Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới để sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể trước làm tổ tt

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Phương pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization/IVF) phương pháp hỗ trợ sinh sản có vai trị quan trọng điều trị vơ sinh, ngày phát triển rộng khắp giới Nhưng tỷ lệ thành cơng IVF cịn thấp từ 33-50%, phôi chuyển phôi chọn lựa hình thái tốt Tuy nhiên, khơng phải tất phơi IVF hình thái bình thường có nhiễm sắc thể (NST) bình thường Các nhà nghiên cứu 50% phôi IVF bị rối loạn NST, nguyên nhân làm tỷ lệ thành cơng IVF cịn thấp Vì vậy, ứng dụng kỹ thuật di truyền đại nhằm phát rối loạn di truyền cho phôi trước làm tổ (Preimplantation genetic testing/PGT) việc cần thiết; giúp cho IVF đạt kết cao đảm bảo cho đời hệ khoẻ mạnh, góp phần nâng cao chất lượng dân số Trong năm gần đây, kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) áp dụng rộng rãi Châu Âu chứng minh có giá trị kỹ thuật FISH, aCGH việc phát rối loạn NST phôi Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật NGS để sàng lọc rối loạn di truyền phơi IVF Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Hoàn thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) tế bào phơi Đánh giá độ xác kỹ thuật NGS vo với kỹ thuật aCGH sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể tế bào phôi Đánh giá bước đầu kết sàng lọc phôi trước làm tổ kỹ thuật NGS Những đóng góp luận án Đây nghiên cứu Việt Nam, sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) để xét nghiệm sàng lọc rối loạn 24 NST cho phôi IVF trước làm tổ Nghiên cứu có tính cấp thiết, có giá trị thực tiễn cao có tính nhân văn sâu sắc Nghiên cứu hoàn thiện quy trình sàng lọc rối loạn 24 NST phơi IVF kỹ thuật NGS Trong đó, tối ưu hóa quy trình chạy giải trình tự chạy máy cơng suất nhỏ hơn, chạy số mẫu hơn; giúp cơng suất chạy máy thay đổi linh hoạt từ mẫu đến 24 mẫu/lần giải trình tự; giúp rút ngắn thời gian trả kết quả, giảm giá thành dịch vụ Điều có ý nghĩa phù hợp với điều kiện thực tế Việt Nam Nghiên cứu đánh giá kỹ thuật NGS có độ xác cao, kết xét nghiệm NGS phù hợp với kết aCGH Nghiên cứu ứng dụng thành công kỹ thuật NGS, xác định tỷ lệ bất thường NST phôi IVF cao, tỷ lệ bất thường số lượng NST tăng nhanh theo tuổi, đặc biệt tuổi mẹ 35 Xác định rối loạn NST gây chết phôi giai đoạn làm tổ, gây sẩy thai, thai lưu thai kỳ I Kết định hướng việc lựa chọn phơi dựa vào hình thái phơi kết hợp với dựa vào di truyền kỹ thuật NGS, giúp chọn lựa phôi tốt nhất, chuyển vào buồng tử cung nhằm sinh em bé khỏe mạnh thiết thực Cấu trúc luận án Luận án gồm 136 trang, có 35 bảng, 20 hình 30 biểu đồ, sơ đồ, 181 tài liệu tham khảo có 171 tài liệu tiếng Anh, 10 tiếng Việt Cấu trúc luận án gồm Đặt vấn đề trang, Tổng quan 42 trang, Đối tượng Phương pháp nghiên cứu 28 trang, Kết 33 trang, Bàn luận 28 trang, Kết luận trang Kiến nghị trang Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình vơ sinh giới Việt Nam Theo thống kê nghiên cứu Việt Nam giới, vơ sinh có xu hướng tăng, tỷ lệ vô sinh 715%, nguyên nhân vô sinh nam giới chiếm tỷ lệ gần với vô sinh nữ giới Điều trị vô sinh bao gồm liệu pháp y học thông thường, sử dụng thuốc can thiệp thủ thuật, phẫu thuật quan sinh sản dùng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (IVF) 1.2 Phương pháp thụ tinh ống nghiệm (IVF) IVF kỹ thuật cho noãn tinh trùng kết hợp với phịng thí nghiệm Sau đó, phơi hình thành chuyển trở lại vào buồng tử cung Quy trình kỹ thuật IVF: Chuẩn bị nỗn; Cho noãn thụ tinh với tinh trùng (cổ điển tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (ICSI)); Chọn lựa phôi; Chuyển phôi vào buồng tử cung 2 Nhờ tiến di truyền học đại, nhiều kỹ thuật di truyền tế bào - phân tử ứng dụng để xét nghiệm di truyền trước làm tổ, giúp chọn lựa phơi vừa có hình thái tốt vừa có NST bình thường 1.3 Các xét nghiệm di truyền trước làm tổ  PGT-A (Preimplantation genetic testing for Aneuploidies): Xét nghiệm di truyền trước làm tổ phát lệch bội NST  PGT-M (Preimplantation genetic testing for monogenic/single gene disorders): Xét nghiệm di truyền trước làm tổ phát rối loạn đơn gen  PGT-SR (Preimplantation genetic testing for chromosome structural rearrangements): Xét nghiệm di truyền trước làm tổ phát rối loạn cấu trúc NST 1.4 Kỹ thuật sinh thiết phơi Sinh thiết phơi thực giai đoạn khác nhau: sinh thiết sau thụ tinh (sinh thiết thể cực thứ thứ hai), sinh thiết phôi giai đoạn phân cắt (ngày thứ sau thụ tinh) hay sinh thiết giai đoạn phôi nang (ngày thứ 5-6 sau thụ tinh) Sinh thiết nguyên bào nuôi xét nghiệm di truyền phôi giai đoạn phôi nang ngày 5-6 xem kỹ thuật mang lại kết di truyền xác với ưu điểm nhiều tế bào sinh thiết để sàng lọc, chẩn đốn Vì kết chẩn đốn di truyền thể cực phản ánh bất thường di truyền người mẹ mà thiếu thông tin di truyền người cha nên kết khơng phản ánh xác tình trạng rối loạn NST phơi Sinh thiết phơi giai đoạn phân cắt có ảnh hưởng xấu đến phát triển phôi so với sinh thiết phôi nang, làm cho tốc độ phát triển phôi chậm đáng kể Trong đó, sinh thiết phơi nang, lấy ngun bào ni, cịn ngun bào phơi bào bảo tồn nên phát triển phôi không bị ảnh hưởng Sau lấy sinh thiết phôi, tế bào phôi rửa dung dịch đệm phosphate (PBS+PVP) vơ trùng, sau chuyển sang phịng xét nghiệm để sàng lọc, chẩn đốn rối loạn NST 1.5 Các kỹ thuật di truyền ứng dụng xét nghiệm di truyền trước làm tổ 1.5.1 Kỹ thuật lai huỳnh quanh chỗ (FISH) FISH (Fluorescence in situ hybridization) sử dụng lần để xét nghiệm phơi người vào năm 1992 Hiện nay, FISH ứng dụng PGT-A hạn chế bật kỹ thuật FISH, kiểm tra lượng giới hạn NST (tối đa 12 cặp NST) từ tế bào phôi ngày nên tỷ lệ chẩn đốn âm tính giả cao 1.5.2 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen (CGH) Kỹ thuật CGH (Comparative Genomic Hybridization) phát triển thập niên 1990 Kỹ thuật CGH khắc phục nhược điểm kỹ thuật FISH, đánh giá rối loạn số lượng toàn NST tế bào giai đoạn kỳ Tuy nhiên, CGH nhiều hạn chế phát rối loạn số lượng NST rối loạn cấu trúc không cân CGH phát rối loạn thể cấu trúc mà khơng có thay đổi số sao, chuyển đoạn NST cân NST vịng Thời gian phân tích kết CGH lâu, khoảng 3-4 ngày 1.5.3 Kỹ thuật lai so sánh hệ gen kết hợp microarray (aCGH) Kỹ thuật lai so sánh hệ gen kết hợp microarray (Microarray-based Comparative Genomic Hybridization/ aCGH) giải tồn CGH.Nguyên lý hoạt động aCGH giống CGH Tuy nhiên kỹ thuật aCGH sử dụng chip DNA tạo thành từ đoạn dị có kích thước nhỏ (oligo probe) bao phủ toàn hệ gen NST Quy trình hoạt động: Đánh dấu DNA mẫu phơi bào; Lai với DNA dò đặc hiệu; Rửa sau lai; Qt hình ảnh; Phân tích liệu đọc kết Ưu điểm: Kỹ thuật aCGH có khả đánh giá toàn 24 NST xét nghiệm phát bất thường cân NST bao gồm trường hợp lệch bội, nhân đoạn NST xác nhiều so với phương pháp lập karyotype Nhược điểm: aCGH xác định trường hợp bất thường cấu trúc NST dạng cân chuyển đoạn cân đảo đoạn; aCGH phát trường hợp khảm có tỷ lệ khảm thấp 10% trường hợp lệch bội 1.5.4 Kỹ thuật giải trình tự gen hệ (NGS) Kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Generation Sequencing/ NGS) cách mạng công nghệ giải trình tự cho phép giải trình tự đồng thời lượng lớn đoạn ngắn nucleotide Do kỹ thuật giải trình tự hệ cịn gọi giải trình tự hệ gen Quy trình hoạt động NGS bao gồm giai đoạn sau đây: Chuẩn bị thư viện; Lai với mẫu DNA dị (probe) đặc hiệu; Giải trình tự; Phân tích số liệu Ưu điểm: NGS thực cần vài tế bào phơi, liệu xác, kỹ thuật phân tích đơn giản, thiết bị đáng tin cậy có giá thành hợp lý Sàng lọc rối loạn NST dựa kỹ thuật NGS tạo nhiều lợi ích kỹ thuật đời trước giảm chi phí giải trình tự, có khả đánh giá tổn thương cấu trúc NST, khả tự động hóa cao giúp giảm thiểu sai sót trình thực 1.6 Tình hình ứng dụng kỹ thuật NGS PGT giới Việt Nam Kỹ thuật bắt đầu áp dụng rộng rãi số nước Châu Âu Mỹ từ năm 2014 để phân tích NST phơi nang Các kết lâm sàng thu nghiên cứu từ chu trình PGT thực với phương pháp NGS đáng khích lệ, theo Fragouli (2010); Fiorentino (2011); Forman (2012); Scott (2013), tỷ lệ mang thai lâm sàng tăng đáng kể 62%-63,8% (tuổi trung bình 38,5 ± 2,1 tuổi) Hiện nay, Việt Nam chưa có nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật NGS Nghiên cứu nghiên cứu kỹ thuật NGS 1.7 Tỷ lệ lệch bội NST noãn phơi Tỷ lệ lệch bội NST nỗn tương đối cao tăng dần phụ nữ lớn tuổi: nhóm 50 >35 Điểm chất lượng trung bình (Average quality score- Qscore) >35 >30 Điểm ghép cặp trung bình (Average alignment score) >35 >30 Chỉ số nhiễu mẫu (Overall noise - DLR) 0,2 0,7 Phân tích kết luận kết giải trình tự gen cách sử dụng phân phối Gauss (số lượng từ 0-4 độ lệch chuẩn 0,33) giá trị ngưỡng Mỗi biểu đồ biến thể số lượng (Copy number variation-CNV) NGS biểu thị phép gán số lượng (0, 1, 2, 4) trục Y số lượng NST trục X - Tiêu chí kết luận kết giải trình tự gen kỹ thuật NGS + Bình thường: số =2 (1,8-2,2) + Thêm nhiễm sắc thể: số >2,8 + Mất nhiễm sắc thể: số 0,3; Mất NST: log2 (phôi bào/chứng) số < -0.3; Mất đoạn bán hợp tử: log2 (phôi bào/chứng) = log2 (1/2) = -1; Nhân đoạn: log2 (phôi bào/chứng) = log2 (3/2) = 0,59; Nhân đoạn đồng hợp tử: log2 (phôi bào/chứng) = log2 (4/2) = 1; Không kết luận kết quả: log2 (phơi bào/chứng) 30) 24 100% 0% Điểm ghép cặp trung bình (>30) 24 100% 0% Chỉ số nhiễu mẫu (0,7) 24 100% 0% Nhận xét: Khi thực giải trình tự gen 24 mẫu phơi bào, kết 100% mẫu đạt tổng số lần đọc >700.000, tổng số lần đọc tối thiểu sau lọc 250.000/mẫu, điểm chất lượng trung bình >30, điểm ghép cặp trung bình >30, điểm độ nhiễu mẫu không vượt 0,4 độ tin cậy vùng khuếch đại NST đạt > 0,7 3.1.2.2 Kết giải trình tự gen Bảng 3.5 Kết giải trình tự gen cho 24 mẫu Đặc điểm phơi Phơi bình thường (n=11) Phơi bất thường (n= 13) Số lượng Tỷ lệ (%) Số phôi không rối loạn NST 11 45,8 Số phôi rối loạn NST 12,5 Số phôi rối loạn NST 25 Số phôi rối loạn ≥3 NST 12,5 Số phôi thể khảm 4,2 Tổng 24 45,8 54,2 100 Nhận xét: Trong 24 phơi thực giải trình tự gen có 11 phơi bình thường (chiếm 45,8%) 13 phơi bất thường chiếm (54,2%), chủ yếu bất thường số lượng NST, rối loạn NST gặp nhiều (chiếm 25%), thể khảm gặp (chiếm 4,2 %) 3.1.3 Kết trình tối ưu quy trình giải trình tự gen kit chạy mẫu nhỏ Sau chuẩn hóa quy trình theo kit Veriseq, tiếp tục thực tối ưu hóa quy trình giải trình tự nhằm chạy Flowcell nhỏ hơn, số lượng mẫu lần chạy Điều giúp trả kết sàng lọc phôi nhanh tiết kiệm nhất, khắc phục tình trạng trả kết chậm gom mẫu cho đủ mẻ chạy 3.1.3.1 Kết chạy kit Miseq Reagent kit v2 Nano (4 mẫu/ lần chạy) Bảng 3.6 Đánh giá chất lượng kết giải trình tự gen kit Miseq Reagent kit v2 Nano Tiêu chí Đạt Khơng đạt Chỉ số Số lần đọc >700.000 n % n % Số lần đọc sau lọc >250.000 100% 0,0% % Tổng số lần đọc sau lọc >35 100% 0,0% Điểm chất lượng trung bình >30 100% 0,0% Điểm ghép cặp trung bình >30 100% 0,0% Chỉ số nhiễu mẫu 0,7 100% 0,0% Nhận xét: Khi thực giải trình tự gen mẫu phôi bào kit Miseq Reagent kit v2 Nano, kết 100% mẫu đạt tổng số lần đọc >700.000, tổng số lần đọc tối thiểu sau lọc 250.000/mẫu, điểm chất lượng trung bình >30, điểm ghép cặp trung bình >30, điểm độ nhiễu mẫu không vượt 0,4 độ tin cậy vùng khuếch đại NST đạt > 0,7 9 Hình 3.3 Hình ảnh minh h a th ng số chạy biểu đồ CN mẫu đạt yêu cầu giải trình tự gen kit Miseq Reagent kit v2 Nano Số lần đọc (Number of total reads) 1.733.886 (>700.000); Số lần đọc sau lọc (Number of reads after filtering) 995.937 (>250.000); % Tổng số lần đọc sau lọc (% of total reads after filtering) = 57,44% (>35%); Điểm chất lượng trung bình (Average quality score- Qscore) 36,1 (>30); Điểm ghép cặp trung bình (Average alignment score) 35,1 (>30); Chỉ số nhiễu mẫu (Overall noise - DLR) 0,15 (700.000 n % n % Số lần đọc sau lọc >250.000 12 100% 0,0% % Tổng số lần đọc sau lọc >35 12 100% 0,0% Điểm chất lượng trung bình >30 12 100% 0,0% Điểm ghép cặp trung bình >30 12 100% 0,0% Chỉ số nhiễu mẫu 0,7 12 100% 0,0% Nhận xét: Khi thực giải trình tự gen mẫu phôi bào kit Miseq Reagent kit v2 Micro, kết 100% mẫu đạt tổng số lần đọc >700.000, tổng số lần đọc tối thiểu sau lọc 250.000/mẫu, điểm chất lượng trung bình >30, điểm ghép cặp trung bình >30, điểm độ nhiễu mẫu không vượt 0,4 độ tin cậy vùng khuếch đại NST đạt > 0,7 10 Hình 3.4 Hình ảnh minh h a th ng số chạy biểu đồ CN mẫu đạt yêu cầu giải trình tự gen kit Miseq Reagent kit v2 Micro Số lần đọc (Number of total reads) 849.394 (>700.000); Số lần đọc sau lọc (Number of reads after filtering) 359.581 (>250.000); % Tổng số lần đọc sau lọc (% of total reads after filtering) 359.581/849.394 = 42,33% (>35%); Điểm chất lượng trung bình (Average quality score- Qscore) 36,4 (>30); Điểm ghép cặp trung bình (Average alignment score) 45,9 (>30); Chỉ số nhiễu mẫu (Overall noise - DLR) 0,24 (700.000 n % n % Số lần đọc sau lọc >250.000 16 100% 0,0% % Tổng số lần đọc sau lọc >35 16 100% 0,0% Điểm chất lượng trung bình >30 16 100% 0,0% Điểm ghép cặp trung bình >30 16 100% 0,0% Chỉ số nhiễu mẫu 0,7 16 100% 0,0% Nhận xét: Khi thực giải trình tự gen 16 mẫu phôi bào kit Miseq Reagent kit v2 Standard, kết 100% mẫu đạt tổng số lần đọc >700.000, tổng số lần đọc tối thiểu sau lọc 250.000/mẫu, điểm chất lượng trung bình >30, điểm ghép cặp trung bình >30, điểm độ nhiễu mẫu không vượt 0,4 độ tin cậy vùng khuếch đại NST đạt > 0,7 11 ình 3.5 Hình ảnh minh h a th ng số chạy biểu đồ CN mẫu đạt yêu cầu giải trình tự gen kit Miseq Reagent kit v2 Standard Số lần đọc (Number of total reads) 1.523.971 (>700.000); Số lần đọc sau lọc (Number of reads after filtering) 947.509 (>250.000); % Tổng số lần đọc sau lọc (% of total reads after filtering) 947.509/1.523.971 = 62,17% (>35%); Điểm chất lượng trung bình (Average quality score- Qscore) 36,3 (>30); Điểm ghép cặp trung bình (Average alignment score) 35,3 (>30); Chỉ số nhiễu mẫu (Overall noise - DLR) 0,18 (700.000 n % n % Số lần đọc sau lọc >250.000 24 100% 0,0% % Tổng số lần đọc sau lọc >35 24 100% 0,0% Điểm chất lượng trung bình >30 24 100% 0,0% Điểm ghép cặp trung bình >30 24 100% 0,0% Chỉ số nhiễu mẫu 0,7 24 100% 0,0% Nhận xét: Khi thực giải trình tự gen 24 mẫu phơi bào kit Miseq Reagent kit V3, kết 100% mẫu đạt tổng số lần đọc >700.000, tổng số lần đọc tối thiểu sau lọc 250.000/mẫu, điểm chất lượng trung bình >30, điểm ghép cặp trung bình >30, điểm độ nhiễu mẫu không vượt 0,4 độ tin cậy vùng khuếch đại NST đạt > 0,7 12 ình 3.6 Hình ảnh minh h a th ng số chạy biểu đồ CN mẫu đạt yêu cầu giải trình tự gen kit Miseq Reagent kit V3 Số lần đọc (Number of total reads) 1.225.181 (>700.000); Số lần đọc sau lọc (Number of reads after filtering) 823.615 (>250.000); % Tổng số lần đọc sau lọc (% of total reads after filtering) 823.615/1.225.181 = 67,22% (>35%); Điểm chất lượng trung bình (Average quality score- Qscore) 35,7 (>30); Điểm ghép cặp trung bình (Average alignment score) 35,5 (>30); Chỉ số nhiễu mẫu (Overall noise - DLR) 0,17 (