Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC pdf

Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC Phạm Hùng Vân* (1) , Bành Vũ Điền (2) , Võ Đức Xuyên An (3) , Nguyễn Thị Minh Thư (3) , Lê Thị Phi Yến (3) , Đỗ Thị Thanh Thủy (1) , Hòang Hiếu Ngọc (1) Tóm tắt Đặt vấn đề: Để có thể tiên đóan được hiệu quả điều trị đặc hiệu và quyết định được thời gian điều trị đặc hiệu cho bệnh nhân viêm gan mạn tính do nhiễm HCV, các nhà điều trị cần phải có thông tin về kiểu gen của HCV trên bệnh nhân. Trước đây, xét nghiệm xác định kiểu gen HCV phải được gửi sang Singapore để thực hiện với giá thành khá cao: trên 180USD/mẫu thử. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của thử ngiệm RT real-time PCR sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của virus để định genotype HCV. Phương pháp nghiên cứu: Từ đầu năm 2006, các tác giả đã xây dựng được phương pháp xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của HCV rồi sau đó so sánh với các trình tự của trong một thư viện các kiểu gen HCV để xác định được kiểu gene của HCV. Kết quả nghiên cứu: Từ tháng cuối 5/2006 đến cuối tháng 9/2006, các tác giả đã áp dụng phương pháp này để xác định kiểu gen HCV cho 234 trường hợp co kết quả thử nghiệm RT real-time PCR dương tính HCV-RNA, kết quả ghi nhận được cho thấy có đến 55% các mẫu là thuộc genotype 1b, 20% thuộc genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, và <1% là thuộc genotype 2b. Tuy kết quả cho thấy đa số kiểu gen của HCV tập trung ở genotype 1b và 6a, nhưng các tác giả cho là kết quả này chưa thể phản ảnh thật sự phân bố tỷ lệ kiểu gen HCV trên các người nhiễm HCV tại Việt Nam vì các mẫu thử được nghiên cứu có thể đa số được lấy từ các bệnh nhân đang trong quá trình điều trị đặc hiệu chứ không phải trước khi bắt đầu điều trị, và trong số các bệnh nhân này có thể có nhiều bệnh nhân đã bị thất bại điều trị đặc hiệu. Kết luận: Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC là tiếp cận thích hợp nhất có thể áp dụng trong chẩn đóan lâm sàng nhiễm HCV trước khi bác sĩ quyết định cho chỉ định điều trị đặc hiệu. Abstract Genotyping of HCV by direct sequencing the PCR product coming from the RT realtime PCR using primers and taqman probe specific to the 5’NC of the virus. Background: In order to predict the effect of the specific treatment as well as to decide the duration of the specific treatment given on the chronic hepatitis patients causing by HCV infection, the physicians need to have in hand the information about the genotype of HCV in the patients’ sera. In the past, such required tests had be done in Singapore with the high cost: more than 180USD/test. Objectives: Set-up the method to do the direct sequencing of the PCR product coming from the RT realtime PCR using primers and taqman probe specific to the 5’NC of the virus for genotyping of HCV Methods: Started from 2006, the authors have developed the direct sequencing of the PCR product coming from the RT real-time PCR using primer and taqman probe targetted the 5’NC of the viral genome and align the detected sequence to the library of HCV genotype sequences to get the result of HCV genotyping. Results: From end of 5/2006 to end of 9/2006, the authors applied this approach to do the genotype of 234 sera samples that were HCV-RNA positive detected by RT real-time PCR, and the received results revealed that 55% were belong to genotype 1b, 20% to genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, and <1% were belong to genotype 2b. Although the received results have demonstrated that the majority of the samples were belong to HCV genotype 1b and 6a, the authors have believed that this does not reflect the real distribution of the incidence of the genotype of HCV among the HCV infected patients in Viet Nam since the studied samples may be mostly collected from treated patients, not from new patients, and among these treated patients there were many failure with the treatment. Conclusions: Genotyping HCV by direct sequencing the PCR products of the RT real-time PCR using primers and taqman probe specific to the 5’NC is the most appropriate approach that can be applied in clinical diagnosis of HCV infection prior the specific treatment prescription Đặt vấn đề Xác định genotype virus viêm gan C (HCV) là một chỉ định rất cần thiết trước khi bác sĩ điều trị tiến hành cho chỉ định điều trị đặc hiệu viêm gan C vì thời gian điều trị kéo dài bao lâu là tuỳ thuộc vào type virus viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm [1] . Hiện nay, trên thế giới có 2 phương pháp 1* Tác giả chính, () Đại Học Y Dược, (2) Bệnh Viện Chợ Rẫy, (3) Công ty Nam Khoa 1 xác định genotype viêm gan C dựa vào phân tích một vùng đặc trưng trên vùng 5’NC của bộ gen HCV đã được nhiều nhà nghiên cứu cũng như lâm sàng chấp nhận và được thực hiện tại các phòng thí nghiệm lâm sàng, đó là phương pháp lai trên vạch dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA) [2] và phương pháp giải trình tự trên máy Trugene [3] . Tuy nhiên vì hai phương pháp này có giá thành khá cao nên khó có thể được chỉ định rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ lưu hành HCV là khá cao trên thế giới (5-8% người bình thường có nhiễm HCV) [4,5] và dĩ nhiên đi kèm theo đó là số lượng bệnh nhân bị viêm gan mạn tính cần phải được điều trị và theo dõi điều trị khá cao do nhiễm HCV có thể dẫn đến một tỷ lệ khá cao bị xơ gan và ung thư gan (4%) [6] . Để có thể giúp các nhà lâm sàng có thể cho chỉ định xác định genotype HCV dễ dàng hơn, việc tìm kiếm một kỹ thuật xác định genotype HCV mà không phải sử dụng kỹ thuật giải trình tự của Trugene và kỹ thuật InoLIPA với giá thành thấp hơn mà vẫn đạt độ chính xác và nhạy cảm cao là một việc làm rất cần thiết và đây cũng mục tiêu chính của đề tài nghiên cứu này của chúng tôi. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Các mẫu huyết thanh được đưa vào nghiên cứu là các mẫu đã xác định và định lượng được HCV- RNA bằng kỹ thuật real-time PCR thực hiện tại phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa với kết quả [+]. Các mẫu này được nhiều phòng thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí nghiệm R&D của công ty với yêu cầu phát hiện và định lượng HCV-RNA. Để phát hiện và định lượng được HCV-RNA, phòng thí nghiệm sử dụng bộ thử nghiệm RT TQ real-time PCR (reverse transcriptase real-time PCR dùng taqman probe) do công ty Nam Khoa sản xuất. Bộ thử nghiệm này bao gồm một bộ RNAPREP để trích biệt RNA từ các mẫu huyết thanh theo phương pháp Chomzynski và Sacchi (số đăng kí chất lượng: 03200/2001/CBTC-TĐC), bộ cDNA synthesis hai bước để tổng hợp cDNA từ RNA với mồi ngẫu nhiên, và bộ TQ real-time PCR mix để phát hiện và định lượng HCV cDNA bằng phương pháp real-time PCR dùng taqman probe và mồi đặc hiệu một đọan đích 240-245bp nằm ở vùng 5’NC của bộ gen HCV (số đăng kí chất lượng: 03201/2001/CBTC-TĐC). Thử nghiệm real-time PCR được thực hiện trên máy IQ5 của Biorad. Phương pháp định lượng theo hướng dẫn của bộ thử nghiệm. Có thể tóm tắt như sau: là trước hết xây dựng đường chuẩn về mối liên hệ tuyến tính giữa các nồng độ ban đầu của HCV cDNA chuẩn (được pha từ mẫu HCV cDNA chuẩn được cung cấp từ Khoa Sinh, trường Royal Holloway, Đại Học Luân Đôn) với chu kỳ ngưỡng và sử dụng đường biểu diễn này để tính được nồng độ ban đầu của HCV cDNA có trong mẫu thử. Các mẫu sản phẩm real-time PCR cho kết quả real-time PCR [+] được làm tinh sạch để thu nhận sản phẩm PCR với bộ thử nghiệm tinh sạch sản phẩm PCR (PCR clean-up kit) do Promega sản xuất (Cat. #A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được điện di và định lượng nồng độ DNA bằng máy Gentquant của Pharmacia. Sau đó, thực hiện phản ứng giải trình tự sản phẩm PCR đã tinh sạch và xác định nồng độ ở trên với PCR sequencing mix của Becman (DTCS: Dye Terminator Cycle Sequencing) với primer một chiều đặc hiệu tương thích do phòng R&D của công ty Nam Khoa thiết kế. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và tinh sạch bằng phương pháp tủa với ethanol. Cuối cùng thực hiện giải trình tự trên máy sequencer CEQ8000 của Becman Coulter. Kết quả giải trình tự được phân tích trên phần mềm phân tích giải trình tự của CEQ8000. Cuối cùng, đăng nhập trình tự giải được lên NCBI blast qua internet để so sánh với gene bank và lên local blast của phân mềm miễn phí bio-edit để so sánh với thư viện HCV genotype mà chúng tôi tự tạo để có được kết quả genotype. Kết quả Trong thời gian từ 24/05/06 đến 30/09/06, có tất cả 234 mẫu huyết thanh dương tính HCV-RNA qua xét nghiệm RT realtime PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu 5’NC được thực hiện với qui trình trên. Tất cả 234 mẫu HCV-RNA dương tính này cũng đã được chúng tôi đồng thời xác định genotype của HCV. Kết quả định lượng tương ứng với kết quả xác định genotype được trình bày trong bảng 1. Phân tích các kết quả trình bày trong bảng 1 chúng ta thấy 100% các mẫu cho kết quả phát hiện và định lượng dương tính HCV-RNA đều cho được kết quả định được genotype HCV dù kết quả định lượng có thấp đến mức tối thiểu (là 445copies/ml huyết thanh trong nghiên cứu này). Kết quả này cho phép nhận định là phương pháp định genotype HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của phản ứng real-time PCR dùng taqman probe mà chúng tôi xây dựng đạt được độ nhạy cao tương đương phương pháp RT TQ real-time PCR mà công ty Nam Khoa đã phát triển và hiện đang được sử dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng có trang bị real-time PCR. Trong phương pháp RT TQ real-time PCR này, nồng độ HCV RNA ban đầu có trong mẫu thử được định lượng nhờ qui chiếu chu kỳ ngưỡng của các mẫu thử lên trên đường biểu diễn chuẩn. 2 Biểu đồ 1 trình bày tỷ lệ phần trăm các genotype HCV của 234 mẫu huyết thanh thử nghiệm. Kết quả cho thấy có đến 55% các mẫu là thuộc genotype 1b, 20% thuộc genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, và <1% là thuộc genotype 2b. Biểu đồ 2 trình bày đường biểu diễn khuếch đại và đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng (Ct) với nồng độ HCV cDNA chuẩn ban đầu, kết quả cho thấy thử nghiệm TQ real-time PCR trên các mẫu HCV cDNA chuẩn đạt độ chính xác khá cao thể hiện qua R ≥0.99 và hiệu quả PCR trong khỏang 90% - 105%. Biểu đồ 3 minh họa một kết quả TQ real-time PCR phát hiện chu kỳ ngưỡng của các mẫu thử với bảng 2 đính kèm tính tóan nồng độ HCV RNA ban đầu có trong các mẫu thử đó. Lưu í là chúng tôi luôn điều chỉnh để ngưỡng nền (baseline threshold) đường biểu diễn khuếch đại trong các mẫu luôn tương đương với ngưỡng nền của đường biểu diễn khuếch đại của mẫu chuẩn. Trong kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR, kết quả chỉ có thể tốt khi có sản phẩm PCR thuần nhất, không bị các sản phẩm phụ. Hình 1 3 Bảng 1: Kết quả định genotype so với kết quả định lượng Kết quả định lượng copies/ml Số mẫu Genotype(số mẫu) 100 – 999 1 * 1b(1) 1.000 – 9.999 14 1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 6a(1) 10.000 – 99.999 57 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1), 6a(11) 100.000 – 999.999 123 1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30) 1.000.000 – 9.999.999 37 1a(1), 1b(27), 2(5), 6a(4) 10.000.000 – 99.999.999 2 ** 1(1), 1b(1) Tổng cộng 234 1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2), 2a/2c(2), 6a(46) * mẫu có kết quả định lượng thấp nhất là 445copies/ml huyết thanh. ** mẫu cao nhất có kết quả định lượng là 13.792.596 copies/ml. Biểu đồ 1: Biểu đồ cho thấy các tỷ lệ % các genotype HCV trong 234 mẫu huyết thanh thử nghiệm Biểu đồ 2: (A) trình bày đường biểu diễn khuếch đại và chu kỳ ngưỡng (Ct) của các nồng độ ban đầu của các HCV cDNA chuẩn. (B) trình bày đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa Ct với nồng độ ban đầu của HCV cDNA (A) (B) Biểu đồ 3: Trình bày đường biểu diễn khuếch đại và Ct của 13 mẫu. Lưu là đường ngưỡng nền (baseline threshold đã được điều chỉnh để đạt 199.73 như là ngưỡng nền của đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu chuẩn (biểu đồ 2-A) Bảng 2: Trình bày Ct của 13 mẫu và nồng dộ HCV-RNA ban đầu có trong các mẫu. Nồng độ này được tính tóan dựa trên các thông số slope và Int của đường biểu diễn chuẩn ở trên Type Ident. Ct Nồng độ HCV-RNA (copies/ml) Type Ident. Ct Nồng độ HCV-RNA (copies/ml) Unkn 4492 25.38 409,173 Unkn 4483 30.75 13,027 Unkn 4488 N/A Unkn 4482 N/A Unkn 4487 31.82 6,554 Unkn 4490 27.61 97,773 Unkn 4486 30.2 18,542 Unkn 4480 N/A Unkn 4485 N/A Unkn 4494 30.79 12,696 Unkn 4484 26.95 149,353 Unkn 4491 29.91 22,336 Unkn 4493 27.18 128,853 minh họa các kết quả điện di của sản phẩm PCR sau khi tinh sạch rất là rõ nét, dù nồng độ HCV trong một số mẫu là khá thấp. Điều này chứng tỏ qui trình RT real-time PCR mà chúng tôi xây dựng trên nền tảng dùng bộ thử nghiệm RT TQ real-time PCR phát hiện và định lượng HCV-RNA do chúng tôi sản xuất là tối ưu và hòan chỉnh. Tất cả các mẫu mà chúng tôi giải trình tự được đều được phân tích trên phần mềm phân tích giải trình tự của CEQ8000. Đa số các trường hợp các trình tự giải được có chiều dài phù hợp với chiều dài mà chúng tôi dự đóan, là từ 190bp đến <200bp. Hình 2 minh họa một biểu đồ tín hiệu được máy ghi nhận và trình tự của các base. Từ trình tự giải được, đăng nhập lên NCBI blast để so sánh với thư viện Los Alamos và nhờ đó có được kết quả genotype của HCV. Hình 3 minh họa một kết quả giải trình tự của HCV nhờ đăng nhập lên NCBI genotype. Chúng tôi cũng đã thử so sánh kết quả định genotype phương pháp này với kết quả local blast dùng phần mềm miễn phí bio-edit với thư viện genotype HCV mà chúng tôi thành lập được, kết quả như trình bày trong hình 4 cho thấy cả hai phương pháp đều cho kết quả giống hệt nhau. Biện luận Định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên vạch của Bayer đều dựa trên một đọan nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’NC. Đây là cả hai phương pháp được FDA và y học chấp nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng. Phương pháp InoLIPA tuy kém hơn phương pháp giải trình tự vì có thể có nhiều trường hợp không thể phân biệt được các subtype, nhưng InoLIPA có lợi điểm là không cần thiết phải có thiết bị giải trình tự vốn được xem là khá đắt tiền và tương đối khó về mặt kỹ thuật, do vậy InoLIPA có thể triển khai thực hiện được tại bất kỳ các phòng thí nghiệm lâm sàng nào có trang bị phương tiện cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, vì InoLIPA phải thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khả năng bị ngọai nhiễm là khá cao và đây chính là lí do giải thích được tại sao có khá nhiều trường hợp InoLIPA có kết quả không thể xác định được genotype [7,8] . Để có thể khắc phục được nhược điểm này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công một qui trình thực hiện RT-PCR với PCR mix cực kỳ nhạy cảm chỉ cần dùng mồi vòng trong của HCV-InoLIPA và có thêm khả năng chống được ngọai nhiễm sản phẩm khuếch đại nhờ có chứa dUTP và UNG; và chính nhờ cải tiến quan trọng, HCV- InoLIPA có khả năng áp dụng được rộng rãi tại Việt Nam [8] . Tuy vậy khả năng triển khai sử dụng HCV-InoLIPA tại Việt Nam cũng còn khá xa vời vì giá thành hãy còn khá cao (#100USD/mẫu) so với điều kiện kinh tế của nhiều bệnh nhân cũng như khả năng tài chính củaa các bệnh viện hiện nay. Về phương pháp giải trình tự của Trugene, các nhà sản xuất khuyến cáo nên thực hiện trên sản phẩm PCR của Roche Amplicor, và đây chính là một trở ngại khá lớn vì giá thành của Roche Amplicor dành cho HCV rất đắt (trên 120 USD/mẫu thử). Ngòai giá thành của Roche Amplicor, các vật liệu tiêu hao khác đi kèm với thử nghiệm giải trình tự cũng phải đến trên 60USD nữa, do vậy giá thành của một thử nghiệm genotype HCV bằng giải trình tự của Trugene tại Việt Nam khó có thể thấp dưới 180USD. Trong thời gian qua, chúng tôi đã nghiên cứu thành công một bộ thử nghiệm RT-PCR với PCR mix dùng cặp mồi hòan tòan tương thích với hệ thống Trugene nhờ vậy mà phòng thí nghiệm không nhất thiết phải sử dụng Roche Amplicor làm RT- PCR [8,9] . Chính nhờ áp dụng thành công này mà hiện nay giá xét nghiệm HCV genotype tại trung tâm Medic chỉ còn không qua 120USD/một mẫu thử. Tuy vậy, giá thành này cũng hãy còn khá cao để có thể được chỉ định rộng rãi cho các bệnh nhân. Ngòai ra, Trugene là một hệ thống hòan tòan kín, chỉ được dùng để đáp ứng yêu cầu định genotype HCV của lâm sàng do vậy kết quả chỉ có thể hiển thị được trên màn hình và in ra giấy, do vậy nhà nghiên cứu không thể có được kết quả trên một tập tin vi tính để có thể làm blast search hay nghiên cứu phylogenetic. Thư viện HCV là một thư viện được xây dựng sẵn và người dùng có thể cập nhật thêm các kết quả của mình (thực hiện trên chính máy giải trình tự của Trugene) vào thư viện này, nhưng không thể lấy thư viện này ra bên ngòai cũng như không thể đăng nhập được một trình tự có được từ các máy giải trình tự khác để search trên thư viện này. Đây chính là một bất tiện đặc biệt cho các nhà nghiên cứu khi muốn nghiên cứu sâu thêm về HCV genotype trên các kết quả có được từ các nguồn khác nhau. Phương pháp giải trình tự để định genotype HCV do chúng tôi phát triển và trình bày 4 trong công trình nghiên cứu này được thực hiện trên một trình tự dài không quá 200bp của một sản phẩm PCR dài khỏang 240- 250bp, kết quả từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu một đọan đích tương tự của Trugene và InoLIPA trên vùng 5’NC. Chính điều này đảm bảo tính chính xác của kết quả định genotype HCV do chúng tôi phát triển không khác gì kết quả định genotype bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene vì đọan trình tự đích của phương pháp của chúng tôi và đọan trình tự đích của phương pháp Trugen gần như phù hợp nhau hòan tòan. Sở dĩ chúng tôi nghiên cứu thành công được công trình này là nhờ chúng tôi có được các thành công trong nghiên cứu thiết kế được mồi để chế tạo bộ thử nghiệm RT-PCR phát hiện HCV tương thích cho thử nghiệm định genotype HCVbằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene [8,9,10] . Ngòai ra, việc nghiên cứu thành công bộ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe để phát hiện và định lượng HCV-RNA trên một đọan đích đến 240-250bp mà chúng tôi đã nghiên cứu và áp dụng tại khá nhiều phòng thí nghiệm tại Việt Nam [11] là một bước đi đột phá (phá vở qui luật là real-time PCR dùng taqman probe chỉ cho kết quả tối ưu khi sản phẩm khuếch đại không quá 150bp, chứng minh qua các kết quả trình bày trong biểu đồ 1-B) và chính nhờ vậy đã góp nên một yếu tố rất quan trọng để giảm được giá thành của xét nghiệm định genotype bằng kỹ thuật giải trình tự này vì không cần thiết phải thực hiện một RT-PCR để có sản phẩm PCR dành riêng cho giải trình tự. Giá thành định genotype HCV bao gồm cả định lượng HCV-RNA hiện nay của chúng tôi có khả năng sẽ không quá 50USD/mẫu. Kết quả của công trình nghiên cứu cho thấy đa số các mẫu huyết thanh được gửi đến xét nghiệm định lượng HCV-RNA là thuộc genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% còn lại phân phối vào các genotype khác như genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype 2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b (1%), genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b (<1%). Chúng tôi không cho rằng tỷ lệ này phản ánh thật sự đúng tần số lưu hành các genotype HCV trong các người nhiễm HCV tại Việt Nam mà chỉ nói lên được tần số genotype trong các bệnh nhân sắp, đang và đã điều trị đặc hiệu bệnh viêm gan mạn tính do HCV. Chính trên đối tượng nghiên cứu này nên chúng ta thấy tỷ lệ genotype 1b (là genotype đáp ứng kém với điều trị đặc hiệu) là đến 55% với đa số có giá trị định lượng HCV-RNA khá cao (từ 100.000 đến 10.000.000 copies/ml) Có một số nhà nghiên cứu cho là nếu định genotype bằng giải trình tự vùng 5’NC sẽ không cho kết quả chính xác mà phải giải trình tự vùng NS5B trên bộ gen của HCV. Sở dĩ các nhà nghiên cứu này quan niệm như vậy vì đã có một số y văn trên thế giới chứng minh là nếu định genotype HCV trên vùng NS5B thì sẽ có thể phân biệt được các subtype tốt hơn là dựa trên vùng 5’-NC [12] , cũng như là phân biệt được type 6 với subtype 1b [13] hay 1a và 1b chính xác hơn [14] . Tuy nhiên các nghiên cứu như vậy hãy còn khá ít, và kết quả chính xác hay không lại còn tuỳ thuộc vào thư viện gen mà chúng ta dùng để phân tích trình tự giải được [15] . Ngoài ra, dù hiện nay đã có nhiều cải thiện trong thử nghiệm RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng NS5B, nhưng hãy còn kém nhạy cảm xa so với thử nghiệm trên vùng 5’NC, do vậy quan niệm được nhiều người thừa nhận nhất hiện nay là: định genotype dựa trên giải trình tự vùng 5’NC vẫn là thích hợp và hữu dụng nhất cho lâm sàng vì độ nhạy cảm cao, còn vùng NS5B chỉ nên dùng cho các nghiên cứu dịch tễ học về sự phân bố các genotype HCV vì khả năng phân biệt các subtype cao [12, 16-19] . Kết luận Bằng phương pháp giải trình tự một đọan DNA đích dài dưới 200bp của sản phẩm PCR kết quả từ thử nghiệm RT-PCR dùng mồi và Taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC, chúng tôi đã định được genotype của HCV trong huyết thanh của bệnh nhân bị viêm gan mạn tính do nhiễm HCV. Nghiên cứu này đã mở ra được một khả năng ứng dụng rộng rãi không chỉ nhờ giá thành xét nghiệm thấp giúp cho các bác sĩ điều trị không ngần ngại khi cho chỉ định xét nghiệm cho bệnh nhân, mà còn có thể triển khai được tại nhiều phòng thí nhiệm hiện đang có máy giải trình tự mà vẫn ít hay chưa có hướng ứng dụng trong y học như thực tế hiện nay chúng ta vẫn thường gặp. 5 Tài liệu tham khảo 1 National Institute of Health Consensus (2002). Development Conference Statement: Management of Hepatitis C: 2002 June 10-12. Final Statement Revisions made September 12, 2002 2. Versant HCV Genotyping Assay (LiPA) 3. Trugene HCV Genotyping Assay (Sequencing) 4. D. T. T Thuy (2000). Luận văn Thạc Sĩ 5. Trịnh Kim Ảnh và CS. Tình hình viêm gan virus B & C ở bệnh viện Chợ Rẩy. Mạng y khoa net 6. Alter MJ, Semin Liver Dis (1995). Management of Hepatitis C NIH Consensus Statement 1997; March 24- 26:15(3). 7. Nguyen Bao Toan (2005). HCV genotyping by LIPA kit and by Trugene sequencer. Why we need and how we can apply effectively and economically in the clinical laboratory The Viet Nam National Conference on laboratory Medicine. 26-28 Oct. 2005 8. Phạm Hùng Vân et al. (2005). LiPA and Trugene HCV genotyping system - Why we need it and how we can apply it economically and effectively in the clinical laboratories in Vietnam?. Bayer’ s customer meeting in TsingTao, China. 9. Ho Tan Dat (2005) Genotyping the Hepatitis C virus based on the sequencing of the 5’ non – coding of the virus genome The Viet Nam National Conference on laboratory Medicine. 26-28 Oct. 2005 10. Phạm Hùng Vân et al. (2005). Direct sequencing the PCR product for genotyping of HCV and HPV. Becman Coulter’ s customer meeting in Singapore. 11. Nguyen Thanh Tong (2005). The complete solution using molecular biology tool kits for diagnosis and monitoring HBV & HCV infection. ANCLS conference 26-28 Oct. 20056. Nguyễn Thanh Hảo và CS (2000). Genotýp virút viêm gan C ở Việt Nam. Hội nghị chuyên đề bệnh gan mật. Hội gan mật Hà Nội. Tháng 4/2000. 12. Syria Laperche, Jean-Jacques Lefrère et al (2005). Comparison of Hepatitis C Virus NS5b and 5’ Noncoding Gene Sequencing Methods in a Multicenter Study. Journal of Clinical Microbiology, 43(2); 733-739 13. Chinchai, T., J. Labout, S. Noppornpanth, A. Theamboonlers, B. L. Haagmans, A. D. Osterhaus, and Y. Poovorawan. 2003. Comparative study of different methods to genotype hepatitis C virus type 6 variants. J. Virol. Methods 109:195–201. 14. Chen, Z., and K. E. Weck. (2002). Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J. Clin. Microbiol. 40:3127–3134. 15. Joseph D.C. Yao (2003). Evaluation of the TRUGENE HCV 5_NC Genotyping Kit with the New GeneLibrarian Module 3.1.2 for Genotyping of Hepatitis C Virus from Clinical Specimens. Journal of clinical microbiology. 4855–4857 16. Cantaloube, J., H. Venault, J. Zappitelli, P. Gallian, M. Touinssi, H. Attoui, P. Biagini, X. de Lamballerie, and P. de Micco. 2000. Molecular analysis of HCV type 1 to 5 envelope gene: application to investigations of posttransfusion transmission of HCV. Transfusion 40:712–717. 17. Germer, J. J., P. N. Rys, J. N. Thorvilson, and D. H. Persing. 1999. Determination of hepatitis C virus genotype by direct sequence analysis of products generated with the Amplicor HCV test. J. Clin. Microbiol. 37:2625– 2630. 18. Sandres-Saune, K., P. Deny, C. Pasquier, V. Thibaut, G. Duverlie, and J. Izopet. 2003. Determining hepatitis C genotype by analyzing the sequence of the NS5b region. J. Virol. Methods 109:187–193. 19. Tamalet, C., P. Colson, H. Tissot-Dupont, M. Henry, C. Tourres, N. Tivoli, D. Botta, I. Ravaux, I. Poizot-Martin, and N. Yahi. 2003. Genomic and phylogenetic analysis of hepatitis C virus isolates: a survey of 535 strains circulating in southern France. J. Med. Virol. 71:391– 398. 6 . phương pháp xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thu t giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5 NC của HCV rồi sau. Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thu t giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC Phạm Hùng. Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thu t giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC là tiếp cận thích hợp nhất