nhiễm HBV bằng lamivudine là do virus có đột biến gần và/hay ngay tại YMDD chính là vị trí tác động thuốc trên gene polymerase của HBV. Có 4 đột biến giúp HBV kháng lamuvidine đã được chứng minh; đó là rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng kỹ thuật giải trình tự để định genotype HBV và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV Phương pháp nghiên cứu: Các tác giả đã thiết kế được kỹ thuật PCR nhân bản một đọan DNA của gen rt và giải trình tự đọan DNA này nhờ đó phát hiện được các đột biến trên. Ngòai ra, các tác giả cũng đã xây dựng được một thư viện HBV-DNA để xác định được genotype của HBV khi truy cập đọan trình tự đã giải trên thư viện này. Kết quả nghiên cứu: Áp dụng vào chẩn đóan, trong thời gian từ 10/7/2006 đến 7/10/2006, các tác giả đã giải được trình tự 87mẫu huyết thanh lấy từ bệnh nhân nhiễm HBV đáp ứng kém với điều trị lamivudine, kết quả cho thấy 57 trường hợp thuộc genotype B, 30 trường hợp thuộc genotype C. Có 54% được ghi nhận có đột biến tại vị trí 204 và/hoặc 180 là hai đột biến quan trọng nhất được ghi nhận là giúp HBV kháng lamivudine. Xét về tần số các kiểu gen đột biến; 2.3% (2/87) mang một kiểu gen đột biến với 1.1% (1/87) rtM204I, 1.1% rtM204Ih; 31% (27/87) mang hai kiểu gene đột biến với 4.6% (4/87) rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) rtL180Mh- rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và 9.2% rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% (18/87) mang ba kiểu gene đột biến với 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% (11/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, 4.6% (4/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. Chúng tôi không ghi nhận có đột biến rtV207I. Có 40 trường hợp không ghi nhận có đột biến nào, với 23 thuộc genotype B và 17 thuộc genotype C. Kết luận: Các kết quả nghiên cứu cho phép các tác giả nhận định là hiện nay tình trạng HBV kháng lamivudine tại Việt Nam có lẽ khá cao do virus tự nhiên kháng thuốc trong quá trình điều trị và cũng có thể do bệnh nhân không tuân thủ quá trình điều trị bằng lamivudine do bác sĩ đưa ra. Nhưng dù thế nào đi nữa thì với tình trạng này, các nhà điều trị phải nghĩ đến phương án thay thế lamivudine bằng thuốc kháng virus khác trong điều trị bệnh nhân HBV. Abstract Sequencing the rt gene of HBV for genotyping and detecting YMDD mutations that help HBV resistant to lamivudine. Background: Lamivudine failed in the treatment of HBV infection was caused by the mutations that happened in or near the YMDD of the rt region of polymerase gene. Four mutations related to lamivudine resistance were demonstrated: rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, and rtV207I. Objectives: Set up the sequencing method for genotyping of HBV and detecting YMDD mutations resistant to lamuvidine. Methods: The authors have developed the PCR that can amplify one fragment of DNA of the rt gene and then sequence this PCR product to detect these mutation thank to the aligment to the referent sequence collected from the wild type in the gene bank. Besides the mutation detection, the authors have constructed the HBV genotype library that can help the user to detect the genotype of the HBV by submitted the collected sequence to this library. Results: Apply on the clinical sera collected from HBV infected patients who were poorly responded to lamivudine treatment, from 10 of July 2006 to 07 October 2006, the authors sequenced 87 samples and the received results reported that 57 were belong to genotype B and 30 genotype C. Fouty-seven HBV (54%) with mutations were reported at the 180 and/or 204 position. Analyze the prevalene of the mutation patterns, the results reported: 2.3% carried one mutation with 1.1% (1/87) rtM204I, and 1.1% rtM204Ih; 31% carried two mutations with 4.6% (4/87) rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) rtL180Mh-rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và 9.2% rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% carried three mutations with 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% rtV173Lh-rtL180M- rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I, and 4.6% rtV173Lh-rtL180M-rtM204Ih. No rtV207I was reported. Forty cases were reported without any mutations with 23 were belong to genotype B and 17 were belong to genotype C. Conclusions: From these results, the authors can alarm the ratio of lamivudine resistance among HBV in Vietnam, and this high ratio may be came from the selectivity effect of the lamivudine treatment that occurs naturally or because of the not-compliance of the treatment from the patients. However, with this situation, the physicians should think to another antiviral drug to replace lamivudine for the treatment of patients with HBV infection. Đặt vấn đề 1* Tác giả chính, () Đại Học Y Dược, (2) Công ty Nam Khoa 1 Trên bản đồ dịch tễ của tổ chức y tế thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam manh kháng nguyên HBsAg (chứng tó nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới [1] . Nhận định này cũng được một số công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngòai nước xác nhận [2,3,4] . Tuy rằng không phải tất cả các trường hợp nhiễm HBV đều cần phải được đặt ra vấn đề phải điều trị vì đa số bệnh nhân đều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của virus. Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải được điều trị đặc hiệu bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mạn tính và lượng virus tăng cao. Từ những năm đầu của thập niên 2000, các nhà lâm sàng của chúng ta đã bắt đầu chỉ định lamivudine điều trị trên các bệnh nhân bị viêm gan B mạn tính, và cũng như trên thế giới liệu pháp điều trị kéo dài cũng đã dẫn đến tình trạng kháng lamivudine. Công trình nghiên cứu này của chúng tôi nhằm mục đích dùng kỹ thuật giải trình tự vùng rt của HBV để định genotype của HBV đồng thời tìm hiểu các đột biến đã được thế giới ghi nhận trên gene polymerase của virus có hiện diện trên HBV mà chúng tôi phát hiện trên bệnh nhân nhiễm HBV và đáp ứng lâm sàng kém với điều trị lamivudine hay không? Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Mẫu huyết thanh thử nghiệm: Đây là nghiên cứu được thiết kế theo mô hình tiền cứu cắt ngang với các mẫu huyết thanh được các bác sĩ lấy từ các bệnh nhân dương tính HBV-DNA và trên lâm sàng không đáp ứng hay đáp ứng kém với điều trị lamivudine. Các mẫu này được gửi từ nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng tại thành phố Hồ Chí Minh đến phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa. Trích biệt HBV-DNA từ các mẫu huyết thanh: Các mẫu huyết thanh thử nghiệm ngay sau khi gửi đến phòng thí nghiệm được đưa vào trích biệt DNA theo phương pháp Boom bằng bộ thuốc thử DNAPREP-BOOM do công ty Nam Khoa sản xuất (số đăng kí chất lượng: 03200/2001/CBTC- TĐC). Phương pháp trích biệt được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Phát hiện và định lượng HBV-DNA: 10ul trích biệt DNA được cho vào 40ul HBV SYBR PCR mix (PCR mix để định lượng HBV-DNA bằng kỹ thuật real-time PCR với SYBR Green I do công ty Nam Khoa sản xuất) và chạy chương trình real- time PCR dùng SYBR như là hướng dẫn của nhà sản xuất để phát hiện và định lượng HBV-DNA có trong huyết thanh bệnh nhân. Giải trình tự định genotype HBV và phát hiện các đột biến liên quan đến kháng lamivudine: Đồng thời 10ul trích biệt DNA cũng được cho vào 40ul PCR mix để khuếch đại một đọan DNA dài 564bp trong phần rt của gene polymerase của HBV. PCR mix này được pha từ PCR master mix do công ty Nam Khoa sản xuất (từ các hóa chất của Biorad, Roche, và Promega) có thêm cặp mồi xuôi 264F và của mồi ngược 827R (trình tự các mồi được giữ trong tài liệu nghiên cứu cấp I tại phòng RD của công ty Nam Khoa) được thiết kế bằng phần mềm Primer premier đặc hiệu đọan DNA nêu trên. Mồi được cho vào PCR mix với hàm lượng 15pm cho một PCR mix. Thực hiện PCR theo chu kỳ nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút; sau đó là 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút; và cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC trong 7 phút. Sau khi hòan tất PCR, phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng điện di trong thạch 1.5%. Sau khi điện di và xác định có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu dài 567bp, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng với bộ thử nghiệm tinh sạch sản phẩm PCR (PCR clean- up kit) do Promega sản xuất (Cat. #A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được định lượng nồng độ DNA bằng máy Genquant của Pharmacia. Sau đó, thực hiện phản ứng giải trình tự sản phẩm PCR đã tinh sạch và xác định nồng độ ở trên với PCR sequencing mix của Becman (DTCS: Dye Terminator Cycle Sequencing) với primer 827R. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol. Cuối cùng thực hiện giải trình tự trên máy sequencer CEQ8000 của Becman Coulter. Kết quả giải trình tự được phân tích trên chức năng analysis của CEQ8000 có chọn thêm thông số heterozygote. Sau đó dùng chức năng investigator của CEQ8000 để thực hiện đối chiếu so sánh trình tự giải được với trình tự tham chiếu được thành lập từ trình tự của gene polymerase HBV của các dòng không đột biến để phát hiện các vị trí đột biến, đặc biệt quan tâm các vị trí đã được thừa nhận là có đột biến liên quan đến kháng lamivudine: rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. Kết quả phân tích đột biến được ghi nhân là đột biến hòan tòan khi acid amin tại một trong các vị trí trên bị thay thế bằng acid amin đột biến, được ghi nhận là đột biến một phần (heterozygote) khi tại một trong các vị trí trên tồn tại cả hai acid amin vừa của dòng hoang dại vừa của dòng đột biến. Để định genotype của HBV, đăng nhập trình tự đã giải được lên local blast của phần mềm miễn phí Bio-edit trong đó chúng tôi có cài một thư viện genotype của HBV, sau đó truy cập dể so sánh trình tự đã giải được với trình tự trong thư viện, nhờ vậy xác định được genotype HBV của mẫu thử. 2 Phát hiện đột biến rtL180M, rtM204I/V bằng phương pháp PCR-RFLP: Một số mẫu có kết quả ghi nhận là có đột biến một phần ở vị trí 180 và/hay 204 được thực hiện thêm kỹ thuật PCR- RFLP để xác định lại xem kết quả có trùng hợp được với kết quả ghi nhận từ phương pháp giải trình tự hay không. Trong phương pháp PCR- RFLP này, để phát hiện đột biến 180, cho 10ul trích biệt DNA của huyết thanh vào 40ul PCR mix A chứa mồi xuôi 180F và mồi ngược 180/204R; để phát hiện đột biến 204, cho 10ul trích biệt DNA của huyết thanh vào PCR mix B chứa mồi xuôi 204F và mồi ngược 180/204R (trình tự các mồi được giữ trong tài liệu nghiên cứu cấp I tại phòng RD của công ty Nam Khoa). Tiến hành PCR theo chu kỳ nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút; sau đó là 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 30 giây. Sản phẩm PCR mix A được cắt bằng men cắt NlaIII (Bio New England), sản phẩm PCR mix B được cắt bằng cả hai men cắt NdeI (Bio New England) và NlaIII sau đó được điện di trên agarose 2.5%. Nhờ mồi 180F được thiết kế có đầu 3’ nằm đúng vị trí 180 mà khi có đột biến rtL180M xãy ra thì sẽ hình thành một trình tự nhận biết bởi NlaIII do vậy mà sản phẩm PCR mix A sẽ bị cắt ngắn di một đọan 24bp so với trường hợp không đột biến. Trong phát hiện đột biến rtM204V và rtM204I, nhờ mồi xuôi 204F được thiết kế có đầu 3’ nằm đúng vị trí 204 mà khi không có đột biến xãy ra thì sẽ tạo ra một trình tự bị nhận biết bởi NdeI mà không bị nhận biết bởi NlaIII do vậy sản phẩm PCR mix B sẽ bị NdeI cắt ngắn đi 24bp trong khi đó không bị NlaIII cắt; khi có đột biến rtM204V thì sẽ tạo ra trình tự bị nhận biết bởi NlaIII mà không bị nhận biết bởi NdeI do vậy sản phẩm PCR mix B sẽ bị NlaIII cắt ngắn đi 24bp mà không bị NdeI cắt; và khi có đột biến rtM204I thì sẽ tạo ra trình tự không bị cả hai enzyme trên nận biết nên sản phẩm PCR mix B sẽ không bị cắt ngắn đi bởi hai enzyme này. Trong tất cả các phân tích trên, ghi nhận đột biến hòan tòan khi chỉ có kiểu hình đột biến, và đột biến không hòan tòan khi xuất hiện cả hai kiểu hình đột biến và không đột biến hiển thị trên gel. Kết quả Trong thời gian từ 10/7/2006 đến 7/10/2006, đã có 87 mẫu huyết thanh được chúng tôi thực hiện thử nghiệm định lượng HBV-DNA, định genotype và phát hiện các đột biến rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. Bảng 1 trình bày lượng HBV-DNA và genotype của HBV trong các mẫu huyết thanh thử nghiệm. Các đột biến tại các vị trí 173, 180, 204 và 207 được phân tích bằng chức năng investigator của phần mềm kèm theo máy CEQ8000. Trong chức năng này, chúng tôi so sánh trình tự giải được với trình tự tham chiếu do chúng tôi thành lập bằng cách thu thập các trình tự phần rt của gene polymerase của các chủng HBV không đột biến (wild type). Các ví dụ minh họa trong hình 1 cho thấy cách để chúng tôi kết luận như thế nào là có đột biến hòan tòan và như thế nào là có đột biến không hòan tòan tại các vị trí acid amin trên: (A) là đột biến rtM204V hòan tòan với ATG bị thay thế bằng GTG, trong khi đó (B) là đột biến rtM204Vh (không hòan tòan) vì chồng lên tín hiệu của base A của mã ATG là tín hiệu G do vậy máy vẫn ghi nhận là ATG nhưng thật ra có thêm mã đột biến GTG; (C) là đột biến rtL180M hòan tòan với TTG bị thay thế bằng ATG, trong khi đó (D) là đột biến rtL180M không hòan tòan vì bên dưới tín hiệu T của TTG, có tín hiệu A do vậy mà máy ghi nhận là TTG nhưng thật ra có thêm mã đột biến là ATG; (E) là đột biến rtV173L với GTG bị thay thế hầu như hòan tòan bởi CTG, trong khi đó (F) là đột biến rtV173L không hòan tòan do dưới tín hiện G của GTG là có tín hiệu C do vậy máy ghi nhận là GTG nhưng thật ra có thêm mã đột biến CTG nữa. Để có thể chắc chắn các phân tích dựa vào các tín hiệu giải trình tự nhờ đó phát hiện có các đột biến không hòan tòan tại hai vị trí 180 và 204 là chính xác, chúng tôi đã thực hiện kỹ thuật PCR- RFLP trên 20 mẫu mà khi phân tích kết quả giải trình tự có ghi nhận được đột biến không hòan tòan ở vị trí 180 và/hay 204. PCR-RFLP trên các mẫu này cho kết quả phát hiện đột biến không hòan tòan tại các vị trí này hòan tòan trùng khớp với kết quả giải trình tự. Hình 2 và hình 3 trình bày kết quả trên một số mẫu mà chúng tôi đã thực hiện PCR-RFLP. Trong 87 mẫu giải trình tự phân tích đột biến, 54% (47/87) được ghi nhận có đột biến 204 và/hoặc 180 là hai đột biến quan trọng nhất được ghi nhận là giúp HBV kháng lamivudine. Xét về tần số các kiểu gen đột biến; 2.3% (2/87) mang 3 Bảng 1: Kết quả định genotype và định lượng HBV trong huyết thanh bệnh nhân Quantitation of HBV- DNA (copies/ml) Genotype B Genotype C <10 3* 2 1 10 3 - <10 4 7 5 10 4 - <10 5 13 5 10 5 - <10 6 9 5 10 6 - <10 7 6 6 10 7 - <10 8 15 7 10 8 - <10 9** 5 1 57 30 *Số lượng thấp nhất là 429 copies/ml. **Số lượng cao nhất là 822,401,747 copies/ml một kiểu gen đột biến với 1.1% (1/87) rtM204I, 1.1% rtM204Ih; 31% (27/87) mang hai kiểu gene đột biến với 4.6% (4/87) rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) rtL180Mh- rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh- M204I, và 9.2% rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% (18/87) mang ba kiểu gene đột biến với 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh- rtL180M-rtM204I, 12.6% (11/87) rtV173Lh- rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh- rtM204I, 4.6% (4/87) rtV173Lh-rtL180M- rtM204Ih. Chúng tôi không ghi nhận có đột biến rtV207I. Có 40 trường hợp không ghi nhận có đột biến nào, trong đó có 23 trường hợp được xác định là genotype B và 17 được xác định là genotype C với số lượng được định lượng thấp nhất là 748 copies/ml và cao nhất là 215.451.964 copies/ml. Bảng 2 trình bày chi tiết các kiểu gene đột biến được phát hiện trong 47 mẫu trong mối liên quan với genotype và số lượng HBV có trong mẫu thử. (A) (B) (C) (D) (E) (F) 4 Hình 1: Hình ảnh tín hiệu các base được máy hiển thị khi phân tích kết quả giải trình tự và dựa vào có hay không có tín hiệu base chèn vào mà có thể ghi nhận đột biến hòan tòan hay đột biến không hòan tòan. (A) đột biến rtM204V hòan tòan, (B) đột biến rtM204V không hòan tòan, (C) đột biến rtL180M hòan tòan, (D) đột biến rtL180M không hòan tòan, (E) đột biến rtV173L gần như hòan tòan, (F) đột biến rtV173L không hòan tòan Sản phẩm PCR mix B Sản phẩm PCR mix B Hình 2: Phân tích đột biến ở vị trí 204; Sản phẩm PCR của các mẫu 5718, 5648 không bị NlaIII cắt, và vừa bị cắt vừa không bị cắt bởi NdeI, do vậy đây là đột biến rtM204Ih (không hòan tòan). Các mẫu 5646, 5650 không có đột biến vì sản phẩm PCR không bị NlaIII cắt nhưng bị NdeI cắt. Các mẫu 5647 và 5570 không bị cả hai enzyme này cắt nên đây là đột biến rtM204I hòan tòan. Mẫu 5649 có đột biến rtM204V hòan tòan vì sản phẩm PCR bị NlaIII cắt mà không bị NdeI cắt. Mẫu 5525 có sản phẩm PCR vừa bị cắt vừa không bị cắt bởi hai enzyme này nên khả năng cao nhất là có đột biến rtM204Vh (không hòan tòan) Biện luận Mặc dù đã có vaccin ngừa an tòan và hiệu quả nhiễm HBV, nhưng viêm gan mạn tính do HBV vẫn còn là một trong 10 nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới [5] . Từ năm 1998, lamivudine đã được công nhận là thuốc uống để điều trị HBV [6] . Nhiều dữ liệu lâm sàng đã cho thấy lamivudine đã làm giảm ngọan mục lượng virus và cải thiện đáng kể sự tổn hại mô gan do virus [7,8] . Tuy nhiên, cho đến ngày nay vẫn chưa có một nhà lâm sàng nào có thể khẳng định cho đến khi nào thì có thể ngưng điều trị lamivudine mà không bị tái phát dù trước đây người ta cho rằng chỉ cần nghĩ đến phương án điều trị lamivudine lâu dài khi sau 52 tuần điều trị lamivudine mà bệnh nhân vẫn không có chuyển đổi huyết thanh (HBeAg trở nên 5 Hình 3: Phân tích đột biến ở vị trí 180; Sản phẩm PCR của các mẫu 5718, 5646, 5647, 5648 và 5650 không bị NlaIII cắt, do vậy không có đột biến ở vị trí 180; sản phẩm PCR của mẫu 5649 bị NlaIII cắt, do vậy có đột biến rtL180M; hai mẫu 5525 và 5570 (không có trên hình này vì gel không còn giếng) có các sản phẩm PCR vừa bị NlaIII cắt vừa không bị cắt, do vậy có thể kết luận có đột biến rtL180Mh (không hòan tòan). Bảng 2: Kết quả các kiểu gene đột biến trong mối liên quan với genotype và số lượng HBV trong các mẫu huyết thanh bệnh nhân 2A: Mang một kiểu gene đột biến 1 đột biến M204Ih M204I Genotype B C B C Tổng <10 3 10 3 - <10 4 1 1 10 4 - <10 5 10 5 - <10 6 10 6 - <10 7 10 7 - <10 8 1 1 10 8 - <10 9 0 1 1 0 2 2B: Mang hai kiểu gene đột biến 2 đột biến V173Lh M204Ih V173Lh M204I L180Mh M204Ih L180Mh M204Vh L180Mh M204I L180M M204I L180M M204V Genotype B C B C B C B C B C B C B C Tổng <10 3 1 1 2 10 3 - <10 4 1 1 1 3 10 4 - <10 5 1 1 1 1 4 10 5 - <10 6 2 1 3 10 6 - <10 7 1 1 1 1 1 1 6 10 7 - <10 8 2 1 1 1 1 1 7 10 8 - <10 9 2 2 7 1 1 2 1 0 2 0 6 2 0 1 3 1 27 2C: Mang ba kiểu gene đột biến 3 đột biến V173Lh L180Mh M204Ih V173Lh L180Mh M204I V173Lh L180M M204V V173Lh L180M M204I V173L L180M M204V Genotype B C B C B C B C B C Tổng <10 3 10 3 - <10 4 1 1 2 10 4 - <10 5 3 3 10 5 - <10 6 1 1 10 6 - <10 7 1 1 2 10 7 - <10 8 1 6 2 9 10 8 - <10 9 1 1 3 1 1 0 8 3 1 0 0 1 18 âm tính), và tỷ lệ này là khỏang 17-33% [9,10] . Điều trị lamivudine lâu dài thì sẽ dẫn đến đề kháng lamivudine và y học đã ghi nhận tỷ lệ kháng này là khỏang 17-46% sau một năm điều trị, và 67- 46% sau 3-4 năm điều trị [8,10] . HBV đề kháng được với lamivudine là do đột biến thay thế acid amin xãy ra trên domain B (L180M) và trên motif YMDD (M204V/I) của domain C của men polymerase của virus [11-18] . Đột biến M204V/I là đột biến ngay trên vị trí tác động của lamivudine đối với men polymerase do vây đã làm cho HBV trở nên kháng Lamivudine, tuy nhiên đột biến này lại làm cho men polymerase họat động trở nên kém hiệu quả hơn, do vậy làm giảm khả năng nhân bản của HBV trên bệnh nhân cũng như trên thí nghiệm [19-21] . Cấu trúc không gian của men polymerase của HBV cho thấy vị trí 180 trên domain B khá gần với motif YMDD, do vậy đột biến L180M một khi xãy ra thì sẽ làm cho cấu hình của YMDD có thể phục hồi được, do vậy giúp cho virus đã có đột biến M204V/I phục hồi được phần nào chức năng sao chép nhưng vẫn giữ nguyên hay thậm chí tăng khả năng kháng lamivudine [21] . Do vậy các nhà nghiên cứu thường thấy đột biến L180M hay đi kèm với M204V và cũng đôi khi đi kèm M204I [11-14,15] . Đột biến V173L tự thân nó không gây nên sự đề kháng lamivudine, nhưng do vị trí của acid amin này cũng khá gần motif YMDD nên sự thay thế Valine bằng Leucine trên acid amin 173 sẽ làm cho men polymerase của virus trở nên nhạy hơn trong họat động nhân bản do vậy đã làm cho virus đã bị đột biến M204V/I và L180M phục hồi gần như hòan tòan khả năng nhân bản bình thường [16] . Trong thí nghiệm, các nhà khoa học đã chứng minh là chỉ cần cho thêm đột biến V173L là HBV hoang dại sẽ tăng khả năng nhân bản lên hơn 40% so với không có đột biến [22] . Thông thường, trên một bệnh nhân được điều trị lamivudine lâu dài thì đột biến xãy ra trước hết là M204I hay M204V, sau đó HBV sẽ xuất hiện thêm đột biến L108M. Ít khi nào chúng ta gặp đột biến L180M đơn thuần. Sau đó để có thể bù đắp được tình trạng suy giảm khả năng nhân bản do các đột biến M204I/V mà đột biến L180M không thể phục hồi được, HBV sẽ xãy ra thêm đột biến V173L để giúp virus phục hồi lại khả năng đột biến. Do vậy đột biến V173L thường chỉ xãy trên hai kiểu gen đột biến, đó là L180M-M204I hay L180M- M204V. Kết quả của công trình nghiên cứu này của chúng tôi cho thấy các kiểu đột biến hòan tòan phù hợp với các kiểu đột biến được thế giới ghi nhận, chỉ có một khác biệt nhỏ là có 12.6% (11/87) được ghi nhận có đột biến V173L không hòan tòan đi kèm đột biến M204Ih (9.2%) và M204I (3.4%). Kết luận Xác định đột biến trên gen polymerase của HBV giúp virus kháng được lamivudine là một nhu cầu rất cần thiết hiện nay đối với lâm sàng để có thể xem xét việc ngưng điều trị lamivudine hay sử dụng các phương thức kết hợp điều trị khác. Hiện nay phương pháp giải trình tự của Trugene là thường được các phòng thí nghiệm lâm sàng sử dụng trong chẩn đóan để xác định genotype HBV đồng thời phát hiện các đột biến giúp virus kháng được lamivudine [23] . Tuy nhiên, các phòng thí nghiệm có trang bị máy giải trình tự không phải của hệ thống Trugene vẫn có thể thực hiện được yêu cầu này của lâm sàng. Hy vọng rằng các thông tin mà chúng tôi có được qua kết quả công trình nghiên cứu này sẽ có thể có một số đóng góp hữu dụng cho các nhà lâm sàng đang ngiên cứu và điều trị bệnh viêm gan mạn tính do HBV, và đồng thời cho các nhà cận lâm sàng, đặc biệt cho các phòng thí nghiệm có trang bị máy giải trình tự để có thể ứng dụng được. Tài liệu tham khảo 1. WHO’ map of HBV infection prevalence. 2001 2. Trinh TT, Le HD. 2004. Int Conf AIDS Jul 11-16; 15: (abstract no. C12748) 3. Tran Thien-Tuan Huy et al. 2003. High Prevalence of Hepatitis B Virus Pre-S Mutant in Countries Where It Is Endemic and Its Relationship with Genotype and Chronicity. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. 41(12): 5449–5455 4. David b. Hipgrave et al. 2003. Hepatitis B Infection In Rural Vietnam and The Implications For a National Program of Infant Immunization. Am. J. Trop. Med. Hyg., 69(3): 288–294 5. World Health Organization warns of growing “crisis of su"ering.” 6. 2. Gordon, D., and Walsh, J.H. 1998. Hepatitis drugs win approval. Gastroenterology. 116:235–236. 7. Honkoop, P., de Man, R.A., Zondervan, P.E., and Schalm, S.W. 1997. Histological improvement in patients with chronic hepatitis B virus infection treated with lamivudine. Liver. 17:103–106. 8. Lai, C.L., et al. 1998. A one-year trial of lamivudine for chronic hepatitis B. Asia Hepatitis Lamivudine Study Group. N. Engl. J. Med. 339:61–68. 5. Omata, M. 1998. Treatment of chronic hepatitis B infection. N. Engl. J. Med. 339:114–115. 9. Omata, M. 1998. Treatment of chronic hepatitis B infection. N. Engl. J. Med. 339:114–115. 10. Lai, C.L. 1999. Antiviral therapy for hepatitis B and C in Asians. J. Gastroenterol. Hepatol. 14(Suppl.):S19–S21. 11. Bartholomew, M.M., et al. 1997. Hepatitis-B-virus resistance to lamivudine given for recurrent infection after orthotopic liver transplantation. Lancet. 349:20–22. 12. Ling, R., et al. 1996. Selection of mutations in the hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant recipients with lamivudine. Hepatology. 24:711–713. 13. Tipples, G.A., et al. 1996. Mutation in HBV RNA- dependent DNA polymerase confers resistance to lamivudine in vivo. Hepatology. 24:714–717. 6 14. Allen, M.I., et al. 1998. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine. Lamivudine Clinical Investigation Group. Hepatology. 27:1670–1677. 15. Chayama, K., et al. 1998. Emergence and takeover of YMDD motif mutant hepatitis B virus during long-term lamivudine therapy and retakeover by wild type after cessation of therapy. Hepatology. 27:1711–1716. 16. Yeh, C.T., Chien, R.N., Chu, C.M., and Liaw, Y.F. 2000. Clearance of the original hepatitis B virus YMDD-motif mutants with emergence of distinct lamivudine-resistant mutants during prolonged lamivudine therapy. Hepatology. 31:1318–1326. 17. Benhamou, Y., et al. 1999. Long-term incidence of hepatitis B virus resistance to lamivudine in human immunodeficiency virus-infected patients. Hepatology. 30:1302–1306. 18. Bartholomeusz, A., Schinazi, R.F., and Locarnini, S.A. 1998. Significance of mutations in the hepatitis B virus polymerase selected by nucleoside analogues and implications for controlling chronic disease. Viral Hepatitis Reviews. 4:167–187. 19. Ono-Nita, S.K., et al. 1999. YMDD motif in hepatitis B virus DNA polymerase influences on replication and lamivudine resistance: a study by in vitro full-length viral DNA transfection. Hepatology. 29:939–945. 20. Melegari, M., Scaglioni, P.P., and Wands, J.R. 1998. Hepatitis B virus mutants associated with 3TC and famciclovir administration are replication defective. Hepatology. 27:628–633. 21. Suzane Kioko Ono et al. 2001. The polymerase L528M mutation cooperates with nucleotide binding-site mutations, increasing hepatitis B virus replication and drug resistance. J. Clin. Invest. 107 (4):449–455 22. William E. Delaney IV et al. 2003. The Hepatitis B Virus Polymerase Mutation rtV173L Is Selected during Lamivudine Therapy and Enhances Viral Replication In Vitro Journal Of Virology, 77(21): 11833–11841 23. Harald H. Kessler et al. 2003. Detection of Mutations in the Hepatitis B Virus Polymerase Gene. Clinical Chemistry. 49(6): 989-992 7 . Định genotype và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene rt của HBV Phạm Hùng Vân* (1) , Nguyễn Thị Minh. được chứng minh; đó là rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng kỹ thuật giải trình tự để định genotype HBV và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV Phương pháp. chúng tôi thực hiện thử nghiệm định lượng HBV- DNA, định genotype và phát hiện các đột biến rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I. Bảng 1 trình bày lượng HBV- DNA và genotype của HBV trong các