Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN - Phương pháp 2 potx

Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN – Phương pháp 2 Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN Giới thiệu chung: Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách tiện ích nhất. Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối. 1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa sạch lại bằng nước. 2, Rửa các bản kính với nước trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô, tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay Scott Utinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau cho sạch, sau đó kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổ gel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính. 3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối xứng của bản kính. 4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao cho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bản kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổ gel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí. 5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig). Trộn đều hỗn dịch: 16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%. 5 ml 10X TBE 70 ml 10M Urea (46 gam) Đưa đến thể tích 100 ml với nước Cho vào 800 µl 10% Ammonium persulphat. 50 µl TEMED. Quá trình polyme hóa được thực hiện trong 15 -20 phút. Chạy gel LR trong dải nhiệt độ 50-55 o C, nhiệt độ cao hơn 55 o C sẽ phá các liên kết acrylamid LR gel là dạng cải biến cho gel acrylamid có một số ưu điểm sau: Thứ nhất là LR gel với nồng độ cao hơn nhưng việc chạy gel thì cũng như gel có nồng độ thấp thông thường, ví dụ LR gel 5% tương đương 4% gel acrylamid với bisacrylamid Thứ 2 là LR gel có khả năng phân giải cao hơn và chạy với tốc độ nhanh hơn 30-40% gel thông thường, gel LR khô nhanh hơn và không bị dính. Một số chú ý khi thao tác:: a. Trộn gel nhẹ nhàng (tránh trộn mạnh). b. Hút dịch acrylamid bằng pitpet hay có thể dùng cốc đong. c. Đặt bản kính nghiêng 15 o và đổ gel bằng cốc đong hay pipet. Kiểm soát tốc độ đổ gel bằng góc nghiêng. Tránh để dòng gel khi đổ ngắt quãng vì điều này sẽ dẫn đến tạo bọt. Nếu phải dừng lại để hút dịch mới vào syringer thì lúc đó phải hạ dần bản kính xuống vị trí nằm ngang trước khi dừng đổ gel. Sau đó lấy dịch gel mới vào syringer và tiếp tục đổ gel trước khi gel lên khỏi vị trí nằm ngang. Cứ thao tác như vậy đến khi đổ đầy bản gel. Nếu xuất hiện bọt khi đổ gel thì phải dừng lại ngay và nghiêng tấm kính để cho bọt khí đi lên, có thể gõ nhẹ tay vào bản kính để cho bọt khí đi lên hết. Phải loại hết bọt khí ra khỏi gel, sau đó mới tiếp tục đổ gel. 6, Đặt gel nằm ngang và đưa cạnh bằng của lược răng cá mập vào gel, tạo một góc hơi nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí. Chắc chắn rằng đã đặt cạnh bằng của lược vào phía trên của gel và phần răng cá mập sẽ nằm dọc theo đỉnh của bản kính dài (lược sẽ nằm ngược với vị trí trong hình 1.10). Bổ sung thêm gel và đẩy thêm lược vào đúng vị trí và cố định lược lại bằng kẹp để tránh xê dịch. 7, Bao bọc gel với giấy nilon SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với không khí. Ngoài ra có thể thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên. Điều này giữ cho gel luôn ẩm và tránh gel tiếp xúc với oxy (oxy làm cản trở quá trình polyme hóa). 8, Quá trình polyme xảy ra từ 30 phút đến 1 giờ. Để xác định polyme hóa có thể hút một ít gel vào pipét pastuer và để cho đến khi quá trình polyme hóa xảy ra. Hoặc có thể lấy gel cho vào ống falcon và đậy chặt nắp lại, trong nhiều trường hợp thì gel chỉ nên polyme hóa trong 15-20 phút hoặc nhanh hơn. Nếu quá trình polyme hóa không xảy ra thì lại phải tiến hành rửa kính và đổ lại gel. Chú ý nhiều khả năng quá trình polyme hóa không xảy ra do Ammonium persulphat không còn tốt khi dùng lâu, nên chuẩn bị dịch này để dùng trong tuần. Điều cần chú ý nữa là gel phải được bọc kỹ với SaranWrap để qua đêm. 9, Chuẩn bị gel trước khi chạy: a. Lấy SaranWrap ra khỏi gel. b. Đặt gel vào thiết bị điện di (bản kính dài đặt áp vào thiết bị), chắc chắn là đã cắt bỏ lớp băng dính ở đáy gel để việc điện di xảy ra. c. Đổ 0,5X TBE vào bể đệm dưới của thiết bị, lượng đệm cần phải đủ để cho bản gel nằm trong đệm. d. Đổ đệm vào bể trên của thiết bị, đảm bảo gel nằm dưới lớp đệm. Kiểm tra xem đệm có bị chảy ra hay không. e. Chạy thử 20-30 phút tại hiệu điện thế 2000V (phải cẩn thận vì rất nguy hiểm), sau đó nhiệt độ của bản gel nên đạt tới 50 o C. 10, Xử lý nhiệt với các mẫu ADN điện di tại 85 o C trong 5 hút và trộn đều, để trên đá cho đến khi lên mẫu. 11, Tắt nguồn điện vào thiết bị điện di (nhớ ngắt nguồn điện vào thiết bị trong bất kỳ trường hợp nào khi thao tác với thiết bị). 12, Trong khi xử lý nhiệt với các mẫu thì rửa bề mặt với đệm trong bể điện di, dùng pipet hay syringer 60 ml. Mục đích của thao tác này là loại lớp urea trên bề mặt gel. 13, Đánh dấu vị trí đỉnh của mặt gel trên bản kính trước của gel. 14, Đặt lược răng cá mập lên mặt gel, các răng được đặt trên mặt gel và ngập sâu vào mặt gel khoảng 1 mm. Chắc chắn là vùng không gian giữa các răng được giới hạn giữa các răng và gel. Như vậy phần lược răng cá mập trở thành các cạnh bên của giếng, bề mặt gel là đáy của giếng tra mẫu (hình 1.10). Hình 1.10. Vị trí đặt lược sau khi đổ gel. Phải đảm bảo chắc chắn đã làm sạch bề mặt gel trước khi đặt lược răng cá mập lên trên gel. Nếu không thực hiện việc này sẽ không đọc được phần kết quả phía trên của gel. Nếu quyên thực hiện bước này có thể rửa sạch từng giếng tra mẫu nhưng việc này sẽ khó khăn hơn. Nếu lên nhiều mẫu thì trước đó cần phải phải làm sạch giếng vì urea sẽ khuyếch tán và tích tụ tại bề mặt gel tại thời điểm lên mẫu. 15, Việc xử lý nhiệt ở 85 o C đối với các mẫu điện di nhằm làm biến tính ADN, chỉ lên khoảng 2-4 ml mẫu cho mỗi giếng (lên mẫu theo thứ tự ACGT), có thể dùng bút để viết lên kính nhằm tránh nhầm lẫn. 16, Quá trình điện di với hiệu điện thế 2000V cho đến khi màu BPB (Bromophenolblue) di chuyển đến tận cùng bảng gel (1-2 giờ). Nếu chạy gel có gradient muối sẽ cho phép đọc được nhiều base hơn trên một gel do việc làm ngắn lại khoảng cách giữa các băng ADN ở phần cuối bản gel. Nên dừng điện di từ 45 phút – 1 giờ. Tắt nguồn điện, bổ sung 1/2 thể tích 3M NaOAc vào bể đệm đáy, trộn đều. Lại tiếp tục công việc chạy gel cho đến khi BPB di chuyển đến cuối bản gel. Chú ý sự có mặt của muối nồng độ cao sẽ dẫn đến nhiệt độ tăng, do đó cần phải kiểm soát nhiệt độ của quá trình chạy gel nhằm tránh vỡ kính và hỏng gel. Chuẩn bị gel cho phát hiện bằng ảnh phóng xạ. 17, Lấy bản gel ra khỏi thiết bị, chú ý bể đệm đáy chứa chất phóng xạ, các nucleotid dư sẽ đi ra khỏi bản gel. 18, Đổ bỏ bể đệm trên. 19, Đặt bản gel trên bàn thí nghiệm sao cho tấm kính ngắn lên trên. Phủ lên một lớp SaranWrap, dùng đá lạnh đặt lên trên khoảng 2 phút để cho gel co lại, dùng thanh nhựa tách các lớp kính ra, giữ nguyên không cho tấm kính trên tiếp xúc lại với gel vì như vậy gel sẽ dính và bị vỡ. Lúc này gel sẽ chỉ dính vào tấm kính dưới không có silicon được phủ khi đổ gel. 20, Đặt tấm giấy Whatman lên trên gel và vuốt đều nhẹ nhàng, lúc đó gel sẽ dính vào giấy và có thể lấy ra dễ dàng (Chú ý trong trường hợp sử dụng chất phóng xạ là S 35 thì nên cố định mẫu theo cách dưới đây). 21, Sau khi lấy gel ra hỏi tấm kính đáy thì bọc gel với SaranWrap, chú ý tránh không khí đi vào giữa lớp SaranWrap và gel, điều này sẽ cản trở ảnh phóng xạ trên phim. 22, Có thể đưa vào thiết bị sấy gel. 23, Sấy gel trong khoảng 45 phút tại 80 o C. 24, Đặt phim X-ray theo đúng chỉ dẫn vào gel trong hộp cassette (có phim chỉ có một mặt thì mọi thao tác phải đúng để có ảnh phóng xạ). Thời gian nhận được bức xạ là 12-14 giờ đối với P 32 và 24-48 giờ đối với S 35 . 25, Đọc kết quả. Cố định gel: Mục đích của bước này là loại bớt urea khỏi gel vì sự có mặt của urea sẽ hạn chế sự phân cách giữa các ADN, các bước được thực hiện như sau: + Đặt bản kính có gel vào khay chìm trong hỗn dịch 15% ethanol và 10% acetic acid. + Cố định trong 10-15 phút đủ để urea khuyếch tán khỏi gel. + Dùng giấy lọc để thấm hết dịch cố định khỏi gel. + Tiếp tục làm theo các bước như quy trình hiện ảnh phóng xạ. Hóa chất và cách chuẩn bị: Phương pháp: Giải trình tự ADN sợi kép sử dụng KIT biến tính nhanh với sequenase. Phương pháp này thích ứng với việc giải trình tự các plasmid sợi đôi. Bắt đầu bằng việc gây biến tính trong kiềm (NaOH) hoặc glycerol, sau đó kết tủa ADN và bắt cặp với ADN mồi dùng để giải trình tự. Phương pháp giải trình tự ADN với sợi đôi cần lượng ADN mồi cao gấp 10-20 lần so với sợi đơn. Việc giải trình tự gồm hai phản ứng: phản ứng đánh dấu và phản ứng dừng tại điểm cuối. Trong phản ứng đánh dấu các sợi ADN bổ sung được gắn kết với chất đánh dấu phóng xạ trong việc kéo dài chuỗi. Sau đó phản ứng kéo dài chuỗi ADN bị dừng một cách ngẫu nhiên do nồng độ thấp của nucleotid trong dịch phản ứng (0.08 mM). Bước tiếp theo là kết thúc chỗi với dideoxynucleotid khi có nồng độ cao của deoxyribonucleotid (33,3 mM). Các trình tự tiếp theo của sợi khuôn sẽ được xác định với nồng độ cao của deoxynucleotid trong khi phản ứng đánh dấu xảy ra trước việc bổ sung dideoxynucleotid vào hỗn hợp phản ứng. Quy trình sau đây đã được rút gọn, có nhiều phần tiện ích chi tiết hơn và thay đổi trong các tài liệu hướng dẫn. Điều quan trọng để có kết quả tốt trong việc giải trình tự ADN là chất lượng cao của ADN plasmid. Trong các khâu chuẩn bị việc xuất hiện các phân tử đứt gãy sẽ dẫn đến kết quả không rõ, khó xác định các băng. Các plasmid sợi đơn phải được làm biến tính cho mở xoắn trước khi giải trình tự. Biến tính các plasmid xoắn do liên kết hóa trị không phải lúc nào cũng đạt được bằng xử lý nhiệt tại nhiệt độ bắt cặp mồi hay trong đệm phản ứng, bởi lẽ nhiệt độ mở xoắn thường là 105ng là 105 o C. Có hai phương pháp khá nhanh và tiện lợi: Một phương pháp xuất phát từ thực tế là glycerol hoặc ethylen glycerol có tác dụng làm giảm nhiệt độ mở xoắn, còn phương pháp thứ 2 là mở xoắn bằng môi trường kiềm. Cả hai phương pháp đều thực hiện đơn giản cho hầu hết các loại ADN khuôn. Đối với hai phương pháp biến tính ADN, nên dùng lượng ADN khuôn ở nồng độ 0.5 pmol (05- 0.3 mg) và lượng primer 2-5 pmpol. Nếu sử dụng thể tích ADN nhỏ hơn thì phải pha đến nồng độ thích hợp bằng nước. Kết quả tốt nhất thu được là theo tỷ lệ phân tử mồi : sợi khuôn là 4 : 1. Tỷ lệ này nên được duy trì khi tiến hành với lượng ADN khuôn khác nhau. Trong mọi trường hợp khi mà số lượng [...]... sequenase) b Kỹ thuật giải trình tự ADN trên thiết bị giải trình tự ADN tự động: Hình 1. 12 Thiết bị giải trình tự ADN tự độngg (3100-Avant Genetic Analyzer) Trong phần này chúng tôi đề cập phản ứng giải trình tự ADN trên 2 loại thiết bị chủ yếu hiện đang được dùng phổ biến là: Beckman Coulter và ABI 3100Avant Chuẩn bị mẫu giải trình tự ADN: 1 Thành phần phản ứng (cho 1 phản ứng 20 ml): - Terminator... đến một số vấn đề nảy sinh và cách giải quyết khi tiến hành giải trình tự ADN - Muốn đọc được trình tự ADN dài hơn: Yêu cầu đầu tiên là phải đọc được đoạn gene đến mức có thể trên gel Thông thường thì kích thước đọc cho mỗi phản ứng trên gel là 25 0-3 00 nucleotid Với thời gian chạy gel lâu khoảng 8 giờ thì có thể đọc được kích thước gene dài hơn 400 nucleotid Nếu sử dụng gel gradient sẽ không phù hợp cho. .. cho mục đích này vì khoảng cách giữa các băng ADN sẽ hẹp tới mức không thể đọc được Nồng độ gel acrylamid dao động 4-6 % là thích hợp cho kết quả tốt Có một giải pháp nữa là có thể sử dụng gel với gradient muối nhưng vẫn giữ nguyên thời gian chạy gel (xem phương pháp 2, bước 16) - Sự dồn các băng: Nguyên nhân chung để không thể hoàn tất việc giải trình tự ADN là các băng không rõ do cấu trúc bậc hai... Mix*: 8 µl - Template: ( với plasmid là: - Primer : - Nước cất vô trình: 8 0-1 00 ng 300ng) 3 .2 pmol đủ 20 µl Chuẩn bị Teminator Ready Reaction Mix cho 4 phản ứng: 15 µl Bigdye Sequencing Buffer 3.1 (5X) + 15 µl nước = 30 µl (2. 5X) 20 µl đệm 2. 5X + 20 µl Ready Reaction Premix= 40 µl Terminator Ready Reaction Mix (dùng 8 µl) cho một phản ứng 2 Tiến hành phản ứng: Phản ứng được thực hiện trong 20 0 ml tube... điều này thường được mô tả là sự dồn ép các băng do các băng bị thu hẹp một cách bất thường trên ảnh fim của kết quả giải trình tự ADN Các khoảng cách hoàn toàn như nhau khi mà khoảng 3 liên kết G-C bổ sung kèm với 2- 5 base có thể dẫn đến kết quả không thể đọc được đoạn gene chiếm một khoảng nhỏ trên bản gel Khoảng trống bất thường là do ảnh hưởng của chuỗi với khoảng cách ngắn của cấu trúc bậc 2 sẽ có... - Cường độ các băng thiếu sự đồng nhất: Một vấn đề khác trong phản ứng giải trình tự ADN là cường độ các băng không đồng nhất Điều này thường xuất hiện trong phương pháp giải trình tự với thiết bị tự động dựa vào phương pháp phát hiện bức xạ huỳnh quang Sự thiếu đồng nhất là do sự có mặt của sequenase cần Mg++ gắn dideoxy kết thúc chuỗi khác nhau tại các vị trí khác nhau (vấn đề này được bàn luận kỹ. .. dụng dITP thay cho dGTP trong phản ứng giải trình tự ADN Lý do là base I chỉ có 2 liên kết với C thay vì 3 liên kết trong trường hợp với G, kết quả là ADN sẽ dễ duỗi hơn Kỹ thuật này thường được dùng, do đó dITP có trong KIT sequenase Một cách khác có thể làm kém bền vùng base dồn nén do còn cặp đôi đó là thực hiện chạy gel trong điều kiện biến tính (ví dụ sử dụng formamide trong nước dùng đổ gel) Trong... và mẫu có thể được giữ ở 4 oC để sử dụng trong ngày hôm sau d Xử lý ở nhiệt độ 75oC cho các mẫu khoảng 2- 3 phút ngay trước khi tra mẫu lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì việc lên mẫu dễ dàng với đầu côn vàng e Lên khoảng 2- 3 ml mẫu cho mỗi giếng trên gel giải trình tự Nên đưa một lượng đồng mẫu trên các giếng Cách tốt nhất để lên mẫu không bị bọt là hút 3 ml mẫu nhưng khi tra chỉ dùng 2 ml là đủ... khác thường do sự kém bền của cấu trúc bậc 2 làm cho chiều dài của chuỗi tăng lên và sự di động của chuỗi trở nên như bình thường Việc giải trình tự qua vùng gene dồn nén có thể được khắc phục bằng cách thực hiện việc đọc trình tự trên cả hai sợi Sự bất thường về việc di chuyển nảy sinh ở các chuỗi có chiều dài không đủ cho việc bắt cặp Điều này có nghĩa vùng gene có các băng không rõ ràng sẽ được. .. Cycling được thực hiện trong máy PCR theo chương trình sau: Denature 96oC: 1 phút 96 oC: 10 giây 50oC: 5 giây 60oC: 4 phút Cycling: 25 cycles 3 Kết tủa sản phẩm PCR: - Cho vào 5µl EDTA 125 mM + 60µl E-OH 100%E-OH 100% - Trộn đều, để 15 phút ở nhiệt độ phòng Ly tâm 15 000 v/phút - Rửa lại bằng 60µl E-OH 70% và lại ly tâm (4oC) - Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng (Speed Vac) - Khi mẫu khô, thêm 10µl Hi-Di formamide, . Một số phương pháp cụ thể thường được dùng cho kỹ thuật giải trình tự ADN – Phương pháp 2 Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN Giới thiệu chung: Phương pháp này. sau đó kết tủa ADN và bắt cặp với ADN mồi dùng để giải trình tự. Phương pháp giải trình tự ADN với sợi đôi cần lượng ADN mồi cao gấp 1 0 -2 0 lần so với sợi đơn. Việc giải trình tự gồm hai phản. cách giải quyết khi tiến hành giải trình tự ADN. - Muốn đọc được trình tự ADN dài hơn: Yêu cầu đầu tiên là phải đọc được đoạn gene đến mức có thể trên gel. Thông thường thì kích thước đọc cho