KẾT QUẢ kỹ THUẬT GIẢI TRÌNH tự GEN THẾ hệ mới TRONG SÀNG lọc rối LOẠN 24 NHIỄM sắc THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ Nhóm 10 - Lớp NCKH KẾT QUẢ KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG SÀNG LỌC RỐI LOẠN 24 NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Hà Nội – 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ Nhóm 10 - Lớp NCKH KẾT QUẢ KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI TRONG SÀNG LỌC RỐI LOẠN 24 NHIỄM SẮC THỂ TRƯỚC CHUYỂN PHÔI Chuyên ngành : Y sinh học- Di truyền Mã số : 62720111 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC Hà Nội – 2016 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT a-CGH Phương pháp lai so sánh gen dùng chíp DNA BOBs Phương pháp sử dụng hạt Bead CGH Phương pháp lai so sánh gen FISH Phương pháp lai huỳnh quang chỗ NGS Phương pháp giải trình tự gen hệ NST Nhiễm sắc thể PGS Sàng lọc trước chuyển phơi PGD Chẩn đốn trước chuyển phơi PCR Phương pháp phản ứng chuỗi Polymerase PGS - NGS Sàng lọc phôi kỹ thuật giải trình tự gen hệ MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ Vô sinh vấn đề giới quan tâm, tỷ lệ vô sinh có xu hướng ngày tăng Theo thống kê Tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ vô sinh 6÷12% Tỷ lệ vơ sinh Việt Nam 7,7% Hiện Việt Nam giới, phương pháp thụ tinh ống nghiệm ứng dụng rộng rãi nhiên tỉ lệ thành cơng chưa cao, dừng mức 35%, mà nguyên nhân rối loạn nhiễm sắc thể phơi Đã có nhiều kỹ thuật ứng dụng sàng lọc rối loạn di truyền trước chuyển phôi FISH, Array-CGH, QF- PCR, Karyolite BoBs kỹ thuật NGS (Next Generation Sequencing) NGS đời tạo cách mạng công nghệ di truyền phân tử Sàng lọc di truyền trước chuyển phơi dựa kỹ thuật NGS (PGS-NGS) có nhiều điểm khác so với kỹ thuật đời trước, kỹ thuật NGS thực vài tế bào phơi, liệu xác, kỹ thuật phân tích đơn giản, thiết bị đáng tin cậy có giá thành hợp lý, sàng lọc dị bội 24 NST; phát hầu hết bệnh lý liên quan đến chuyển đoạn đoạn nhỏ, giảm chi phí giải trình tự, khả tự động hóa cao giúp giảm thiểu sai sót q trình thực NGS ứng dụng Châu Âu từ năm 2014, Việt Nam bắt đầu ứng dụng số đơn vị tư nhân sàng lọc rối loạn di truyền trước chuyển phôi Tuy nhiên chưa có đánh giá độ xác, độ tin cậy trình thực kỹ thuật sàng lọc khuếch đại gen, kiểm soát nhiễm chéo, phân tích kết Những vấn đề bị ảnh hưởng lớn thao tác thực cần phải có nghiên cứu tồn diện áp dụng tất khía cạnh việc áp dụng kĩ thuật NGS Do nghiên cứu để hồn thiện q trình sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể NGS cần thiết Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài: “ Kết kỹ thuật giải trình tự gen hệ sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người trước chuyển phôi”, với mục tiêu sau: Đánh giá tính giá trị kỹ thuật NGS sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người tế bào phơi Phân tích kết sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người kỹ thuật NGS tế bào phôi dư thụ tinh ống nghiệm 7 Chương TỔNG QUAN 1.1 Khái niệm sàng lọc di truyền trước chuyển phôi Sàng lọc di truyền trước chuyển phôi (PGS/preimplantation genetic screening) định phôi tạo từ cặp vợ chồng xem bình thường NST nhằm kiểm tra bất thường NST phôi 1.2 Rối loạn nhiễm sắc thể 1.2.1 Đột biến số lượng NST 1.2.2 Đột biến cấu trúc NST 1.3 Các kỹ thuật ứng dụng để sàng lọc rối loạn di truyền trước chuyển phôi 1.3.1 Kỹ thuật FISH 1.3.2 Kỹ thuật QF- PCR 1.3.3 Kỹ thuật Karyolite - BoBs 1.3.4 Kỹ thuật Array- CGH 1.3.5 Kỹ thuật NGS 1.4 Nguyên lý quy trình kỹ thuật NGS 1.5 Tình hình ứng dụng kỹ thuật NGS giới Việt Nam CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các tế bào phôi dư lưu trữ bảo quản trung tâm sàng lọc trước sinh bệnh viện Phụ sản Hà Nội - Tiêu chuẩn lựa chọn: Tế bào phôi dư ngày thứ cặp vợ chồng tình nguyện tham gia vào nghiên cứu - Tiêu chuẩn loại trừ: Các tế bào phôi dư bảo quản lưu trữ không tiêu chuẩn 2.2 Thiết kế nghiên cứu: Mô tả cắt ngang 2.3 Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm sàng lọc trước sinh bệnh viện Phụ sản Hà Nội 2.4 Thời gian nghiên cứu: Từ 11/2016 đến 10/2018 2.5 Cỡ mẫu Độ xác kỹ thuật NGS xác định nhờ so sánh với kết kỹ thuật Array-CGH, coi tiêu chuẩn vàng sàng lọc rối loạn NST trước chuyển phơi Cỡ mẫu tính dựa vào giả thiết tỷ lệ phát rối loạn NST NGS 50% (p1) Array-CGH 60% (p2) từ nghiên cứu trước với mức ý nghĩa 95% lực nghiên cứu 80% Áp dụng công thức: n = Z2(α,β) p1(1 − p1) + p2(1 − p2) (p1 – p2)2 Trong đó: α = 0.05, β = 0.2, p1 = 0.5, p2 = 0.7  n = 387.1 Như số mẫu cần có cho nghiên cứu 387.1, làm tròn 400 9 2.6 Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện 2.7 Biến số, số nghiên cứu công cụ thu thập thông tin  Biến số, số liên quan đến vợ chồng Phương Pháp NC Công cụ Phỏng vấn Bệnh án NC Phỏng vấn Bệnh án NC Phỏng vấn Bệnh án NC Phỏng vấn Bệnh án NC Phỏng vấn Bệnh án NC Phỏng vấn Bệnh án NC Phỏng vấn Bệnh án NC Có người gia đình Phỏng vấn Bệnh án NC Biến số Loại biến Chỉ số (cả vợ chồng) Tuổi Định lượng Định tính Định tính- < 35 tuổi Nghề nghiệp Trình độ học vấn Nơi Vô sinh Tiền sử Tiền sử khác Phơi nhiễ m Gia đình Định tínhĐịnh tính Định tính Định tínhĐịnh tính- > 35 tuổi Viên chức Nơng dân Cơng nhân Khác Tốt nghiệp tiểu học Tốt nghiệp THCS Tốt nghiệp THPT Tốt nghiệp Cao đẳng, Đại học Thành thị Nông thôn Miền núi Vô sinh Vô sinh Sản,Phụ khoa + PARA + Viêm tắc vòi trứng + GEU, cắt vòi trứng Nội, ngoại khoa Rượu bia, thuốc Hóa chất Phóng xạ Khỏe mạnh có dị tật di truyền 10  Các biến số số liên quan đến phôi Biến số Loại biến Chỉ số Phương Công cụ Định lượng ADN sau Định lượng > 20ng Pháp NC Kỹ thuật bước khuếch đại gen ≤ 20ng PCR (Đơn vị: ng) Số mẫu nhiễm vi Định lượng- Nhiễm Kỹ sinh vật ngoại bào Số lượng phôi rối Định lượng Khơng nhiễm + Bình thường PCR Đọc KQ PCR Bệnh án NC loạn Số lượng nhiễm sắc Định lượng + Rối loạn + NST 13 Đọc KQ Bệnh án NC thể rối loạn + 3NST 18 phôi +3NST 21 Số lượng nhiễm sắc Định lượng + Khác RL cấu trúc Đọc KQ Bệnh án NC thể rối loạn cấu RL số lượng Hệ thống máy NGS Array- CGH thuật Kỹ thuật trúc/ số lượng 2.8 Sai số cách khống chế - Sai số q trình thu thập thơng tin Khống chế cách lập bệnh án nghiên cứu chi tiết có giải thích rõ ràng, nghiên cứu viên đào tạo kỹ - Sai số hệ thống trình hoạt động hệ thống máy phân tích Khống chế cách xây dựng quy trình chuẩn, hệ thống máy kiểm soát chất lượng tốt trước phân tích mẫu 2.9 Quản lý phân tích số liệu - Lập bệnh án nghiên cứu, nhập phân tích số liệu phần mềm SPSS 16.0 - Các thuật tốn thống kê: T-test, Khi bình phương… 11 2.10 Vấn đề đạo đức nghiên cứu - Đề tài nghiên cứu tiến hành sau thông qua hội đồng khoa học y đức, chấp thuận lãnh đạo Bệnh viện Phụ sản Hà Nội Trường Đại học Y Hà Nội - Nghiên cứu nhằm phục vụ cho việc nâng cao chất lượng sàng lọc trước chuyển phôi làm tăng tỉ lệ thành công cho thụ tinh ống nghiệm, ngồi khơng có mục đích khác - Các số liệu nghiên cứu trung thực, xác 12 Chương DỰ KIẾN KẾT QUẢ 3.1 Thông tin chung đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Phân bố tuổi vợ chồng Biểu đồ 3.1: Phân bố tuổi vợ/chồng 3.1.2 Phân bố nghề nghiệp vợ chồng Biểu đồ 3.2: Phân bố nghề nghiệp vợ chồng 13 3.1.3 Phân bố nơi Biểu đồ 3.3: Phân bố nơi 3.1.4 Trình độ học vấn Biểu đồ 3.4: Phân bố trình độ học vấn cảu vợ/chồng 14 3.1.5 Tiền sử vô sinh Biểu đồ 3.5: Phân bố tỷ lệ vô sinh 3.1.6 Các yếu tố phơi nhiễm Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ yếu tố phơi nhiễm vợ Biểu đồ 3.7: Yếu tố phơi nhiễm chồng 3.1.7 Nồng độ DNA sau nhân gen Bảng 3.1: Tỷ lệ số mẫu đủ/không đủ lượng DNA sau nhân gen Đủ (> 20 ng) n % Không đủ (< 20 ng) n % Tổng Định lượng DNA sau nhân gen n % 390 100 3.1.8 Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật ngoại bào Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ nhiễm vi sinh vật ngoại bào mẫu 3.2 Dự kiến kết mục tiêu 3.2.1 Tỷ lệ phơi có rối loạn NST theo phương pháp Bảng 3.2: Tỷ lệ phơi có rối loạn NST xác định theo phương pháp Số lượng phơi Phương pháp Có rối loạn NST n % Bình thường n % NGS Array - CGH Tổng n 390 390 % 100 100 3.2.2 Phân bố kiểu rối loạn NST theo phương pháp Bảng 3.3: Phân bố kiểu rối loạn NST theo phương pháp Rối loạn cấu trúc NST NST Rối loạn số lượng NST NST Tổng 15 thường giới tính thường giới tính NGS ArrayCGH 3.3 Dự kiến kết mục tiêu 3.3.1 Kết phân tích kỹ thuật NGS Bảng 3.4: Kết phân tích mẫu thep kỹ thuật NGS Rối loạn cấu trúc NST thườn g n % NST giới tính Bình thườn g Rối loạn số lượng Trisomy Trisomy Trisomy 18 21 13 Tổng NST giới tính 390 100 16 3.3.2 Phân bố số kiểu rối loạn hay gặp theo tuổi vợ Biểu đồ 3.9: Phân bố số kiểu rối loạn NST hay gặp theo tuổi vợ 3.3.3 Phân bố số kiểu rối loạn hay gặp theo tuổi vợ Biểu đồ 3.10: Phân bố số kiểu rối loạn NST hay gặp theo tuổi vợ 17 3.3.4 Liên quan rối loạn NST với nghề nghiệp Bảng 3.5: Liên quan rối loạn NST với nghề nghiệp Viên chức Công nhân Nông dân Tổng Rối loạn số lượng NST Rối loạn cấu trúc NST Bình thường Tổng 390 3.3.5 Liên quan rối loạn NST với nơi Bảng 3.6: Liên quan giứa rối loạn NST với nơi Thành thị Nông thôn Rối loạn số lượng NST Rối loạn cấu trúc NST Bình thường Tổng Tổng 390 3.3.6 Liên quan rối loạn NST với tiển sử vô sinh Bảng 3.7: Liên quan rối loạn NST với tiển sử vô sinh Vô sinh Vô sinh Rối loạn số lượng NST Rối loạn cấu trúc NST Bình thường Tổng Tổng 390 3.3.4 Phân bố rối loạn NST theo tiền sử phơi nhiễm Biểu đồ 3.10: Phân bố rối loạn NST theo tiền sử phơi nhiễm 18 19 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Bàn luận số đặc điểm đối tượng nghiên cứu 4.2 Bàn luận độ xác kỹ thuật NGS sàng lọc 24 NST 4.3 Bàn luận ứng dụng kỹ thuật giải trình tự gen hệ phân tích 24 NST tế bào phơi dư 20 DỰ KIẾN KẾT LUẬN Đánh giá tính giá trị kỹ thuật NGS sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người tế bào phôi Phân tích kết sàng lọc rối loạn 24 nhiễm sắc thể người kỹ thuật NGS tế bào phôi dư thụ tinh ống nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Al-Asmar N., Peinado V., Vera M et al (2012), Chromosomal abnormalities in embryos from couples with a previous aneuploid miscarriage Fertil Steril, 98(1), 145-150 Baart E B., Martini E., Eijkemans M J et al (2007), Milder ovarian stimulation for in-vitro fertilization reduces aneuploidy in the human preimplantation embryo: a randomized controlled trial Hum Reprod, 22(4), 980-988 Balaban B., Yakin K., Urman B et al (2004), Pronuclear morphology predicts embryo development and chromosome constitution Reprod Biomed Online, 8(6), 695-700 Bormann C L., Racowsky C (2013), Is universal application of blastocyst biopsy with comprehensive chromosome screening for embryo selection ready for prime time Fertil Steril, 100(2), 5-6 Chen C K., Shen G Y., Horng S G et al (2003), The relationship of pronuclear stage morphology and chromosome status at cleavage stage J Assist Reprod Genet, 20(10), 413-420 Colls P., Escudero T., Cekleniak N et al (2007), Increased efficiency of preimplantation genetic diagnosis for infertility using "no result rescue" Fertil Steril, 88(1), 53-61 Delhanty J D., Griffin D K., Handyside A H et al (1993), Detection of aneuploidy and chromosomal mosaicism in human embryos during preimplantation sex determination by fluorescent in situ hybridisation, (FISH) Hum Mol Genet, 2(8), 1183-1185 Egozcue S., Blanco J., Vidal F et al (2002), Diploid sperm and the origin of triploidy Hum Reprod, 17(1), 5-7 Fiorentino F., Bono S., Biricik A et al (2014), Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles Hum Reprod, 29(12), 2802-2813 10 Fragouli E., Katz-Jaffe M., Alfarawati S et al (2010), Comprehensive chromosome screening of polar bodies and blastocysts from couples experiencing repeated implantation failure Fertil Steril, 94(3), 875-887 11 Gianaroli L., Magli M C., Ferraretti A P et al (2003), Pronuclear morphology and chromosomal abnormalities as scoring criteria for embryo selection Fertil Steril, 80(2), 341-349 12 Griffin D K., Wilton L J., Handyside A H et al (1992), Dual fluorescent in situ hybridisation for simultaneous detection of X and Y chromosome-specific probes for the sexing of human preimplantation embryonic nucleic Hum Genet, 89(1), 18-22 13 Grochowski D., Wolczynski S., Kuczynski W et al (1999), Good results of milder form of ovarian stimulation in an in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection program Gynecol Endocrinol, 13(5), 297-304 14 Gutierrez-Mateo C., Colls P., Sanchez-Garcia J et al (2011), Validation of microarray comparative genomic hybridization for comprehensive chromosome analysis of embryos Fertil Steril, 95(3), 953-958 15 Hoàng Thị Hương N V T v Đ T H (2014), Ứng dụng kỹ thuật FISH sàng lọc số lệch bội nhiễm sắc thể cho chẩn đoán di truyền tiền làm tổ Tạp chí phụ sản, 12 PHỤ LỤC Bệnh án nghiên cứu  • • • • •  • • • • •  • • • •   Hành Thơng tin vợ Họ tên: Tuổi: Nghề nghiệp: Viên chức Nơi ở: Nơng thơn Trình độ văn hóa: Tiểu học Thơng tin chồng Họ tên: Tuổi: Nghề nghiệp: 1.Viên chức Nơi ở: Nơng thơn Trình độ văn hóa: Tiểu học Tiền sử Sản khoa PARA: Kinh nguyệt: Đều Vô sinh: Vô sinh Bệnh phụ khoa: Bệnh nội/ngoại khoa kèm theo Tiền sử phơi nhiễm: Công nhân Nông dân Thành thị THCS THPT 4.ĐH, CĐ Công nhân Nông dân Thành thị THCS THPT ĐH, CĐ Không Vô sinh Chồng Vợ Hút thuốc Rượu/bia Tiếp xúc hóa chất độc Tiếp xúc phóng xạ  Tiền sử gia đình: Có hay khơng tiền sử rối loạn di truyền, đẻ dị tật Kết sàng lọc 3.1 Lượng DNA sau nhân gen mẫu ( Đơn vị: ng) > 20ng